Оценка состояния среды в районе горнодобывающих предприятий и проведение мероприятий по снижению эффектов антропогенного воздействия на биосистемы является одним из направлений исследований в области биомониторинга и геоэкологии. Горно-обогатительные предприятия оказывают влияние на окружающую среду в целом и на водные ресурсы как основной компонент биосистем. Сброс неочищенных техногенных стоков на поверхность почвы приводит к накоплению в окружающих водных объектах тяжелых металлов (медь, цинк, железо, марганец многие другие), которые обладают общетоксичными и мутагенными свойствами [12].
Традиционные способы оценки качества воды путем физико-химических анализов сложны и дорогостоящи. Кроме того, следует учитывать, что генотоксические вещества действуют на живые организмы не изолированно, а в разных сочетаниях и концентрациях компонентов. Поэтому решение сложной проблемы определения суммарного действия присутствующих в воде мутагенов и промутагенов на биоту целесообразно путем биоиндикации с использованием морфогенетического и цитогенетического подходов [17].
Одной из наиболее информативных характеристик развития организма является стабильность онтогенеза, которая обусловлена факторами внешней среды и генетически детерминирована. Оценить данный параметр можно по уровню флуктуирующей асимметрии, представляющей собой незначительные, ненаправленные отклонения от строгой симметрии [6]. Работы по определению флуктуирующей асимметрии, выполненные на разных объектах [5, 13, 20, 22], показали, что наиболее высокий уровень флуктуирующей асимметрии характерен для популяций, обитающих в условиях сильного загрязнения среды, наиболее низкий – для контрольных «чистых» популяций.
Другим показателем состояния организма является цитогенетический гомеостаз, который можно охарактеризовать с использованием микроядерного теста. В настоящее время микроядерный анализ широко используется для оценки уровня загрязненности окружающей среды мутагенами. Данный подход позволяет улавливать изменения в природных популяциях и прогнозировать их последствия [4]. К преимуществам микроядерного теста относятся быстрота, дешевизна, простота, независимость от кариотипа [11].
Перспективным объектом биоиндикационных исследований считаются лягушки [1, 9, 16, 19, 21], которые выступают связующим звеном между водными и наземными экосистемами и могут выступать индикаторами состояния соответствующей местности в целом.
В связи с вышеизложенным, целью исследования стала оценка гомеостаза развития прудовой лягушки (Ranalessonae Camerano) с использованием морфогенетического и цитогенетического подходов в районе крупного горнодобывающего предприятия (Павловского горно-обогатительного комбината).
Материалы и методы
Исследования были выполнены в Павловском районе Воронежской области вблизи Павловского горно-обогатительного комбината в трех водоемах: Малоказинском водохранилище, пруду в с. Гаврильск и пруду в с. Каменск. Все водоемы расположены вдоль реки Гаврило (рис. 1).
Рис. 1. Схема расположения мест проведения исследований: 1 – Малоказинское водохранилище, 2 – пруд в с. Гаврильск, 3 – пруд в с. Каменск
Павловский гранитный карьер расположен в Павловском районе Воронежской области (с. Шкурлат). В карьере ведутся работы по добыче гранитного сырья Шкурлатовского месторождения. Карьер представляет собой горнодобывающее предприятие по добыче блоков гранита с последующей их переработкой на щебень, распиловкой на плиты с частичной полировкой последних. Способ добычи гранитного сырья – скважинно-шпуровой с применением взрывных работ.
В структурно-тектоническом отношении Шкурлатовское месторождение расположено в пределах Павловско-Стрелицкого краевого поднятия докембрийского фундамента платформы, сложенного в основном мигматит-гранит-сиенитовым интрузивным комплексом раннепротерозойского возраста. Основными породообразующими минералами комплекса являются: роговая обманка, кварц, калиевый полевой шпат, плагиоклаз (олигоклаз), биотит, мусковит, присутствуют циркон, гранат, магнетит, сфен, апатит, турмалин и другие минералы [18].
Определение качества воды было проведены санитарно-эпидемиологической службой г. Павловска Воронежской области. Тяжелые металлы и плавающие примеси ни в одном из водоемов выявлены не были.
Оценку стабильности развития проводили по уровню флуктуирующей асимметрии согласно рекомендациям [7].
