В 2017 году исполнится тридцать лет с момента идентификации «нового» белка, выделенного из ткани злокачественных опухолей, сопровождающихся развитием гиперкальциемии. После 40 лет поиска тремя независимыми исследовательскими группами из клеток рака молочной железы [18], рака легких[111], рака почки [153] была выделена субстанция, которая обладала высокой N-концевой гомологией с паратиреоидным гормоном. Сходство этого белка по биологической активности и структуре с паратиреоидным гормоном определило его ныне существующее название – паратиреоидный гормон-родственный белок. За прошедшие годы многочисленными исследованиями было установлено широкое распространение этого белка в различных нормальных и онкотрансформированных тканях, описаны многочисленные виды его биологической активности, эндокринный, паракринный и интракринный механизмы действия в физиологических и патофизиологических реакциях, доказана его ведущая роль в органогенезе [176,124,110,137,40,123,175,80].
В данном обзоре представлены наиболее значимые и убедительные аргументы и факты о структурно-функциональных характеристиках паратиреоидного гормон-родственного белка и его физиологической роли в организме человека и ряда других биологических видов. Этот белок оказывает глубокое воздействие на многие физиологические процессы и во многом, определяет сложную систему их взаимодействия.
Изложению основного материала обзора, по-видимому, целесообразно предпослать несколько уточнений, касающихся установившегося в научной литературе названия рассматриваемой биологически активной молекулы. В англоязычной литературе аббревиатуре PTHrP соответствуют две версии ее прочтения –Parathyreoid Hormon-relatedpeptide и Parathyreoid Hormon-related proteinе. К пептидам принято относить молекулы, содержащие не более 45-50 аминокислот, а молекула PTHrP содержит намного больше аминокислот, и в этой связи она, безусловно, относится к белкам.
В различных изоформах молекула паратиреоиднного гормон-родственного белка содержит 139, 141 либо 173 аминокислоты. Из этих белковых структур в результате посттрансляционного процессинга формируются зрелые секреторные формы биологически активных пептидов: N-концевой фрагмент, срединная область (midregion) и C-концевой домен, каждый из которых имеет свою собственную функциональную роль в организме участвуя в инициации и регуляции различных физиологических, патофизиологических и патобиохимических эффектов [119,153,181,92].
К зрелым секреторным формам пептидов относят N-концевой домен (1-34 или 1-36), срединный фрагмент (midregion) (38-94) и С-концевой домен молекулы паратиреоидного гормон-родственного белка(107-139), который в ряде публикаций обозначается как «остеостатин». В этой связи в современной англоязычной литературе аббревиатура «PTHrP» служит для обозначения как белкового предшественника биологически активных пептидов, так и самих этих пептидов. Последняя буква аббревиатуры может обозначать и слово «протеин», если речь идет об исходных продуктах трансляции изоформ белковых молекул, или «пептид», если говорят и пишут о биологически активных постпроцессинговых доменах. В рамках данного обзора мы стремились придерживаться этого принципа обозначения биологически активных структур, входящих в семейство паратиреоидного гормона и являющихся предметом исследований, результаты которых использованы при подготовке этой статьи и в ее тексте использовали аббревиатуру «ПТГрП».
Следует, однако, отметить, что среди проанализированных нами публикаций (а они на 99% англоязычные) имеется немало статей, в которых аббревиатура «PTHrP» используется без уточнения структуры исследованной молекулы. При цитировании таких публикаций придерживались трактовки последней буквы аббревиатуры «PTHrP» в контексте содержания конкретной статьи, т.е., или «пептид» или «протеин». В этой связи следует отметить, что не всегда представлялось возможным абсолютно однозначно идентифицировать принадлежность молекул, обозначенных в цитируемых работах, как «PTHrP» к белкам или пептидам, что нашло отражение в тексте данного обзора, в котором аббревиатура «ПТГрП» служит для обозначения биологически активных молекул без уточнения в ряде случаев их принадлежности к пептидам или белкам. Словосочетанием «экспрессия гена ПТГрП» в тексте статьи обозначен программируемый геномом процесс биосинтеза функционального продукта – белка (протеина) или матричной РНК (мРНК).
ПТГрП входит в семейство паратиреоидного гормона (ПТГ), состоящего из группы структурно-родственных биологически активных факторов, участвующих в регуляции кальциевого и костного гомеостаза и процессов развития различных тканей и органов [48,125]. В течение трех последних десятилетий эти структурно-родственные биологически активные молекулы стали предметом растущего интереса, и среди них особое внимание исследователей привлекает ПТГрП [139], имеющий последовательность аминокислот, идентичную с первыми 6 аминокислотами ПТГ[139].
ПТГ и ПТГрП оказывают, в основном, сходные эффекты на клетки-мишени классического ПТГ, но их влияние на другие клетки-мишени существенно различается. Классическими клетками-мишенями ПТГ являются клетки костной и почечной ткани, а именно, хондроциты, остеобласты и остеокласты из костной ткани и клетки почечных канальцев и ткани почки. В то же время ПТГ взаимодействует с другими клетками-мишенями – клетками печени, гладких мышц, эритроцитами и лимфоцитами, клетками-водителями ритма сердца и кардиомицитами [139]. ПТГрП имеет гораздо более широкий спектр эффектов. Паратгормон и ПТГрП связываются с одним и тем же рецептором, но ПТГ-родственные пептиды также связываются с несколькими другими рецепторами.
