Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,006

THE CORRELATION OF AEROBIC AND ANAEROBIC VAGINAL MICROFLORA AT DIFFERENT STAGES OF SEXUAL DEVELOPMENT

Uvarova E.V. 1 Kazakova A.V. 2 Artyukh Y.A. 2
1 Federal State Budget Institution «Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology», Ministry of Healthcare of the Russian Federation
2 Samara State Medical University
We have studied the consistent pattern of the compositional alteration of the vaginal biotope in healthy females at the periods of infancy, preadolescence and puberty. We have evaluated vaginal microbiocenosis in 226 girls through the complex quantitative polymerase chain reaction. The girls in the neutral period are found to have the lowest number of aerobic bacteria. The correlation of vaginal bacterial number in girls of different ages showed a firm increase of the presence of aerobic bacteria with aging. In preadolescent girls the number of aerobes multiplied by 6 times (р<0,001), and at the following stage between preadolescence and puberty it further grew by 1,6 (0,008). The contrary alterations were observed in the group of anaerobe bacteria. Maximal anaerobic content in the neutral period was estimated as 92,24±2,19. From the age of 7 till the menarche the anaerobic number reduced by 1,6 times (р<0,002) and the first menstruation was directly followed by their further decrease by 1,8 (р<0,008). Having studied relative and absolute microbiocenosis in girls in various periods of their sexual development we claim that the main changes in the vaginal mictoflora occur in the period of preadolescence.
quantitative polymerase chain reaction (pcr)
vaginal microbiocenosis
stages of sexual development
aerobes
anaerobes
preadolescence
puberty
neutral period

С современных позиций нормальную микрофлору рассматривают как совокупность микробиоценозов, занимающих свои экологические ниши на коже и слизистых оболочках человека. Микроорганизмы, составляющие нормальную микрофлору, состоят между собой в разнообразных взаимоотношениях (нейтрализма, конкуренции, мутуализма, комменсализма, синергизма, паразитизма, синтрофии и др.). Изменение численности того или иного вида микроорганизмов в определенном биотопе или возникновение не свойственного данному месту обитания вида служит сигналом для адаптационных или необратимых изменений в соответствующем звене микроэкологической системы [1, 6].

Состав нормальной микрофлоры половых путей женщин достаточно изучен [1, 6, 8, 9]. Многообразие ее видового соотношения представлено строгими и факультативными анаэробами и в значительно меньшей степени — аэробными и микроаэрофильными микроорганизмами.

Характерными представителями микрофлоры половых путей здоровых женщин являются лактобактерии. Они обеспечивают защитный механизм конкуренции с патогенными микроорганизмами и поддерживают кислую среду во влагалище, создавая неблагоприятные условия для развития патогенной микрофлоры. Кроме лактобактерий, к нормальной микрофлоре влагалища относятся грамположительные палочки: эубактерии и несколько реже – бифидобактерии. Среди анаэробов в женских половых путях чаще всего встречаются три основных вида микроорганизмов: Bacteroides spp., Peptococcus и Peptostreptococcus, а также Clostridium spp. [12, 3]. Анаэробные бактерии наряду с аэробными бактериями являются частицей сложной микроэкологической системы, которая находится в определенном равновесии, содействуя нормальному функционированию половых органов в разные периоды жизни женщины (табл. 1).

Таблица 1

Видовой состав нормальной микрофлоры влагалища (Кира Е.Ф., 2001)

Факультативные микроорганизмы

Анаэробные микроорганизмы

Грамполoжительные кокки

Staphylococcus epidermidis Staphylococcus aureus* Group D Streptococcus b-Hemolytie Streptococcus другие виды стрептококков

Грамположительные палочки

Lactobacillus species* Corinebacterium species

Грамотрицательные палочки

Echerichia coli* Klebsiella species Другие виды семейства Enterobacteriaceae

Грамполoжительные кокки

Peptococcus species*

Peptococcus anaerobius Peptococcus asacharolyticus Peptococcus prevotii* Peptococcus varibilis Peptostreptococcus species* Peptostreptococcus anaerobius Грамотрицательные кокки Veillonella species Acidominococcus fermentas Грамположительные палочки Lactobacillus species* Bifidobacterium species Clostridium species

Eubacterium species Propionacterium species Грамотрицательные палочки Bacteroides melaninogenicus* Bacteroides vulgatus* Bacteroides species* Fusobacterium nucleatum* Fusobacterium species* Leptotrichia species Campylobacter species

Формирование и становление микробиоценоза влагалища в различные периоды жизни женщины неодинаковы и отражают влияние комплекса факторов внутренней и внешней среды.

