Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

APOLIPOPROTEIN A-I AS CARRIER ANTICANCER DRUGS DOXORUBICIN AND MELPHALAN

Knyazev R.A. 1 Trifonova N.V. 1 Polyakov L.M. 1
1 Federal State Budgetary Sientific Institution Research Institute of Biochemistry
The research is aimed at solving problems related to the development of transport forms of anticancer drugs. Methods of fluorescence quenching, and gel filtration is shown that apolipoprotein A-I has the ability to form stable complexes with doxorubicin and melphalan. The values obtained association constants of complexes of apolipoprotein A-I preparations with the test confirmed the possibility of using them as vehicles forms tumor cells. The calculated quantity of molecules of anticancer drugs related to 1 molecule of complexing agent is a wide range of regulatory cytostatic dosage. Using the fluorescent marker (FITC) demonstrated the ability of apo A-I with these drugs to penetrate into cytoplasm and nucleus of cells of Ehrlich ascites carcinoma. The results suggest the real possibility of using apolipoprotein A-I as a transport form of doxorubicin and melphalan.
apolipoprotein A-I
transport forms of anticancer drugs
Ehrlich ascites carcinoma
chemotherapy
doxorubicin
melphalan

Создание новых, высокоэффективных транспортных форм лекарственных препаратов — задача актуальная. Особенно это востребовано в лечении онкологических заболеваний, где достижение необходимого терапевтического эффекта всегда сопряжено с использованием высоких доз препаратов и, как следствие, токсическим действием на органы и функциональные системы организма [8]. Выбор транспортной системы имеет большое значение, так как это существенно влияет на фармакокинетику и фармакодинамику препаратов [9].

В литературе широко представлены работы по созданию систем доставки лекарственных средств, в том числе полимерные наночастицы, липосомы, вирусные наночастицы, переносчики на основе металлоорганических соединений [4, 5]. Анализ состояния исследований в данной области указывает на использование в качестве перспективного переносчика биологически активных соединений, в том числе лекарственных препаратов, основного белкового компонента липопротеинов высокой плотности – аполипопротеина А-I (апоА-I). Являясь веществом амфифильной природы, апоА-I способен связывать и транспортировать как жирорастворимые [3], так и водорастворимые соединения [11]. В работах Kreuter J. et al. и Wohlfart S. et al. показана ключевая роль апоА-I в составе наночастиц при транспорте лекарственных препаратов через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). Механизм поглощения этих частиц связывают с наличием скевенджер рецепторов класса В типа I (SR-BI) на поверхности эндотелиальных клеток головного мозга [13]. Ранее нами была показана способность апоА-I образовывать устойчивые комплексы с противоопухолевыми препаратами — актиномицином Д, винбластином. Рассчитаны качественные и количественные характеристики этого взаимодействия. Показана возможность препаратов в составе комплексов проникать в опухолевые клетки [1].

Целью данной работы является исследование способности аполипопротеина А-I выступать в качестве транспортного средства противоопухолевых препаратов доксорубицина и мелфалана.

Материалы и методы

Аполипопротеин А-I выделяли из фракции липопротеинов высокой плотности (ЛПВП). Делипидирование проводили охлажденной смесью хлороформ—метанол (1:1) из расчета 20 мл смеси на 1 мл ЛПВП с последующей многократной отмывкой эфиром. Для получения апоА-I суммарные белки ЛПВП в растворе 3% Ds-Na и 0,1%-ного меркаптоэтанола наносили на колонку (1,6 х 100 см) с Сефарозой 6В-CL («Pharmacia», Швеция) и элюировали 5 мМ Трис-НСl буфером, рН 8,6, содержащим 6 М мочевину, 0,01% азид натрия и 1 мМ фенилметансульфонилфторид. Скорость потока — 10 мл/ч, скорость самописца – 9 мм/ч. Профиль элюции регистрировали на УФ-детекторе 2151 «LKB» (Швеция) при длине волны 280 нм. Проверка чистоты апоА-I осуществлялась с помощью электрофореза в 10% ПААГ с Ds-Na. Белковые полосы визуализировали 0,1% Кумасси G-250 в смеси метанола и 10% уксусной кислоты (1:1). В качестве маркеров использовали набор низкомолекулярных белков-стандартов (фосфорилаза — 94 кДа, альбумин — 67 кДа, овальбумин — 43 кДа, карбоангидраза — 30 кДа и лактальбумин — 14,4 кДа) [10].