Функции ПТГ во многом реализуются группой структурно-родственных пептидов, одним из которых является ПТГрП который, однако, имеет ряд существенных структурно-функциональных отличий от ПТГ.
ПТГрП отличается от ПТГ по трем основным моментам. Во-первых, он синтезируется не в паращитовидных железах, а в различных нормальных либо малигнизированных тканях. Во-вторых, молекула ПТГрП существенно больше молекулы ПТГ, которая содержит 84 аминокислоты. В-третьих, ПТГрП во многих тканях действует как паракринный, интракринный или аутокринный фактор, а не как классический гормон дистантного действия, что свойственно ПТГ [139,46,39,66]. Таким образом, хотя ПТГ и ПТГрП структурно и функционально отчасти подобны, они во многих моментах вызывают неодинаковые эффекты из-за различий в адресности реализации биологической активности и структурно-функциональных особенностей.
Молекула ПТГрП отличается от молекулы ПТГ значительно бóльшим содержанием аминокислот. Различные изоформы молекул ПТГрП содержат различающиеся С-концевые терминалы. N–концевые терминалы изоформ имеют частично гомологичные с ПТГ аминокислотные последовательности, что позволяет им связываться с рецептором ПТГ первого типа (ПТГ1R) [20]. Значительная часть информации о биологических эффектах ПТГрП была получена в экспериментальных исследованиях на лабораторных животных с целенаправленной делецией в гене ПТГрП (нокаутные мыши) либо на трансгенных мышах с гиперэкспрессией этого белка в определенных тканях [91]. Подтверждение результатов экспериментальных исследований во многих случаях было получено в наблюдениях на людях с мутациями в гене ПТГрП или в гене рецептора ПТГ/ПТГрП.
ПТГрП кодируется одним геном, который является членом небольшой семьи, включающей также ген паратиреоидного гормона (ПТГ) и ген tuberoinfundibular пептида- 39 (TIP-39) [117,171,180]. Ген ПТГрП расположен на коротком плече 12-й хромосомы, а ген ПТГ – на коротком плече 11-й хромосомы. Ген, кодирующий ПТГрП у низших позвоночных животных, имеет довольно простую структуру, но в ходе эволюции приобрел у высших позвоночных животных и человека более сложную структуру с добавлением экзонов и альтернативных промотеров [125,90,179]. Ген, кодирующий ПТГрП значительно более сложен, чем ген, кодирующий ПТГ. Ген ПТГ имеет три экзона, а ген ПТГрП человека содержит 9 экзонов и 3 промотера. Использование различных промотеров при мРНК копировании ПТГрП обеспечивает образование разных изоформ белка [97]. ПТГрП кодируется геном, охватывающим более 15 Кб геномной ДНК. Ген ПТГрП генерирует несколько вариантов мРНК с помощью использования различных вариантов сплайсинга и различных промотеров. Транскрипты гена ПТГрП путём альтернативного сплайсинга образуют три различных вида мРНК, которые кодируют три первоначальных трансляционных изоформы белка, содержащие 139, 173 или 141 аминокислоту. Характер экспрессии мРНК ПТГрП различных изоформ может быть разным в различных типах клеток [130,144].
В исследованиях, посвященных молекулярной регуляции экспрессии гена ПТГрП установлено, что стимуляцию экспрессии вызывали эпидермальный фактор роста (17), инсулиноподобный фактор роста (18), трансформирующий фактор роста бетта (TGF-β) (19). Подавляют образование ПТГрП 1,25 дигидроксивитамин Д3 (1,25(ОН)2 Д3) и андрогены [79,70,142,51,127]. Факторы роста стимулируют образование ПТГрП, активизируя транскрипцию генов через РАН-митоген активирующую протеиназу (МАРК), а 1,25(ОН)2 Д3 может влиять через взаимодействие с рецепторами витамина Д, ингибируя транскрипцию ПТГрП. Ген ПТГрП находится под транскрипционным контролем глюкокортикоидов и витаминa D [63]. Глюкокортикоиды могут подавлять экспрессию мРНК ПТГрП [72], а 1,25(ОН)2D3 повышает экспрессию мРНК ПТГрП и блокирует стимулирующий эффект TGF-β на экспрессию пептида [82].
Исходные продукты трансляции, образующие изоформы ПТГрП, различаются, в основном, за счет С-концевого фрагмента. Первые 111 аминокислот PTГрП являются чрезвычайно консервативной частью структуры молекулы у многих видов. На аминокислотном уровне PTHrP куриных имеет 91% сходство с ПТГрП человека [125].PTГрП рыбы фугу имеет 53% сходство с человеческим ПТГрП [29].
Семейство биологически активных пептидов генерируется путем альтернативного сплайсинга первичного транскипта, а также за счет использования альтернативных посттрансляционных сайтов расщепления белковых молекул путем протеолитического процессинга. Посттрансляционная модификация путем протеолиза исходных изоформ ПТГрП генерирует образование пептидов, которые функционируют в качестве паракринных эффекторов, имеют короткий период полураспада, а также многочисленные виды биологической активности [119,144,124].
В результате процессинга ПТГрП образуется несколько зрелых форм биологически активных пептидов. К зрелым секреторным формам пептидов относят:N-концевой домен (1-34 или 1-36), срединный фрагмент (midregion) (38-94 или 67-86) и С-концевой домен (osteostatin) (107-139 или 102-141) [152,171]. N-концевая область ПТГрП (1-34) содержит аминокислотную последовательность – H-Ala-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Leu-His-Asp-Lys-Gly-Lys- Ser-Ile-Gln-Asp-Leu-Arg-Arg-Arg-Phe-Phe-Leu-His-His-Leu-Ile-Ala-Glu-Ile-His-Thr-Ala-OH которая отчасти гомологична ПТГ. Домен ПТГрП (1-34) способен активировать общий для ПТГ и ПТГрП рецептор (ПТГ/ПТГрП-рецептор) [152,98].
N-концевой пептид проявляет свойства, во многом сходные с N-концевым доменом паратгормона. Центральный пептидный фрагмент ПТГрП (38-94) и С-концевой пептид (107-141) обладают биологической активностью, отличающейся от эффектов домена (1-34) [119]. Срединная область белка (midregion) содержит сигнальный пептид ядерной локализации (NLS),участвует в регуляции транспорта кальция и пролиферации клеток, а С-концевой домен (102-141) модулирует активность остеокластов, влияет на их пролиферацию [182] оказывая угнетающее действие на резорбцию костной ткани в пробирке и в естественных условиях [59]. Фрагмент С-концевого домена ПТГрП (107-111) ингибирует костную резорбцию остеокластами [37] и этот эффект связан с активацией протеинкиназы С. Специфический рецептор к этому пептиду постулирован, но пока не идентифицирован [139].N-концевой и C-концевой домены ПТГрП по разному влияют на остеогенный и адипоцитогенный потенциал мезенхимальных стволовых клеток человека [24].
ПТГрП взаимодействует с клеточными мембранами через общий рецептор с ПТГ, а также через специфические рецепторы [68,86,85,44]. Общий ПТГ/ПТГрП-рецептор специфически взаимодействует с N-концевым доменом обеих молекул. ПТГрП имитирует почти все функции ПТГ, которые опосредованы взаимодействием N-терминального домена с рецептором и последующей активацией внутриклеточных сигнальных путей. Мембранный рецептор ПТГрП/ПТГ относится к семейству ПТГ суперсемейства В, входящего в класс (G-протеин) сопряженных рецепторов (G-ПСР) (по данным Европейского института биоинформатики (Хинкстон, Великобритания и Информационного ресурса белков (PIR) (Вашингтон, США) (релиз 56.7 от 2001.2009 г.). Рецепторы класса G-ПСР представляют собой полипептидную цепь с N- и C-кольцевыми свободными доменами, экстра-интрацеллюлярными петлями и семью трансмембранными доменами [145]. Cвязывание G-ПСР с агонистом может активировать или угнетать многие цитоплазматические эффекторные протеины: анденилатциклазы 1-9, фосфолипазы С и В,тирозинкиназы, фосфоинозитид 3-киназу и ионные каналы [19]. ПТГрП проявляет большую вариабельность в отношении эффектов на клетки – мишени запуская в них различные механизмы внутриклеточной передачи сигнала [2].
ПТГрП способен индуцировать внутриклеточный Са++-сигнал через транзиторное открытие каналов L типа Са++, тем самым влияя на экспрессию генов, промотеры которых содержат Са++- реагирующие элементы и/или другие внутриклеточные пути, зависящие от Са++-кальмодулина [5,162,167]. Большой N-концевой экзодомен рецептора участвует во взаимодействии с лигандами, а С-концевой домен отвечает за активизацию внутриклеточного сигнального каскада [22,43,68,52]. ПТГ/ПТГрП – рецептор обнаружен практически во всех исследованных тканях [139]. Он связывается, как c N-концевым доменом ПТГ (1-34), так и ПТГрП (1-36), активирует аденилатциклазный-протеинкиназный А, либо фосфолипазный-протеинкиназный Свнутриклеточные сигнальные пути [3,182,89] и это единственный клонированный рецептор для ПТГрП[28,68].В некоторых тканях ПТГрП также связывается с рецептором, который не связывает ПТГ. В одних и тех же клетках могут присутствовать рецептор, взаимодействующий с ПТГрП (1-36)и другой рецептор, лигандом которого является ПТГрП (67-86) [118]. Многогранность эффектов ПТГрП связана с его способностью взаимодействовать с несколькими типами рецепторов. ПТГрП (107-139) может активировать сигнальные пути через протеинкиназу С/ERK-пути [31].Это рассматривается как свидетельство того, что срединный (midregion) и С-концевой домены ПТГрП связываются с другими типами рецепторов, которые еще не идентифицированы и не клонированы [119].
Было показано, что мРНК рецепторов ПТГ/ПТГрП в почках экспрессируется с почечноспецифического промотора P1 и промотора P2, активного во многих типах тканей. Иммуноцитохимический и иммуноэлектронномикроскопический анализы показали, что рецепторы ПТГ/РПТГП в почках мышей локализуются в апикальной и базолатеральной мембранах клеток эпителия проксимальных почечных канальцев. Иммунореактивные рецепторы ПТГ/ПТГрП обнаружены также на поверхности гломерулярных подоцитов и в клетках эндотелия перитубулярных сосудов, но не гломерулярных сосудов. В кортикальных и медуллярных эпителиальных клетках нефрона обнаружили экспрессию рецепторов ПТГ/ПТГрП как типа P1, так и типа P2, а в клетках перитубулярного эндотелия обнаружили только рецепторы P1[8].
Рецепторы ПТГ/ПТГрП (PTHR1) присутствуют в нормальной ткани предстательной железы, в эпителиальных клетках тонкой, толстой и прямой кишки, в коре надпочечников. В костной ткани рецепторы ПТГрП типа 1 были обнаружены в остеоцитах и остеобластах, но не в остеокластах [93].У человека рецептор ПТГ/ПТГрП также экспрессируется во множестве других тканей, активируется ПТГ и ПТГрП, и участвует в реализации аутокринных, паракринных и эндокринных эффектов [44,141,161].У рыб, рецептор ПТГ/ПТГрП в основном экспрессируется в печени, гонадах, коже, головном мозге и гипофизе [48,50,133]. Изучение в эксперименте механизмов регуляции экспрессии гена этого рецептора показало, что удаление паращитовидных желез не изменяет содержание мРНК рецепторов ПТГ/ ПТГрП в почках, сердце и печени [148]. Наличие ПТГрП и его рецепторов практически в каждом органе в период развития организма и во взрослой жизни предполагает, что передача сигналов PTHrP имеет место в различных физиологических условиях.
Представляется вероятным, что различные участки ПТГрП инициируют широкий спектр специфических клеточных реакций [81]. Установлено, что ПТГрП (107-139) оказывает влияние на кожу, сердце и костную ткань. ПТГрП (38-94), чей клеточный рецептор доставерно неизвестен, способен активировать внутриклеточные Ca++ - пути при низких концентрациях и участвует в транспорте кальция от матери к плоду через плаценту, которая является единственной нормальной тканью, где этот домен белка оказывает влияние [167]. Фрагмент ПТГрП (38-94) в значительной части исследований связывают с неопластическими процессами [92].
Несмотря на широкую продукцию PTHrP у здоровых людей, его концентрация в кровеносном русле еще несколько лет тому назад была ниже предела обнаружения большинства рутинных аналитических тестов [33].Содержание ПТГрП в крови взрослого здорового человека, как правило, очень низкое и большая часть эффектов в этот период жизни обеспечивается не гуморальными, а иными механизмами. Содержание ПТГрП в крови значительно увеличивается в период беременности и развития плода, а также в период лактации и в эти периоды жизни он действует как эндокринный фактор, регулирующий минеральный и костный гомеостаз независимо от ПТГ [77].
Самые высокие концентрации [77] ПТГрП обнаруживаются в молоке в период лактации. Эндокринные механизмы регуляции физиологических функций при участии ПТГрП имеют место, когда продуцируемый в молочной железе белок поступает в кровоток [47] и в период эмбрионального развития плода, когда он регулирует трансплацентарный транспорт кальция [23,47,170,78,132].
Значительно больше известно о многочисленных паракринных эффектах ПТГрП в различных тканях. Как паракринный фактор, пептид регулирует рост и развитие многих тканей и, в первую очередь, скелета и молочных желез [105]. Паракринному действию ПТГрП отводится существенная роль в регуляции физиологического развития кератиноцитов, волосяных фолликулов, хрящей, в прорезывании зубов, регуляции функционального состояния гладких мышц сосудов, поджелудочной железы и во многих других физиологических реакциях организма. Эти физиологические функции, включают регулирование тонуса гладких мышц сосудов, кишечника, матки, мочевого пузыря, модуляцию трансэпителиального транспорта кальция в почках, плаценте, молочных железах и регулирование дифференцировки и пролиферации клеток тканей и развития органов[100,124].
Особым биологическим свойством ПТГрП является его локализация в клетке. Пептид может синтезироваться в аппарате Гольджи и локализоваться в цитоплазме либо секретироваться в околоклеточное пространство. Кроме того некоторые клетки используют альтернативные трансляционные инициирующие кодоны для образования белковых молекул предназначенных для ядерной локализации. ПТГрП генерируется в таких клетках, но не секретируется из нее, а транслоцируется в ядро клетки, где оказывает во многом неясное влияние на ядерные функции[83].Внутриядерная локализация ПТГрП обеспечивает интракринные эффекты пептида [16],которые во многом остаются неизвестными, но в целом, допускается его митогенное действие [32]. Предполагается, что интракринные эффекты ПТГрП обеспечиваются фрагментом (1-87), включающим N-концевой домен и midregion [49].Модуляция клеточной адгезии с участием пептида, локализованного в ядре клетки, является нормальным физиологическим действием ПТГрП, опосредованным путём увеличения транскрипции генов интегрина. Полагают, что интракринное действие ПТГрП может модулировать запрограммированную гибель клеток. Утверждается, что некоторыеэффекты ПТГрП и, в частности, влияние на повышенную выживаемость хондроцитов за счет ингибирования процессов апоптоза, связаны с ядрышковой локализацией пептида [1,54,101]. Антиапоптотические эффекты ПТГрП выявленные в исследованиях на хондроцитах [54]опосредованы изменением продукции антиапаптотического белка Bcl-2 [10].Установлено, что ядерная локализация ПТГрП играет решающую роль в регуляции экспрессии генов и, в частности, проапоптотического гена TNF, что предотвращает аноикис (специфический тип апоптоза «по умолчанию») - клеток, у которых нарушено взаимодействие с тканевым матриксом[122].
ПТГрП - мультипотентный белок, содержащий ряд биологически активных доменов. В физиологических условиях этот белок продуцируется во многих, если не во всех тканях организма, как в эмбриональном, так и в постнатальном периодах жизни [105]. Сообщалось о секреции ПТГрП и наличии рецепторов к нему в сердце, мозге, скелетных мышцах, мочевом пузыре, легких, желчных протоках, печени, матке, семенниках, иммунокомпетентных структурах и в большинстве эндокринных органов, включая гипофиз и С-клетки щитовидной железы [124,160].
Особенно важна роль ПТГрП в широком спектре физиологических процессов во время эмбрионального развития. Сообщалось о влиянии ПТГрП, а также его биологически активных фрагментов на пролиферацию, или, наоборот, гибель клеток в модельных системах нормальных тканей[26,53,6]. ПТГрП участвует в регуляции роста и дифференцировки многих типов клеток: костной ткани и почек, АПУД системы, молочной железы, легких, мозга, сердца, сосудов и других. Влияние этого белка на рост и дифференцировку клеток в различных нормальных тканях начинается с самых ранних этапов эмбриогенеза. В исследованиях invitro и invivo установлено, что ПТГрП может изменять рост и дифференцировку кератиноцитов [69], клеток мозга [95], клетки молочных желез [163], респираторных эпителиоцитов [53], почечных клеток [13], гладкомышечных клеток [154], β-клеток поджелудочной железы [25],клеток хрящевой эпифизарной пластины ПТГрП [9]. В постнатальном периоде ПТГрП играет важную роль в нормальном формировании костной ткани [7]. ПТГрП секретируется хрящевой тканью суставов в ответ на нагрузки и участвует в регуляции состояния суставного хряща [94].
Физиологическое значение ПТГрП для развития скелета было убедительно продемонстрировано в экспериментах на мышах с нокаутом гена, контролирующего экспрессию этого белка. Такие мыши имели множественные дефекты развития скелета [9] и погибали сразу после рождения от дыхательной недостаточности, связанной с дефектами формирования грудной клетки [71,57]. В костях плода, ПТГрП синтезируется перихондриальными клетками и хондроцитами на концах растущих костей, затем диффундирует от мест производства и связывается с ПТГ/ПТГрП рецепторами на близлежащих хондроцитах. Считается, что ПТГрП принадлежит ключевая роль в контроле темпов созревания хондроцитов в хрящевой ростовой пластине посредством предотвращения преждевременной дифференциации хондроцитов в прегипертрофированные и в гипертрофированные хондроциты [84], а также путем увеличения скорости пролиферации хондроцитов и подавления их терминальной дифференцировки. Эти эффекты возникают из-за взаимодействия ПТГрП с рецептором паратгормона. Ингибирование воздействия ПТГрП на хондроциты путем прерывания сигнализации через ПТГ/ПТГрП-рецепторы привело к ускорению дифференцировки хондроцитов и преждевременному исчезновению пластины роста [57,61].
Человеческие эмбрионы с дефектными РТН / PTHrP рецепторами (Blomstrand- хондро остеодистрофия) умирают в утробе матери из-за множественных скелетных аномалий. У людей с метафизарной хондродисплазией Янсена проявляются нарушения роста (врожденная карликовость с деформацией конечностей, недоразвитием костей лица, брахицефалией, задержкой оссификации эпифизов), вызванные мутациями в гене, кодирующем ПТГ/ПТГрП-рецептор, которые делают рецептор активным даже в отсутствие лиганда, что приводит к задержке дифференциации хондроцитов. Мыши с гомозиготной инактивацией гена PTHrP погибают при рождении, если не раньше. У них выявлялась выраженная хондродисплазия, отражающая дефект развития в пролиферации и дифференцировки хряща.
ПТГрП может влиять на костный метаболизм, модулируя действия трансформирующего фактора роста (ТФР-β) посредством уменьшения скорости синтеза остеокальцина, возможно, на уровне транскрипции ,а также участвует в стимуляции дифференцировки клеток костной ткани [165]. Его влияние на костную ткань опосредуется через систему цитокинов и, в том числе, интерлейкина-6 и фактора некроза опухоли (ФНО-альфа), а также систему остеопрогерина /RANKL. В естественных условиях ПТГрП стимулирует экспрессию остеобластами интерлейкина–6 и фактора ингибирования лейкоза.
В исследованиях на эмбрионах мышей, гомозиготных по делеции гена ПТГрП, либо по делеции гена рецептора ПТГ/ПТГрП было установлено, что этот белок является важным физиологическим регулятором кальциевого обмена [78].Действие ПТГрП, по крайней мере, частично, осуществляется путем стимуляции особого рецептора, усиливающего плацентарный транспорт кальция, который отличается от ПТГ/ПТГрП-рецептора, присутствующего в других тканях, и выявлен только в плаценте. Указывается, что этот рецептор является важной детерминантой гомеостаза кальция у эмбриона.
ПТГрП играет центральную роль в физиологической регуляции образования кости [107],способствуя формированию и выживанию остеобластов и, возможно, играет определенную роль в регуляции физиологической резорбции кости за счет повышения образования остеокластов [38], а также является важным элементом сложной системы минерализации костей [15]. У трансгенных мышей с торможением образования ПТГрП отмечено увеличение апоптоза остеобластов и снижение образования остеокластов, что свидетельствует о существенной роли пептида в формировании костной ткани [106]. ПТГрП является также важным физиологическим регулятором массы костной ткани взрослых организмов [14]. У мышей с удаленными яичниками инъекции фрагментов ПТГрП привели к увеличению образования костной ткани и снижению костной резорбции [30].Подкожные инъекции ПТГрП здоровым женщинам в постменопаузе привели к очевидному анаболитическому эффекту на кости и увеличению кишечной абсорбции кальция при введении в высоких дозах [61]. Глюкокортикоид-индуцированное угнетение экспрессии ПТГрП и ПТГ/ПТГрП-рецептора в мезенхимальных стволовых клетках человека может быть одним из механизмов стероидиндуцированной потери костной массы [4].
Существует немало убедительных доказательств, свидетельствующих о важной роли ПТГрП в формировании и развитии молочных желез у млекопитающих [174,17,45,173,163].
ПТГрП участвует в физиологическом развитии молочной железы и регуляции транспорта кальция через плаценту в период беременности, когда он стимулирует рост костной ткани плода за счет резорбции кости матери и увеличения транспорта кальция через плаценту к плоду, а в период кормления грудью участвует в обеспечения насыщения молока необходимым для новорожденного количеством кальция [134].
ПТГрП является важным элементом организации сложного взаимодействия эпителиальных и мезенхимальных клеток в процессе развития молочной железы [143]. В физиологических условиях эпителиальные клетки молочных желез продуцируют много ПТГрП, секреция которого регулируется при участии рецептора кальция. Концентрация ПТГрП в крови - пикмолярная, а в молоке - наномолярная, т.е. намного выше. Повышенные плазменные уровни ПТГрП могут быть найдены в период лактации, когда в молочной железе индуцируется активная продукция этого белка в ответ на растяжение альвеолярной ткани вследствие секреции молока [11]. Молочные железы у самок мышей с гомозиготной инактивацией гена PTHrP не развиваются, за исключением, самых ранних этапов.
ПТГрП играет важную роль в морфогенезе молочной железы, влияя на межклеточные взаимодействия между эпителиальными клетками, формирующими протоки и альвеолы, и клетками стромы, включающими фибробласты и адипоциты [56]. Эпителиальные клетки у плода индуцируют под влиянием РТГрП экспрессию рецепторов андрогенов в мезенхимальных клетках, которые в ответ на действие андрогенов, продуцируемых семенниками мужских эмбрионов, собираются вокруг эпителиальной почки и разрушают ее. В отсутствии ПТГрП или его рецептора в мезенхимальных клетках, в них не экспрессируются рецепторы андрогенов и из сохранной эпителиальной почки идет развитие молочной железы по женскому типу.
ПТГрП влияет на образование первичной протоковой системы железы в эмбриональном периоде[55]. Гиперэкспрессия ПТГрП в молочной железе трансгенных мышей сопровождается развитием дефектов формирования протоковой системы при пубертации, а также лобулоальвеолярном развитии при беременности. Мутации, вызывающие инактивацию рецептора ПТГрП, приводят к развитию летальных форм карликовости, сопровождающихся отсутствием у плодов сосков и молочных желез[158].У мыши ПТГрП продуцируется в эпителиальных клетках эмбриональной молочной железы. ПТГрП взаимодействует с мезенхимальными клетками, экспрессирующими рецептор ПТГ/ПТГрП для образования плотной мезенхимы, которая поддерживает морфогенез железы и индуцирует эпидермальные структуры к образованию соска [175].В лактирующей молочной железе крысы ПТГрП экспрессируется в альвеолярных эпителиальных клетках и стромальных фибробластах, а рецептор ПТГ/ПТГрП – в альвеолярных эпителиальных клетках, стромальных фибробластах и миоэпителиальных клетках[58].
Экспрессирующиеся эпителием молочной железы RANKL и RANK-лиганд могут являться пара/аутокринными посредниками действия ПТГрП, пролактина и прогестерона. ПТГрП и пролактин повышают экспрессию RANKL. У мышей нокаунтных по RANKL или RANK имеет место недоразвитие лобулоальвеолярной системы при беременности.
ПТГрП у крысы экспрессируется миоэпителиальными и эпителиальными клетками с 14-дня беременности и во время лактации. Пептид поступает в кровоток и в молоко. В миоэпителиальных клетках человека ПТГрП ингибирует стимулирующий эффект окситоцина на кальций. Пептид стимулирует секрецию кальция с молоком и, вызывая вазодилатацию, повышает кровоток в молочной железе. ПТГрП находится в высоких концентрациях в грудном молоке и амниотической жидкости. В течении беременности его концентрация в кровотоке возрастает. Концентрация ПТГрП в крови пикомолярная, а в молоке - наномолярная, т.е. намного выше. Его физиологическая роль состоит в регуляции транспорта кальция из скелета матери и кровотока в развивающийся плод и грудное молоко [132]. Было установлено, что наиболее активно трансплацентарный транспорт кальция инициировали фрагменты ПТГрП (67-86) и (38-94) [23,170] .
Источником ПТГрП, контролирующим транспорт кальция от матери к плоду для минерализации скелета плода, является ткань плаценты [147].ПТГрП регулирует транспорт кальция от плаценты к плоду через рецептор, отличающийся от ПТГ/ПТГрП [78]. Исследование содержания N- и C- концевых доменов ПТГрП в молоке лактирующей женщины и изучение зависимости концентрации этого пептида от содержания кальция в молоке позволило предположить, что пептид в женском молоке участвует в поддержании лактации посредством его N-концевой области, а в переносе кальция в молоко задействован C-концевой домен[159].
Уровни ПТГрП значительно повышаются в молозиве [75].Содержание кальция и ПТГрП в молоке положительно коррелируют в период лактации[151,21].Во время кормления грудью акт сосания может стимулировать молочную железу, синтезировать и секретировать ПТГрП и способствовать транспорту кальция [96], что, по-видимому, регулируется CASR-геном. В современных экспериментальных исследованиях китайских ученых [180], посвященных изучению влияния ПТГрП на транспорт кальция в молочных железах использовали поликлональные антитела против этого белка. Результаты показали, что экспрессия ПТГрП в молочных железах была значительно выше, чем в других органах, что свидетельствует о важной роли пептида в регуляции функций молочных желез.
Современные знания о физиологической роли ПТГрП в почках весьма ограничены. Имеющиеся сведения демонстрируют роль этого белка в качестве фактора, регулирующего различные процессы, определяющие функционирование почек [36].В почках ПТГрП регулирует почечный кровоток и скорость клубочковой фильтрации, влияет на секрецию ренина [136], экскрецию кальция и фосфора, включая дистальную канальцевую реабсорбцию кальция и фосфатный транспорт проксимальных канальцев[42,36,35,113]. Введение PTГрП вызывало вазодилатацию всех прегломерулярных сосудистых сегментов, в том числе афферентных артериол и увеличение почечного кровотока [103]. Почечные эффекты PTГрП во многом определяются стимуляцией аденилатциклазы в почечных клетках. Часть внутриклеточного цАМФ, поступает в просвет почечных канальцев и выделяется как нефрогенная часть мочевого цАМФ. Циклический АМФ, по-видимому, опосредуют многие из клеточных ответов на PTHrP и в том числе фосфатурию. Этот ответ происходит с участием протеинкиназы А, а также протеинкиназой С-опосредованной интернализацией (тип II) Na+/РО4 котранспортера, что приводит к снижению реабсорбции фосфата [114].
PTГрП-индуцированная стимуляция реабсорбции кальция происходит преимущественно путем активного транспорта в трансцеллюлярной восходящей части петли Генле и в дистальных канальцах. Третий основной эффект PTГрП в почках состоит в его влиянии на активность почечной 1-альфа гидроксилазы. Внутривенное введение N-термального фрагментов PTГрП как животным так и человеку приводит к повышению содержания в сыворотке 1,25 (OH)2D [60]. Высокие уровни мРНК ПТГрП были найдены в собирательном канальце, и незрелых элементах клубочков. В противоположность этому, мРНК рецептора ПТГ/ПТГрП увеличена в связи с процессом созревания в развивающихся канальцах и клубочках [13]. ПТГрП участвует в паракринной регуляции клеток проксимальных канальцев [42].Эти данные свидетельствуют о роли ПТГрП в развитии почек.
Во взрослой почке, ПТГрП был идентифицирован с помощью иммуногистохимии в подоцитах клубочков [88], в проксимальных и дистальных отделах собирательных канальцев, в интраренальных артериальных сосудах, в том числе в афферентных и эфферентных артериолах, а также в плотном пятне [103,177].С помощью микродиссекции сегментов нефрона с использованием полимеразной цепной реакции, рецептор ПТГ/ПТГрП был обнаружен в извитых и прямых проксимальных канальцах, прямых восходящих отделах и в дистальных извитых канальцах у крысы и человека [177,88,87,129]. Кроме того, мРНК ПТГрП увеличивается, вместе со снижением экспрессии гена рецептора ПТГ/ПТГрП, в корковом веществе почки во время фазы восстановления после ишемического повреждения [149].Эти данные позволили предположить, что ПТГрП является аутокринная фактором, который может участвовать в процессах почечной регенерации [135].Современные данные подтверждают точку зрения, что ПТГрП можно рассматривать как фактор регуляции морфофункционального статуса почки, который может участвовать в регуляции почечного кровотока и скорости клубочковой фильтрации, ограничивая биологическую активность сократительных стимулов в стенке артериальных сосудах почек. Кроме того, ПТГрП, к тому же оказывает важное влияние на рост и развитие клеток почечных структур. Последующие исследования почечных эффектов этого белка, как фактора регулирующего функционирование этого органа, могут обеспечить новое понимание физиологии нормальной почки[36].
ПТГрП принадлежит существенная роль в процессе развития зубов. ПТГрП продуцируется в эпителиальном эмалевом органе, а его рецепторы обнаружены в костной ткани, окружающей развивающийся зуб, в зубном фолликуле и в цементобластах корня зуба [121,120,157]. PTГрП имеет решающее значение во внутрикостной фазе прорезывания зубов, где он действует в качестве сигнальной молекулы стимулирующей локальную резорбцию кости инициируя активность остеокластов в зоне прорезывания зубов, что способствует формированию пути для выдвижения зуба. Без PTГрП, костная ткань окружающая фолликул зуба не будет резорбироваться, и поэтому зуб не сможет расти[178].У мышей с блокадой секреции ПТГрП имело место нарушение прорезывания зубов в связи с формированием дефектного остеокластгенеза [123]. Результаты исследований на мышах получили подтверждение в наблюдениях на людях с нарушенной функцией ПТГрП-рецепторов и неправильным развитием зубов [173]. Показано [155], что снижение экспрессии ПТГрП в тканях челюсти связано с дефектами развития зубов и костной ткани челюсти, а повышениеэкспрессии этого белка нормализует процессы формирования тканей челюсти включая развитие зубов. Это рассматривается как модулирующее влияние ПТГрП на постнатальное развитие зубов и альвеолярной кости.