На данный момент известно, что наиболее часто в качестве представителей аэробной и факультативно анаэробной микрофлоры обнаруживают эпидермальных и сапрофитных стафилококков, реже — кишечную палочку и энтеробактерии, в единичных случаях — бифидобактерии и лактобактерии. У 70% здоровых девочек в состав индигенной микрофлоры влагалища входят бактерии с гемолитическими свойствами. Общее микробное число у девочек от 1 месяца до 7–8 лет жизни составляет от 102 КОЕ/мл до 105 КОЕ/мл [4, 10, 11].

В составе микрофлоры влагалища девочек препубертатного возраста (9–12 лет) вплоть до менархе преобладают анаэробные и микроаэрофильные микроорганизмы: бактероиды, стафилококки, дифтероиды. Отмечают большое количество лактобактерий и молочнокислых стрептококков. В этот период микробиоценоз влагалища относительно стабилен. C момента активации овариальной функции организм девушки синтезирует «собственные», эндогенные эстрогены. Под влиянием эстрогенов клетки эпителия влагалища накапливают гликоген. Это приводит к формированию эстрогенстимулированного эпителия. На поверхности эпителиоцитов влагалища увеличено число рецепторных участков для адгезии лактобактерий, увеличивается толщина эпителиального слоя. С этого момента лактобактерии — доминирующие микроорганизмы микрофлоры влагалища, и в последующем они сохранят это положение на протяжении всего репродуктивного периода. Метаболизм лактобактерий способствует стабильному сдвигу рН среды влагалища в кислую сторону до 3,8–4,5. Общее микробное число составляет 105–107 КОЕ/мл.

Пубертатный, или подростковый, период характеризует ритмичная физиологическая гипертранссудация в виде слизистых выделений. Увеличено количество эпителиальных слоев, а кольпоцитологическая картина приближена к таковой у взрослой женщины. Общее микробное число составляет 105–107 КОЕ/мл. В 60% случаев определяют лактобациллы, среда влагалища становится кислой, рН 4,0–4,5 [4, 10, 11].

На современном этапе много исследований посвящено изучению микроценоза влагалища, но наряду с этим крайне мало данных о видовом соотношении микроорганизмов. Учитывая важность учета количественного состава аэробных и анаэробных сообществ для дифференциальной диагностики патологических состояний в детском возрасте, нами проведено исследование, целью которого стало изучение частоты встречаемости, а также соотношение аэробной, факультативно анаэробной микрофлоры, облигатного сообщества микроорганизмов влагалища и факультативных анаэробов в различные периоды полового созревания.

Задачи

  1. Сформировать группы девочек, участвующих в исследовании, учитывая этапы формирования репродуктивной системы.
  2. Определить микробиологические характеристики влагалища методом комплексной количественной полимеразной цепной реакции с использованием тест-систем «Фемофлор-17» в группах девочек от 0 до 7 лет, от 8 лет до менархе, от менархе до 18 лет.
  3. Выявить закономерности изменения соотношения видового состава влагалищного биотопа у здоровых девочек в периоде детства, препубертата и пубертата.

Материалы и методы исследования

Взятие биоматериала осуществлялось на базе детского поликлинического отделения № 1 ГБУЗ СО СГП № 13 с февраля по август 2015 г., при подписании пациенткой или законным представителем информированного согласия на проведение исследования.

Количество обследованных девочек составило 226 человек, из них девочек от 0 до 7 лет – 74 человека, от 8 лет до менархе – 37, от менархе до 18 лет – 115. Критерии возрастного интервала выбранных групп были обусловлены основными этапами формирования репродуктивной системы.