Обессоливание апоА-I проводили методом гель-фильтрации (колонка: 40 ´ 0,8 см, Сефадекс G-25 («Pharmacia», Швеция), элюент: 5мМ трис-НСl буфер, рН 7,4, содержащий 0,15 М NaCl, скорость элюции – 30 мл/ч, скорость самописца – 9 см/ч). Профиль элюции регистрировали на УФ-детекторе при длине волны 280 нм. Концентрация обессоленного белка составляла 0,2 мг/мл.

Изучение спектров поглощения противоопухолевых препаратов в оптической области электромагнитного излучения проводили на спектрофотометре Evolution 300 (Thermo Fisher Scientific, США).

В работе использовали 1 мМ маточные растворы доксорубицина и мелфалана (AppliChem, Германия). Взаимодействие апоА-I с противоопухолевыми препаратами изучали методом спектрофлуориметрии при длине волны возбуждения 285 нм и эмиссии в диапазоне от 300 до 450 нм (Шиматзу) [7]. Титрование проводили добавлением аликвот противоопухолевого препарата (по 10 мкл) к 2 мл апоА-I. Расчет константы связывания осуществляли по методу Аттала и Лата [6].

Для подтверждения возможности попадания комплекса апоА-I—цитостатик в опухолевые клетки использовали флуоресцентный маркер – флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ). АпоА-I метили 1%-ным раствором ФИТЦ в 0,1 М Na2HP04. Процесс конъюгации проводили при 4ºС в течение 18 ч в 0,1 М бикарбонатном буфере (рН 9,0) и в молярном соотношении белок/краситель 10/1 [12]. От свободной метки освобождались методом гель-фильтрации. Эксперименты проводили на клетках асцитной карциномы Эрлиха. Выделение клеток из перитонеального экссудата проводили на 10-й день после перевивания. Под легким эфирным наркозом мышей забивали с помощью дислокации шейных позвонков, вскрывали брюшную полость в нижнем латеральном отделе. Собирали перитонеальный экссудат и вносили в центрифужные пробирки. Центрифугировали в течение 10 мин при 150g для осаждения клеточных элементов. Осадок клеток трижды промывали большими объемами холодного раствора Рингера—Кребса. Подсчет клеток проводили в камере Горяева. Жизнеспособность клеток оценивали по исключению трипанового синего [13].

Эксперименты на лабораторных животных проводили в соответствии с «Правилами работ с использованием экспериментальных животных» (приказ Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 № 755 и приложение к приказу № 565 от 04.10.1977), с соблюдением принципов Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (2000). Животные содержались на стандартной диете и имели свободный доступ к воде. Представленная работа одобрена комитетом по биоэтике НИИ биохимии.

Полученные данные подвергали статистическому анализу с использованием программы StatPlus 2009 Professional 5.8.4., (США). Статистическую значимость полученных результатов оценивали с помощью t-критерия Стьюдента при уровне значимости p<0,05.

Результаты и обсуждение

Метод тушения триптофановой флуоресценции позволяет адекватно оценить способность белковой молекулы взаимодействовать с веществами небелковой природы. При этом можно зарегистрировать не только факт образования комплекса, но и возможные конформационные изменения белка [10]. Анализ спектров аполипопротеина А-I (апоА-I) с исследуемыми препаратами показал снижение триптофановой флуоресценции для доксорубицина – 89%, для мелфалана – 97%. Снижение флуоресценции можно охарактеризовать как результат образования комплекса апоА-I—противоопухолевый препарат [11]. На рисунке 1 представлены кривые тушения для комплекса с доксорубицином.

Рис. 1. Изменение спектров триптофановой флуоресценции аполипопротеина А-I при образовании комплекса с доксорубицином

На рисунке видны кривые тушения собственно аполипопротеина А-I , а также снижение интенсивности флуоресценции при добавлении равных аликвот доксорубицина. Похожий график был получен для аполипопротеина А-I с мелфаланом. Изучение временной зависимости тушения флуоресценции при одномоментном добавлении насыщающих количеств препаратов показало, что полное связывание комплексообразующих областей апоА-I наблюдалось уже через 15 мин от начала титрования. Аналогичная картина была получена для комплекса аполипопротеина А-I с мелфаланом. На основании кривых тушения флуоресценции были рассчитаны константы ассоциации при взаимодействии апоА-I с доксорубицином и мелфаланом. Расчетные величины составили 7±0,2 х 105 М-1 и 6,3±0,35 х 106 М-1 соответственно. Было определено количество молекул связанных лигандов на 1 молекулу комплексообразователя. Для апоА-I-доксорубицин – это 27 молекул доксорубицина, а для апоА-I-мелфалан – 48 молекул мелфалана на 1 молекулу апоА-I.