Цитогенетический анализ оценивали по количеству эритроцитов с микроядрами. Для изготовления препаратов крови лягушек декапитировали, разрезали кожу с брюшной стороны, осуществляли забор крови из сердца с помощью шприца. Каплю крови наносили на сухое чистое предметное стекло и готовили мазок. Затем препараты высушивали на воздухе несколько минут. Сухие препараты окрашивались раствором красителя Гимза 1:5 в течение 20 мин. Затем препараты накрывали покровными стеклами и просматривали на микроскопе «МИКМЕД-6». На каждом препарате просматривали не менее 1000 клеток.
Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета статистических программ «Stadia». Процедура группировки данных и их обработка изложены в работе [10]. Сравнение особей из трех водоемов по уровню клеток с микроядрами осуществляли с использованием непараметрических Х–критерия Ван-дер-Вардена и критерия Вилкоксона, по величине флуктуирующей асимметрии – по t-критерию Стьюдента.
Результаты исследований и их обсуждение
Величина флуктуирующей асимметрии у прудовой лягушки (Ranalessonae), обитающей в водоемах Павловского района, представлена в таблице 1.
Таблица 1
Величина флуктуирующей асимметрии билатеральных морфологических признаков лягушки прудовой (Ranalessonae Camerano)
|
Водоем |
самцы |
самки |
|
Малоказинское водохранилище |
0,30±0,04 |
0,30±0,04 |
|
пруд с. Гаврильск |
0,40±0,06 |
0,30±0,04 |
|
пруд с. Каменск |
0,30±0,03 |
0,30±0,03 |
Согласно пятибалльной шкале оценки отклонений организма от условной нормы по величине интегрального показателя стабильности развития для земноводных Захарова В.М., качество среды в обследованных водоемах соответствует 1 баллу (условно нормальное).
В результате проведенных исследований нами было выявлено, согласно классификации, предложенной Жулевой и Дубининой [4], 5 типов клеток с микроядрами: стандартного типа, прикрепленного типа, неоформленные в виде «палочек», неоформленные в виде клубочков и округлые образования большого размера (рис. 2).
Рис. 2. Типы микроядер, выявляемые в крови прудовой лягушки (Ranalessonae), обитающей в водоемах Павловского района
Анализ частоты встречаемости клеток с микроядрами выявил наибольшую частоту нарушений у лягушек, обитающих в Малоказинском водохранилище и водоеме с. Гаврильск, по сравнению с лягушками, обитающими в водоеме с. Каменск (P< 0,05) (табл. 2).
Таблица 2
Частота встречаемости аберрантных клеток в крови прудовой лягушки (Ranalessonae), обитающей в водоемах Павловского района
|
Исследуемый водоем |
Пол особи |
Общее количество аберрантных клеток, ‰ |
Типы аберрантных клеток, ‰ |
||||
|
Микроядра стандартного типа |
Микроядра прикрепленного типа |
Микроядра в виде «палочек» |
Микроядра в виде «клубочков» |
Неоформленный ядерный материал |
|||
|
Малоказинское водохранилище |
самец |
6,7±0,6** |
4,7±0,5*** |
1,1±0,3 |
0,4±0,2 |
0,4±0,2 |
0,2±0,1 |
|
самка |
4,6±0,5 |
1,9±0,3 |
1,4±0,2 |
0,3±0,1 |
0,5±0,2 |
0,5±0,2 |
|
|
общее |
5,7±0,4 |
3,3±0,4а |
1,3±0,2 |
0,3±0,1 |
0,4±0,1 |
0,4±0,1 |
|
|
пруд с. Гаврильск |
самец |
4,7±0,7 |
2,2±0,5 |
1,5±0,4 |
0,4±0,1 |
1,2±0,8 |
0,3±0,1 |
|
самка |
6,3±0,8 |
2,7±0,3 |
1,9±0,5 |
0,6±0,2 |
0,5±0,2 |
0,4±0,2 |
|
|
общее |
5,5±0,6 |
2,5±0,3а |
1,7±0,3 |
0,3±0,1 |
0,8±0,4 |
0,4±0,1 |
|
|
пруд с. Каменск |
самец |
4,8±0,6 |
2,6±0,5*** |
1,1±0,4 |
0,4±0,2 |
0,5±0,2 |
0,3±0,1 |
|
самка |
4,7±0,5 |
1,1±0,4 |
1,7±0,3 |
0,3±0,1 |
0,4±0,1 |
0,5±0,1 |
|
|
общее |
4,8±0,4 |
2,2±0,4 |
1,4±0,3 |
0,4±0,2 |
0,4±0,1 |
0,4±0,1 |
|
Обозначения: *** – различия с самками, обитающими в том же водоеме, достоверны, P<0,05, ** – различия с самками, обитающими в том же водоеме, достоверны, P<0,01, а – различия с особями, обитающими в пруду с. Каменск, достоверны, P<0,05.
Анализ частоты встречаемости эритроцитов со стандартными микроядрами совпадает с результатами, полученными при анализе общего числа нарушений. Из всех типов микроядер они являются преобладающими. По мнению Л.Ю. Жулевой и Н.П. Дубинина, наличие в клетках периферической крови озерной лягушки микроядер стандартного типа является естественным, тогда как наличие в клетках микроядер других видов является результатом цитогенетического нарушения, произошедшего в организме под действием загрязненности окружающей среды мутагенами [4]. В то же время рядом авторов установлено, что у прудовой лягушки в г. Нижнем Новгороде преобладают микроядра прикрепленного типа [14, 15]. Преобладание клеток с микроядрами прикрепленного вида в крови зеленых лягушек свидетельствует о нарушениях цитогенетического гомеостаза, что связано, по-видимому, с дефектами в структуре хромосом, вызванными мутагенными факторами окружающей среды и воздействием приоритетных загрязнителей водоемов на организм животных [2].
По частоте встречаемости эритроцитов с микроядрами прикрепленного типа, ядерного материала в виде палочек, клубочков, округлых образований большого размера различий между лягушками обследованных водоемов установлено не было. Образование первого типа микроядер обусловлено нарушениями в структуре хромосом, а остальных типов – отставание хромосом в мета- или анафазе митоза [4].
Были выявлены различия между полами у обследованных особей лягушек Малоказинского водохранилища (самцы – 6,7±0,6 ‰; самки – 4,6 ± 0,5 ‰ (различия достоверны (P< 0,01)).
Стоит отметить, что максимальное число клеток с микроядрами наблюдалось у самцов лягушек, обитающих в Малоказинском водохранилище, по сравнению с самцами Гаврильского и Каменского водоемов (Р < 0,05), что свидетельствует об их большей чувствительности к генотоксикантам. Ранее различия между полами по частоте эритроцитов с микроядрами отмечались у прыткой ящерицы [3], перепела японского при промышленном разведении [8] и др.
Частоты встречаемости микроядер в виде палочек, клубочков и образований большого размера не отличаются между водоемами.
На основании проведенных исследований можно сделать следующие выводы:
1. У особей лягушки прудовой (Ranalessone Camerano), обитающих в водоемах Павловского района, уровень флуктуирующей асимметрии билатеральных морфологических признаков составил 0,3, что соответствует 1 баллу по пятибалльной шкале оценки отклонений организма от условной нормы по величине интегрального показателя стабильности развития для земноводных Захарова В.М. Это говорит об условной норме состояния среды обитания [7]. Различия между полами установлены не были.
2. В крови лягушек, отловленных в трех водоемах Павловского района, выявлены эритроциты с микроядрами пяти типов: стандартного (преобладающий тип), прикрепленного, в виде палочек, в виде клубочков и неоформленный ядерный материал большого размера. Наибольшая частота эритроцитов с нарушениями отмечается в Малоказинском водохранилище, что свидетельствует о большей степени его загрязненности по сравнению с другими водоемами.
3. Установлены различия между полами в Малоказинском водохранилище: больше нарушений отмечено у самцов, что говорит об их большей чувствительности к токсикантам внешней среды, чем самок.
4. Показана большая чувствительность к загрязнению окружающей среды цитогенетических показателей по сравнению с флуктуирующей асимметрией.
5. Проведенные исследования являются элементом биомониторинга и отражают состояние среды обитания на живых организмах в водных экосистемах в районах крупных горнодобывающих предприятий.
Исследование выполнено в рамках и при поддержке проекта РФФИ № 16-45-360284 р_а «Мониторинг состояния биотехносферы урбанизированных территорий Воронежской области как фактора устойчивого развития региона».