Критерии включения: здоровые девочки, проходившие профилактический осмотр с отсутствием жалоб, неизмененной слизистой влагалища, а также физиологическими выделениями из половых путей.

Критерии исключения: применение антибактериальных препаратов за месяц до обследования, отсутствие тяжелой экстрагенитальной патологии и наличие острых воспалительных заболеваний на момент осмотра и забора материала.

Исследование состояния влагалищного микробиоценоза проводили при помощи комплексной количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием тест-систем «Фемофлор-17» (производства ООО «НПО ДНК-Технология», Россия).

Материалом для исследования методом комплексной количественной ПЦР у девочек являлся соскоб эпителиальных клеток, который забирался из заднего свода влагалища через гименальное кольцо. Хранение материала осуществлялось при температуре 2–8°С не более 8 ч, далее при температуре –20°С в течение 1 месяца или при температуре –70°С в течение 1 года.

Всего исследовано 226 образцов соскобов отделяемого слизистой влагалища. Спектр диагностируемых показателей включал КВМ (контроль взятия материала), ОБМ (общая бактериальная масса), наличие микоплазм (Mycoplasma hominis, Ureaplasma spp.), дрожжеподобных грибов (Candida spp.);  Lactobacillus spp., (Enterobacterium spp., Streptococcus spp., Staphylococcus spp.), (Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp., Eubacterium spp., Sneathia spp./Leptotrichia spp./Fusobacterium spp., Megasphaera spp./Veillonella spp./Dialister spp., Lachnobacterium spp./Clostridium spp., Mobiluncus spp./Corinebacterium spp., Peptostreptococcus spp., Atopobium vaginae), а также идентификацию патогенов (Mycoplasma genitalium).

Заключение по результатам диагностического теста Real-Time PCR получали в виде диаграммы, которая описывала вид микробной флоры влагалища.

Рассчитывали абсолютные (в логарифмах полученных показателей бактериальной массы условно-патогенного организма Lg10УПМ) и относительные показатели (разница логарифмов полученных показателей общей бактериальной массы условно-патогенного организма (УПМ) и общей бактериальной массы (ОБМ) — Lg10УПМ – Lg10ОБМ). Оценку наличия Candida spp., Mycoplasma hominis, Ureaplasma spp., Mycoplasma genitalium проводили только в абсолютных показателях.

При оценке состава условно-патогенной флоры учитывалось не только ее присутствие, но и количество по отношению к общей бактериальной массе (ОБМ). Также определялось количество лактобактерий по отношению к общей бактериальной массе.

Статистическая обработка данных проводилась с использованием компьютерного программного пакета (Microsoft Office Excel 2007).

Результаты исследования                                                                                          

Проанализировав частоту встречаемости и количественное содержание аэробной и факультативно анаэробной микрофлоры, облигатного сообщества микроорганизмов влагалища и факультативных анаэробов, мы определили, что у девочек нейтрального возраста микрофлора влагалища характеризуется преобладанием облигатных анаэробов (табл. 2), Lg10 которых соответствует 5,87±0,13. Относительное содержание  данной группы микроорганизмов в этом возрастном периоде 92,24±2,19. Аэробы и факультативные анаэробы встречаются в микроценозе влагалища в 71,6% случаев. Относительное содержание незначительное и составляет 7,32±2,17.

Таблица 2

Соотношения видового состава микрофлоры девочек нейтрального возраста

Микроорганизм

n

%

Абсолютное содержание

M±m

Относительное содержание

M±m

Аэробы, факультативные анаэробы

53

 71,60%

4,10±0,11

7,32±2,17

Облигатные анаэробы

72

 97,30%

5,87±0,13

92,24±2,19

Факультативные анаэробы

50

 67,60%

4,11±0,11

6,31±2,01

 

В препубертатном периоде происходит увеличение встречаемости и количества аэробов и факультативных анаэробов (табл. 3), тогда как встречаемость и количество анаэробной микрофлоры не меняются. При этом относительное содержание абсолютных анаэробов снижается от 92,24±2,19 до 56,50±7,76.