Для подтверждения процесса комплексообразования, а также оценки устойчивости комплекса апоА-I—цитостатик мы использовали метод гельфильтрации на сефадексе G-25. Предварительно мы просканировали исследуемые противоопухолевые препараты на спектрофотометре Evolution 300 для измерения спектров поглощения этих соединений в оптической области электромагнитного излучения. Концентрации препаратов были подобраны экспериментально, с учетом разрешающей способности прибора. Для доксорубицина были определены два максимума поглощения на длинах волн 288 нм и 447 нм. Для мелфалана также были определены два максимума поглощения на длинах волн 264 нм и 343 нм (рис. 2).

Рис. 2. Данные сканирующей спектрофотометрии.

Спектры поглощения А — доксорубицина, Б — мелфалана

Для исследования возможности комплексообразования мы использовали максимально удаленные от апоА-I пиковые характеристики поглощения. Для белковой молекулы максимум поглощения соответствует 280 нм, поэтому для получения более объективных данных мы брали для доксорубицина величину 477 нм, а для мелфалана 343 нм.

На рисунке 3 представлен профиль элюции комплекса апоА-I с доксорубицином.

Рис. 3. Хроматографический профиль элюирования апоА-I с доксорубицином.

1 — длина волны 280 нм; 2 — длина волны 477 нм

На рисунке 3 видно, что доксорубицин, так же как и белок, поглощает в области 280 нм, кривая 1, второй пик – 13–15 мл. При проведении элюирования на длине волны 477 нм мы получили два пика: один совпал с пробой, в которой вышел апоА-I, – это первый пик (4–7 мл), кривая под номером 2. Избыток несвязавшегося препарата вышел позже – пик 2 (14–16 мл). Для комплекса апоА-I с мелфаланом была получена аналогичная картина с визуализацией препарата на длине волны 343 нм.

На культуре клеток асцитной карциномы Эрлиха методом флуоресцентной микроскопии, при использовании в качестве метки репортера флуоресцинизотиоционата (ФИТЦ), показана возможность проникновения исследуемых комплексов в цитоплазму и ядра опухолевых клеток. На рисунке 4 можно увидеть культуру опухолевых клеток, которым в инкубационную среду был добавлен апоА-I без маркера (А). На рисунке 4(Б) комплекс апоА-I, меченного ФИТЦ c доксорубицином, и 4(В) комплекс апоА-I, меченного ФИТЦ c мелфаланом.

30 мин 5 мгк А-I

Рис. 4. Флуоресцентная микроскопия (ув. 200). А – клетки карциномы Эрлиха при добавлении апоА-I без маркера (ФИТЦ). Б – клетки карциномы Эрлиха в присутствии комплекса апоА-I, меченного ФИТЦ c доксорубицином, В – клетки карциномы Эрлиха в присутствии комплекса апоА-I, меченного ФИТЦ c мелфаланом. Время инкубации 3 ч

Яркое зеленое свечение в цитоплазме и ядрах клеток (рисунки 4(Б) и 4(В)) подтверждает возможность проникновения комплексов апоА-I—цитостатик в опухолевые клетки [12]. При этом количество флуоресцирующих клеток уже через 1,5 ч инкубации достигает порядка 23–31%, а через 3 ч это значение увеличивается до 68–75% (расчет производили на 100 визуализируемых опухолевых клеток).

Выводы

Проведенные исследования говорят о том, что аполипопротеин А-I обладает способностью образовывать стабильные комплексы с противоопухолевыми препаратами доксорубицином и мелфаланом. Рассчитанные константы связывания указывают на то, что взаимодействие белок—лиганд нельзя назвать высокоспецифическим, однако это может оказаться положительным моментом при освобождении препарата в клетках-мишенях. Количество молекул противоопухолевых препаратов, связанных на 1 молекулу комплексообразователя, представляет широкий диапазон регулирования дозировки препарата. Также показана принципиальная возможность проникновения исследуемых комплексов в цитоплазму и ядра клеток асцитной карциномы Эрлиха. Полученные результаты позволяют считать реальной возможность использования апоА-I в качестве транспортной формы доксорубицина и мелфалана.