В настоящее время при лечении колоректального рака прибегают к хирургическим вмешательствам. Сочетание злокачественного новообразования и хирургической травмы приводит к снижению адаптивных и функциональных возможностей организма больных с вызванной иммуносупрессией, что может привести к развитию послеоперационных осложнений и ухудшению прогноза [7].
У больных с онкологическими заболеваниями отмечаются нарушения различных звеньев иммунитета, играя важную роль в течение основного заболевания [4, 5, 6]. Вместе с тем ослабление противоопухолевого иммунологического контроля является одной из существенных составляющих канцерогенеза. Таким образом, ингибирование иммунной системы у прооперированных пациентов с онкологическими заболеваниями может влиять на частоту послеоперационных осложнений и дальнейшее течение заболевания. В настоящее время, помимо разработки различных иммуномодуляторов [11], совершенствуются методы хирургических подходов, позволяющих проводить более щадящие для гомеостатических систем организма операции, не теряя при этом радикальности. Несмотря на необходимость проведения при злокачественном росте обширных полостных операций, в некоторых случаях представляются возможными малоинвазивные лапароскопические вмешательства.
В последнее время для оценки иммунного статуса онкологических больных помимо стандартного набора лимфоцитарных субпопуляций используют расширенную панель, включающую лимфоциты с маркерами активации, памяти, функциональной активности и позволяющую получить более полную характеристику клеточного звена противоопухолевого иммунитета. В своей работе Абакушина Е.В. и соавт. (2015) утверждает, что изучение закономерностей функционирования механизмов активации и фенотипических маркеров субпопуляций лимфоцитов в организме опухоленосителей позволит дополнить представление о роли иммунной системы в канцерогенезе [1]. Другие авторы говорят о негативном воздействии на противоопухолевый иммунитет регуляторных Т-клеток (Тreg), способных угнетать все звенья иммунной системы, повышение уровня и активности которых способствует опухолевой прогрессии [3, 12]. Помимо этого, в ряде работ в качестве прогностического фактора рассматриваются различные субпопуляции лимфоцитов, включая минорные [1, 10].
В нашей работе проводилось одноэтапное удаление опухоли толстой кишки и ее метастазов в печень, способствуя уменьшению травматического воздействия, а, следовательно, стресса и медикаментозной нагрузки, а также более гладкому протеканию послеоперационного периода.
Цель исследования
Сравнить динамику клеточных факторов иммунитета у больных колоректальным раком, прооперированных с применением лапароскопического и открытого подхода.
Материалы и методы
В исследовании приняли участие 305 больных с метастатическим раком толстой кишки с резектабельными метастазами в печень. Все пациенты были разделены на 2 группы: основную (167 человек), в которой проводились лапароскопические операции, и контрольную с проведением традиционных открытых хирургических вмешательств (138 человек).
Для оценки иммунного статуса больных забор крови проводили до оперативного вмешательства при поступлении и перед выпиской из локтевой вены в объеме 5 мл в раствор полиглюкина с гепарином. Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови выполняли методом 6-цветной проточной цитофлюориметрии на анализаторе BD FACSCantoII с панелью антител ТВNК (CD3,СD4,СD8,CD16/56,CD19), клеток памяти (CD3,CD4,RA,RO), наивных клеток (CD3,CD4,RA,CD62L), T-хелперно-индукторных клеток (CD3,CD4,CD38,HLADR), активированных Т-клеток (CD3,CD4,CD8,CD69), Т-регуляторных клеток (CD3,CD4,CD25,CD127), протеолитическая активность Т-цитотоксических клеток (CD3,CD19,CD16/56,GrB,PerF,CD45) производства фирмы Becton Dickinson. Количественное содержание лимфоцитов выражали в процентах.
Результаты исследования и их обсуждение
На всем протяжении исследования, у больных, прооперированных с помощью открытого доступа, наблюдалось статистически значимое снижение абсолютного уровня лимфоцитов как по сравнению с исходными данными, так и по сравнению с результатами больных основной группы (Таблица 1).
Таблица 1
Динамика процентного содержания лимфоцитов и показатели фагоцитоза нейтрофилов и моноцитов у больных основной и контрольной групп, %
Показатель |
Лапароскопические операции, % |
Открытые операции, % |
||
До операции |
После операции |
До операции |
После операции |
|
Лимфоциты |
15,1±2,5 |
17,6±2,2 |
22,7±3,4 |
14,1±2,2* |
Гранулоциты |
79,7±8,1 |
72,6±6,6 |
71,4±7,7 |
81,3±8,0 |
Фагоцитоз гранулоцитарный |
93,0±9,9 |
89,2±9,0 |
92,7±8,8 |
92,5±6,9 |
Моноциты |
5,33±0,92 |
6,17±2,05 |
5,48±1,57 |
4,75±0,87 |
Фагоцитоз моноцитарный |
84,3±4,6 |
92,4±5,1 |
87,5±6,7 |
79,2±8,2 |
Примечание – * статистически достоверные отличия от показателя до операции (р<0,05).
После проведения лапароскопических операций процентное содержание СD3+ и DN-лимфоцитов Т-ряда статистически достоверно снижалось. Одновременно статистически значимо возрастали процентные уровни В-клеток, СD4+ и DP Т-лимфоцитов. Содержание Tregs не менялось. У больных контрольной группы отмечалось статистически достоверное снижение процентного содержания СD3+ и СD19+ клеток. Кроме того, в динамике наблюдалось уменьшение содержания основных Т-клеточных субпопуляций (Таблица 2).
Таблица 2
Динамика показателей основных субпопуляций Т- и В-лимфоцитов после проведения лапароскопических и открытых операций, %
Показатель |
Лапароскопические операции, % |
Открытые операции, % |
||
До операции |
После операции |
До операции |
После операции |
|
CD3+ |
74,3±5,1 |
58,8±5,0* |
76,5±4,4 |
64,2±3,3* |
CD3+CD4+ |
30,5±2,1 |
36,7±2,3* |
36,8±3,5 |
39±3,1 |
CD3+CD8+ |
24,7±2,3 |
27,5±2,5 |
31,5±3,3 |
32,9±2,5 |
CD19+ |
9,25±1,1 |
14,8±0,9* |
10,5±1,0 |
7,9±0,8* |
DN (CD3+CD4-CD8-) |
2,88±0,4 |
1,8±0,3* |
3,3±0,4 |
3,1±0,3 |
DP (CD3+CD4+CD8+) |
0,7±0,1 |
1,5±0,3* |
1,1±0,28 |
1,32±0,24 |
Tregs (CD4+CD25highCD127dim) |
7,6±1,3 |
6,5±1,1 |
7,325±1,9 |
10,1±2,1 |
Примечание – * – статистически достоверные отличия от показателя до операции (р<0,05).
Между тем у больных основной группы происходило снижение процентного содержания NК-лимфоцитов (СD16/56+). Наблюдалось статистически достоверное повышение процентного уровня активированных NK-клеток (CD335) и NKT-клеток, экспрессирующих маркеры как натуральных киллеров, так и T-лимфоцитов (CD3+CD16/56+). В контрольной группе отмечалось снижение процентного содержания NК-лимфоцитов (СD16/56+), в том числе содержащих важнейшую протеазу, обеспечивающую их цитотоксичность – Granzyme B, а также абсолютного уровня NКТ-лимфоцитов, что в целом характеризует угнетение NK-клеточного звена после проведения открытых операций (Таблица 3).
Таблица 3
Динамика показателей NК-лимфоцитов после проведения лапароскопических и открытых операций, %
Показатель |
Лапароскопические операции, % |
Открытые операции, % |
||
До операции |
После операции |
До операции |
После операции |
|
CD16/56+ |
22,2±3,4 |
13,1±2,6* |
20,6±3,0 |
13,2±2,1* |
NKT (CD3+CD16/56+) |
7,9±0,8 |
11,5±1,2* |
10,1±0,8 |
9,1±1,1 |
CD335 |
56,1±4,2 |
69,8±3,9* |
62,6±4,5 |
64,5±4,3 |
Granzyme B |
55,8±3,7 |
52±4,3 |
69,5±4,6 |
56,2±4,8* |
Примечание – * – статистически достоверные отличия от показателя до операции (р<0,05).
Анализ динамики количества лимфоцитов, экспрессирующих маркеры активации, продемонстрировал снижение процента Т-хелперно-индукторных клеток с маркером ранней (CD3+CD4+CD69+) и поздней (CD3+CD4+HLADR+) активации. У больных обеих групп отмечалось статистически значимое возрастание уровня активированных (CD3+CD8+CD38+) лимфоцитов. В отличие от открытых операций, проведение лапароскопических вмешательств повышало процентный уровень CD3+CD4+CD25+ и CD3+CD8+CD25+ лимфоцитов. После лапароскопических операций происходило увеличение количества CD8+ Т-клеток с иммунофенотипом «наивных». Проведения открытых операций ингибировало этот показатель, а также процентное содержание CD4+ лимфоцитов с фенотипом Т-клеток памяти.
Через 7 суток после операции снижался уровень CD3+ лимфоцитов на фоне возрастания обеих основных субпопуляций Т-клеток (CD3+CD4+ и CD3+CD8+). По всей видимости, такие изменения достигаются за счет значительного снижения процента DN Т-клеток, не экспрессирующих ни CD4, ни CD8. Наши исследования показали, что уменьшение количества таких клеток более существенно после лапароскопической операции; при этом у тех же больных происходит возрастание DР Т-лимфоцитов (CD3+CD4+CD8+), характеризующихся как незрелые Т-клетки с фенотипом, присущим поздним тимоцитам. К настоящему времени установлено, что CD4+CD8+ клетки в периферической крови являются высокодифференцированными клетками памяти [10]. Имеются сведения о повышении содержания дубль-позитивных Т-лимфоцитов при длительной антигенной стимуляции, при персистирующей патологии, в частности, при рассеянном склерозе, инфекционных заболеваниях, миастении и др., а также в старческом возрасте [2, 8]. Основываясь на работе Н.В. Балацкой и соавт. (2015), эта субпопуляция клеток, возрастающая при мононуклеозе, вызванном вирусом Эпштейна – Барр, ВИЧ-инфекции, рассматривается в аспекте противоинфекционной защиты [2, 13].
По нашим данным, в обеих группах после операции наблюдалось снижение уровней СD69+, особенно среди субпопуляции СD3+СD4+ клеток. В отличие от CD69+ Т-лимфоцитов, уровень Т-клеток с рецептором CD38 после операции повышался, особенно среди субпопуляции CD3+CD8+. Полученное нами повышение процента CD3+CD8+CD38+ клеток у больных в динамике можно рассматривать как признак активации клеточных иммунных реакций, играющих важную роль в противоопухолевой защите.
После лапароскопической операции отмечалось возрастание уровня CD3+CD4+CD25 и CD3+CD8+CD25 клеток, что, на наш взгляд, является свидетельством активации Т-клеточного звена у больных основной группы.
Снижение уровня CD4+HLA-DR+ у больных обеих групп, по-видимому, свидетельствует о преобладании процессов ранней активации Т(CD4+)-лимфоцитов над поздней, тогда как количество CD8+HLA-DR+ лимфоцитов не отличалось ни в динамике, ни между группами. В послеоперационном периоде у больных контрольной группы уменьшался уровень CD4+ Т-лимфоцитов с фенотипом клеток памяти (CD3+CD4+CD45RO+CD45RA-), что при дальнейшем сохранении такой тенденции может оказаться неблагоприятным фактором. Полученное нами у больных основной группы повышение содержания CD8+ клеток с фенотипом «наивных» ассоциируется со стимуляцией цитотоксического Т-клеточного звена иммунной системы после лапароскопических операций [9].
При вмешательствах на богатых бактериальной микрофлорой органах особенно важно обнаруженное нами увеличение содержания В(CD19+)-лимфоцитов после лапароскопической операции, что может являться фактором положительного прогноза раннего послеоперационного периода, поскольку В-клеточный иммунитет во многом обеспечивает противоинфекционную защиту.
Итак, на основании проведенных исследований показателей иммунного статуса в динамике послеоперационного периода у больных генерализованным колоректальным раком после открытых и лапароскопических операций установлено более щадящее действие последних на основные звенья иммунной системы.
Заключение
В ходе исследования был отмечен ряд изменений изученных параметров в динамике оценки иммунного статуса после лапароскопических операций. Установлено статистически достоверное снижение процентного содержания СD3+, СD16/56+, DN и активированных СD4+клеток с маркерами наиболее ранней (CD69) и поздней (НLА-DR) активации. Также возрастают процентные уровни СD4+, в т.ч. экспрессирующие активационный маркер СD25+ лимфоцитов, однако, это не сопровождается повышением процента лимфоцитов с иммунофенотипом Tregs (CD4+CD25highCD127dim). Кроме того, наблюдается увеличение процента DP, наивных и активированных СD8+ клеток, а также В-лимфоцитов. Полученные данные в целом свидетельствуют о сохранности основных звеньев иммунной системы. Даже при наличии снижения процентного содержания NК-клеток, уровень NKT, а также активированных натуральных киллеров (СD335) повышается, по-видимому, компенсаторно, что говорит о сохранности функциональных резервов данного звена. Абсолютные показатели клеточного иммунитета демонстрируют подобную динамику, часть из которых возрастает у больных после лапароскопической операции (СD3+СD4+, DP), в отличие от больных после открытых операций, у которых происходит снижение абсолютного содержания СD3+СD4+, СD3+СD8+, СD19+, СD16/56+, в т.ч. гранзим-содержащих, а также NKT. Полученные результаты свидетельствуют о большей сохранности Т-, В- и NK-клеточного звеньев, обеспечивающих различные иммунные реакции организма, в т.ч. противоопухолевые, хотя, учитывая ранние сроки исследования после операции, описанные различия могут быть транзиторными.