Таблица 3

Соотношения видового состава микрофлоры девочек в препубертатном периоде

Микроорганизм

n

%

Абсолютное содержание

M±m

Относительное содержание

M±m

Аэробы, факультативные анаэробы

34

 91,90%

5,34±0,32

42,71±7,65

Облигатные анаэробы

36

 97,30%

5,37±0,26

56,50±7,76

Факультативные анаэробы

24

 64,90%

3,91±0,15

7,91±3,57

 

С менархе у девочек в составе микроценоза влагалища происходит увеличение встречаемости аэробной и анаэробной микрофлоры (табл. 4). Количество аэробной микрофлоры увеличивается с 5,34±0,32 в препубертатном периоде до 7,10±0,13 с началом менструальной функции. Относительное содержание групп микроорганизмов меняется в сторону преобладания аэробных микроорганизмов 68,43±3,83.

Таблица 4

Соотношения видового состава микрофлоры девочек в пубертатном периоде

Микроорганизм

n

%

Абсолютное содержание

M±m

Относительное содержание

M±m

Аэробы, факультативные анаэробы

111

96,50%

7,10±0,13

68,43±3,83

Облигатные анаэробы

113

98,30%

5,90±0,14

30,68±3,78

Факультативные анаэробы

77

76,00%

4,35±0,13

3,03±1,24

 

Сравнительный анализ абсолютного и относительного содержания микроорганизмов и соотношение долей во влагалище девочек разной возрастной группы представлены в таблице  5.

Достоверные различия в абсолютном содержании аэробов во влагалищном биоценозе выявлены среди всех групп обследованных. Так, у девочек нейтрального периода самое низкое содержание аэробов (4,10±0,11), тогда как в препубертатном периоде эти значения возрастают до 5,34±0,32 (р<0,001), а в периоде пубертата аэробные микроорганизмы увеличиваются относительно препубертатного возраста до 7,10±0,13 (р<0,001).

Относительное содержание микробов во влагалище девочек разных возрастов показало, что с периодом взросления происходит достоверное увеличение содержание аэробов. В 6 раз увеличивается содержание аэробов у девочек препубертатного периода (р<0,001), в 1,6 раза происходит увеличение количества между препубертатным и пубертатным периодом (0,008).

Обратные изменения прослеживаются в группе анаэробов. В нейтральном периоде максимальное содержание анаэробов 92,24±2,19. В возрасте 7 лет и до менархе количество анаэробов снижается в 1,6 раза (р<0,002), и с наступлением первой менструации происходит снижение микроорганизмов еще в 1,8 раза (р<0,008).

Таблица 5

Сравнительный анализ абсолютного и относительного содержания микроорганизмов и соотношение долей во влагалище девочек разной возрастной группы

 

Аэробы + факультативные анаэробы

Облигатные анаэробы

Факультативные анаэробы

Абсолютное содержание микроорганизмов

Нейтральный период

4,10±0,11

5,87±0,13

4,11±0,11

Препубертат

5,34±0,32

5,37±0,26

3,91±0,15

Пубертат

7,10±0,13

5,90±0,14

4,35±0,13

Различия абсолютного содержания

р1-2

<0,001

0,167

0,402

р1-3

<0,001

0,962

0,741

р2-3

<0,001

0,146

0,292

Относительное содержание микроорганизмов

Нейтральный период

7,32±2,17

92,24±2,19

6,31±2,01

Препубертат

42,71±7,65

56,50±7,76

7,91±3,57

Пубертат

68,43±3,83

30,68±3,78

3,03±1,24

Различия относительного содержания

р1-2

0,001

0,002

0,285

р1-3

<0,001

<0,001

0,001

р2-3

0,008

0,008

0,171

Содержание микроорганизмов в долях

Нейтральный период

71,60%

97,30%

67,60%

Препубертат

91,90%

97,30%

64,90%

Пубертат

96,50%

98,30%

76,00%

Различия содержания долей

р1-2

0,028

<0,001

0,478

р1-3

0,535

0,959

0,763

р2-3

0,943

0,272

0,265

 

Изучив относительное и абсолютное содержание сообществ микроорганизмов у девочек в различные периоды полового развития, необходимо подчеркнуть, что основные изменения микробиоты влагалища происходят в препубертатном периоде. Можно предположить, что это связано с началом функционирования гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы.