Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Гнездная алопеция (ГА) – генетически детерминированное органоспецифическое аутоиммунное заболевание, характеризующееся поражением анагеновых волосяных фолликулов, приводящим к временному или стойкому нерубцовому выпадению волос, и в ряде случаев сопровождающееся дистрофическими изменениями ногтевых пластин [5; 8]. Исследование молекулярно-генетических основ ГА с использованием метода всегеномного анализа ассоциаций, позволившее определить ряд однонуклеотидных полиморфных маркеров генов, ассоциированных с этим заболеванием [3; 16], было выполнено на примере жителей Соединенных Штатов Америки европейского происхождения. Вместе с тем имеющиеся существенные генетические различия популяций по генам, ассоциированным с мультифакториальными заболеваниями [4; 7], требуют обязательной репликации ассоциаций на других популяциях [4; 7; 12]. Работ, посвящённых оценке частоты встречаемости генетических маркеров ГА, выявленных по результатам всегеномного анализа ассоциаций, на примере российской популяции в доступной литературе нет.

В этой связи целью работы явился поиск генетических маркеров, ассоциированных с ГА, на основе репликативного анализа ассоциаций однонуклеотидных полиморфизмов, связанных по данным всегеномного исследования с ГА.

Материалы и методы исследования

Для репликативного анализа ассоциаций из международной базы данных Каталога опубликованных геномных ассоциативных исследований Национального института исследований генома человека (США) (The NHGRI-EBI Catalog of published genome-wide association studies) [3] были отобраны восемь однонуклеотидных полиморфизмов генов, ассоциированных по данным всегеномного исследования, с ГА [15]. Они включали следующие однонуклеотидные полиморфизмы: rs9275572 (ген HLA-DQA2), rs9479482 (ген ULBP3, ULBP6), rs1024161 (ген CTLA4, ICOS), rs3118470 (ген IL2RA), rs1701704 (IKZF4), rs7682241 (IL2 – IL21), rs694739 (PRDX5 – CCDC88B), rs10760706 (STX17). Материалом для молекулярно-генетического исследования явились образцы крови 105 взрослых пациентов с ГА и 100 взрослых лиц группы сравнения, не имеющих в личном и семейном анамнезе аутоиммунных заболеваний. Все обследуемые являлись коренными жителями г. Оренбурга. Средний возраст больных ГА и здоровых лиц группы сравнения составил соответственно 29,2±0,98 и 26,7±1,3 (М±m). В группу пациентов вошло 35 мужчин и 65 женщин, в группу сравнения – 39 мужчин и 61 женщина. Диагноз ГА выставлялся в соответствии с классификацией Olsen E. et al. (2004) [14], в основу которой положена стандартизованная оценка выраженности всех клинических признаков ГА: площади выпадения волос на коже волосистой части головы, степени выпадения волос на коже туловища и конечностей и изменений ногтевых пластин. Оценка степени тяжести ГА проводилась с учетом площади поражения волосистой части головы. При площади облысения до 25% диагностировалась легкая степень тяжести болезни, 25-50% - средняя степень тяжести ГА, свыше 50% - тяжелая степень тяжести [1]. Среди включенных в исследование пациентов у 77,1% больных была диагностирована легкая степень тяжести ГА, у 6,7% пациентов – средняя степень тяжести ГА, у 16,2% пациентов – тяжелая ГА.

Генотипирование проводилось методом аллель-специфической гибридизации в формате полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (ТaqMan). Выделение ДНК из лейкоцитов крови проводилось с использованием комплекта реагентов для выделения ДНК «Проба ГС» (ООО «НПО ДНК-Технология»). ПЦР-амплификация ДНК выполнена для определения указанных выше полиморфизмов генов с использованием наборов, разработанных и произведенных научно-производственной компанией «Синтол». Молекулярно-генетическое исследование выполнено на детектирующем амплификаторе DTlite (ООО «НПО ДНК-Технология»). При анализе частот генотипов проводилось тестирование на соответствие наблюдаемого распределения теоретически ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга (РХВ) с использованием интерактивного калькулятора Hardy-Weinberg equilibrium calculator (Online Encyclopedia for Genetic Epidemiology studies) [15]. Статистическая значимость различий в распределении частот аллелей и генотипов рассчитывалась с помощью критерия χ², сила ассоциаций генотипических характеристик обследуемых с фенотипом ГА оценивалась по значению показателя отношения шансов (odds ratio, OR) с расчетом его 95%-ного  доверительного интервала, выполненных с использованием интерактивного калькулятора, размещенного на сервере: http://gen-exp.ru/calculator_or.php. В процедурах статистического анализа критическое значение уровня значимости принималось равным 0,05.

Для выявления лиц с высоким и низким риском развития ГА было выполнено моделирование вероятности наличия ГА в зависимости от генотипа обследуемого человека с помощью логистического регрессионного анализа. Для выполнения анализа было сформировано по две бинарные переменные для каждого из восьми полиморфизмов генов с учетом трех возможных генотипов (гомозиготы по частому аллелю, гетерозиготы и гомозиготы по редкому аллелю) путем введения фиктивных переменных [2]. Так были сформированы 16 переменных, позволяющих описать выявленные генотипы и использовать их для построения логит-модели. Вероятность наличия ГА у обследуемых (y) рассчитывалась по формуле (1) бинарной логистической регрессии, имеющей вид:

, (1)

где s – показатель экспоненты, зависящий от генотипа обследуемого,

– вероятность.

В том случае, если вероятность менее 0,5, то обследуемый имел низкий риск развития ГА, если более 0,5 – принадлежал к группе высокого риска развития ГА.

Качество модели оценивалось с помощью псевдокоэффициента детерминации, расчета показателей чувствительности и специфичности, а также ROC-анализа, включающего построение ROC-кривой и расчета площади под ROC-кривой. Количественную интерпретацию ROC-анализа проводили с помощь показателя AUC (area under curve, численное значение клинической значимости диагностического теста). Согласно экспертной шкале для значений AUC показатель в пределах 0,5–0,6 свидетельствует о неудовлетворительном качестве диагностического теста, в пределах 0,6–0,7 – о среднем качестве диагностического теста, в пределах 0,7–0,8 – о хорошем качестве диагностического теста, в пределах 0,8–0,9 – очень хорошем, 0,9–1,0 – отличном качестве диагностического теста [6].

Результаты исследования и их обсуждение

Анализ данных таблицы 1 показал, что распределение генотипов rs9275572 гена HLA-DQA2 как у здоровых пробандов группы сравнения, так и у пациентов с ГА не соответствовало РХВ. Кроме того, у пациентов с ГА распределение генотипов rs1701704 гена IKZF4 и rs10760706 гена STX17 также отклонялось от РХВ.

Таблица 1

Распределение частот аллелей у пациентов с гнездной алопецией и в группе сравнения

Примечание. РА – рисковый аллель; * - частый аллель является рисковым; 11 – гомозиготы по частому аллелю, 12 – гетерозиготы, 22 – гомозиготы по редкому аллелю; р-уровень – достигнутый уровень значимости критерия χ2 для оценки соответствия наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому при РХВ; ** - несоответствие РХВ.

Среди причин несоответствия РХВ могут быть ошибки генотипирования [9], популяционная стратификация или ассоциация с заболеванием [10]. Последнее может быть возможным объяснением отклонения от РХВ генотипов rs1701704 гена IKZF4 и rs10760706 гена STX17 в группе пациентов. Вместе с тем вероятной причиной несоответствия РХВ распределения генотипов rs9275572 гена HLA-DQA2 у пробандов обеих групп исследования могут быть ошибки генотипирования, что явилось основанием для исключения полиморфного маркера гена HLA-DQA2 из дальнейшего анализа.

Моделью для поиска ассоциации между генотипом и фенотипом была выбрана общая генетическая модель наследования [13], которая не требует соблюдения РХВ в исследуемых выборках [13]. Анализ данных таблицы 2, описывающих общую генетическую модель ГА, свидетельствует об ассоциации однонуклеотидных полиморфизмов rs1024161 гена CTLA4 (χ2=13,74; p=0,001), rs694739 гена PRDX5 (χ2=6,47; p=0,04), rs1701704 гена IKZF4 (χ2=20,66; p=0,00003), rs10760706 гена STX17 (χ2=16,82; p=0,0002) с фенотипом ГА.

Таблица 2

Общая генетическая модель гнездной алопеции

Примечание. * - по данным всегеномного анализа ассоциаций рисковым является частый аллель; ** - статистическая значимость различий p<0,01; OR – отношение шансов; 95%ДИ – 95% доверительный интервал.

Установлено, что генотип G/G однонуклеотидного полиморфизма rs10760706 гена STX17 у пациентов встречался в 5,1 раза чаще, чем у здоровых лиц (OR=6,58; 95% ДИ 2,42 – 17,88). Среди пациентов с ГА носительство гомозиготы А/А полиморфного маркера rs1024161 гена CTLA4 было в 2,9 раза больше, чем среди здоровых пробандов (OR=3,87; 95% ДИ 1,38 – 8,19). У пациентов, страдающих ГА, частота носительства гомозиготы по частому аллелю А однонуклеотидного полиморфизма rs694739 гена PRDX5 была в 1,4 раза выше, чем у лиц группы сравнения (OR=2,01; 95% ДИ 1,15 – 3,50). Носительство генотипов G/A и G/G полиморфного маркера rs1701704 гена IKZF4 у пациентов в 1,7 и 1,3 раза соответственно было выше, чем у здоровых пробандов (OR=1,50; 95% ДИ 0,86 – 2,64 и OR=1,29; 95% ДИ 0,59–2,82 соответственно). В настоящем исследовании не подтверждены ассоциации ГА с однонуклеотидными полиморфизмами rs9479482 гена ULBP3/ULBP6, rs7682241 гена IL2/IL21 и rs3118470 гена IL2RA, ранее установленные методом всегеномного анализа ассоциаций в качестве маркеров ГА. Это может объясняться как относительно малой численностью исследуемых групп, так и особенностями исследуемой популяции в отношении ассоциаций ген – признак [11].

Результаты проведения логистического регрессионного анализа с пошаговым исключением наименее значимых признаков представлены в таблице 3.

Таблица 3

Логит-модель для определения вероятности развития гнездной алопеции на основании 6 показателей, характеризующих генотипы участников исследования

Примечание. ¹Подстрочный индекс (1) обозначает бинарную переменную, определяющую признак гетерозиготности/гомозиготности, подстрочный индекс (2) – признак гомозиготы по частому аллелю/гомозиготы по редкому аллелю. Коэффициент значим на уровне: p<0,05 (*); p<0,01 (**); p<0,001 (***).

Построенная логит-модель характеризуется значением статистики Вальда Wald chi2(6), равным 51,96, соответствующим p-значению <0,0001 и коэффициентом детерминации Pseudo R², равным 0,2153, что подтверждает статистическую значимость представленной модели.

Математическая модель определения вероятности развития ГА, построенная на основе логит-модели, описана формулой 2:

, (2)

где s – показатель экспоненты,

–0,87 – свободный член, не имеющий клинической интерпретации,

х₁ – признак гомозиготы по частому аллелю/гомозиготы по редкому аллелю полиморфизма гена CTLA4,

х₂ – признак гетерозиготности/гомозиготности полиморфизма гена PRDX5,

х₃ – признак гомозиготы по редкому аллелю/гомозиготы по частому аллелю полиморфизма гена PRDX5,

х₄ – признак гетерозиготности/гомозиготности полиморфизма гена IKZF4,

х₅ – признак гомозиготы по редкому аллелю/гомозиготы по частому аллелю полиморфизма гена IKZF4,

х₆ – признак гомозиготы по редкому аллелю/гомозиготы по частому аллелю полиморфизма гена STX17.

Анализ полученной логит-модели свидетельствует о том, что значимое влияние на возникновение ГА оказывают полиморфизм rs1024161 гена CTLA4, полиморфизм rs694739 гена PRDX5, полиморфизм rs1701704 гена IKZF4 и полиморфизм rs10760706 гена STX17. По знакам коэффициентов логистической регрессии можно сделать вывод о том, что увеличению вероятности развития заболевания способствуют гомозигота по редкому аллелю полиморфизма rs1024161 гена CTLA4, гетерозигота и гомозигота по редкому аллелю полиморфизма rs1701704 гена IKZF4, гомозигота по редкому аллелю полиморфизма  rs10760706 гена STX17. Напротив, гетерозигота и гомозигота по редкому аллелю полиморфизма  rs694739 гена PRDX5 способствуют снижению вероятности развития ГА.

Представленная логит-модель корректно распознала состояние 71,22% обследуемых. Чувствительность модели, рассчитанная как отношение истинно положительных результатов к общему количеству пациентов, составила 70,48%. Специфичность, являющаяся отношением истинно отрицательных результатов к числу лиц группы сравнения, равна 72,0%. Показатель площади под ROC-кривой AUC (Area Under Curve) составил  0,7831. Согласно экспертной шкале для значений AUC интервал от 0,7 до 0,8 соответствует хорошему качеству модели [6].

Для апробации предсказательной способности логистической регрессионной модели проведено исследование на примере генотипа пациента, включенного в настоящее исследование (табл. 4).

Таблица 4

Пример. Генотип пациента 28 лет, страдающего очаговой формой гнездной алопеции

Примечание. * - рисковым является частый аллель.

Для расчета вероятности развития ГА выявленные у обследуемого генотипы были приведены в соответствие бинарным переменным по описанному выше алгоритму, и путем подставления значения переменных в уравнение (1) был рассчитан показатель экспоненты:

.

.

Расчетное значение экспоненты exp(s) составило 42,52. Вероятность , вычисленная по формуле 1, составила 0,98. С учетом полученного значения вероятности обследуемый относится к группе риска по развитию ГА.

Таким образом, проведенный на примере российской популяции репликативный анализ ассоциаций подтвердил ассоциацию с фенотипом гнездной алопеции полиморфных маркеров rs1024161 гена CTLA4, rs694739 гена PRDX5, rs1701704 гена IKZF4 и rs10760706 гена STX17. Полученные данные, с использованием предложенного на основе логистического регрессионного анализа алгоритма, позволяют проводить персонифицированную оценку риска развития гнездной алопеции.