PTHrP высоко экспрессируется в коже и обладает способностью подавлять пролиферацию эпидермиса, оказывая влияние на процесс дифференциации кератиноцитов [166,40]. Эпидермальный фактор роста может усиливать образование ПТГрП в эпидермисе [27].ПТГрП участвует в паракринной регуляции цикла волосяного фолликула. Сверхэкспрессия ПТГрП сопровождается преждевременным прекращением фазы анагена и запуском фазы катагена в цикле развития волос [172]. В физиологических условиях высокий уровень продукции ПТГрП выявлен в конце фазы анагена. У трансгенных мышей, с гиперэкспрессией этого белка в коже имело место развитие алопеции, а введение животным антагониста ПТГрП приводит к увеличению количества волосяных фолликулов и вызывает усиленный рост волос.
Утверждается, что ПТГрП является паракринным регулятором сердечно-сосудистой системы, но многое в роли этого белка в физиологии и патофизиологии сердца и сосудов в значительной степени остается неизвестным [139].Установлено влияние ПТГрП на хронотропные и инотропные характеристики сердечной деятельности, а также на гладкие мышцы и эндотелий сосудов, что рассматривается как гомеостатическое действие пептида на сердечно-сосудистую систему [102]. Высокая продукция ПТГрП обнаружена в сосудах желудочков взрослого сердца, но не в кардиомиоцитах предсердий [138,28]. ПТГрП активирует протеинкиназу А взрослых кардиомиоцитов тем самым улучшая сократительную способность сердечной мышцы. В микрососудах сердца эндотелиальные клетки экспрессируют ПТГрП, но в отличие от кардиомиоцитов сами они не реагируют на пептид [140].
ПТГрП секретируется гладкими мышцами многих органов, как правило, в ответ на их растяжение. Физиологический эффект пептида состоит в расслаблении гладких мышц [152, 171].В исследованиях с использованием препаратов гладкомышечной ткани мочевого пузыря, матки, кишечника, желудка, артериальных сосудов была продемонстрирована роль ПТГрП, действующего как паракринный мышечный релаксант [100,124,128]. Активация протеинкиназы А в клетках гладких мышц сосудистой стенки сопровождается вазорелаксацией. Сверхэкспрессия ПТГрП в мускулатуре сосудов выявлена при развитии атеросклероза и состояниях, характеризующихся высоким артериальным давлением. ПТГрП рассматривается как локальный регулятор сосудистого тонуса у гипертензивных крыс [156]. Выявлено дозозависимое расслабление сократившихся под влиянием фенилэфрина препаратов аорты мыши при действии на них ПТГрП (1-34). Пептид также снижал спонтанную фазную активность препаратов портальной вены. Действие ПТГрП на расслабление аорты было опосредовано в основном эндотелием, но ответственный за расслабление компонент эндотелия был нечувствителен к ингибитору NO-синтазы, L-NNA и индометацину, но инактивировался тетрабутиламмонием. ПТГрП причастен к митоген-стимулируемой пролиферации клеток аорты. В клетках с нормальным функциональным циклом уровень этого белка значительно увеличивался в заключительной стадии клеточного цикла. Экспрессия ПТГрП в клетках аорты стимулируемая ангиотензином II происходит независимо от клеточного цикла и имеет отношение к вазодилятаторному эффекту белка [116].
ПТГрП, продуцирующийся в гладких мышцах, обеспечивает быстрое расслабление сосудистой сети [131]. Сосудосуживающий фактор ангиотензин II индуцирует быстрое образование ПТГрП в гладких мышцах [126], что рассматривается как ответная реакция на чрезмерное увеличение тонуса сосудов. Увеличение секреции ПТГрП может обеспечить механизм ограничения вазоконстрикции через релаксирующее действие на гладкую мышцу. Таким образом, происходит физиологическая паракринная регуляция местных сосудистых сетей при участии локально продуцируемого ПТГрП. У трансгенных мышей с высокой экспрессией ПТГрП в гладких мышцах развивается гипотония, обусловленная вазодилятацией,индуцированной пептидом. Повышенная экспрессия ПТГрП может чрезмерно активировать пролиферацию гладкомышечных клеток артериальных сосудов вплоть до формирования их стеноза [146]. Рост клеток гладких мышц сосудов связывают с интракринным механизмом действия пептида [154]. Во время беременности ПТГрП участвует в релаксации гладкой мускулатуры в матке, дилатации кровеносных сосудов в полости матки [28].
Вышеприведенные факты свидетельствуют, что PTHrP продуцируется во всех отделах сердечно-сосудистой системы, и взаимодействует с гладкомышечными клетками сосудов паракринным, аутокринным, и возможно даже интракринным образом [103], являясь сильнодействующим релаксантом гладких мышц в каждой исследованной ткани, в том числе клеток гладкой мускулатуры сосудов. Интересно отметить, что в этих тканях, экспрессия мРНК PTHrP и белка резко усиливается в ответ на механическое воздействие [126]. Показано, что сосудосуживающие биологически активные факторы, такие как ангиотензин II, серотонин и брадикинин заметно индуцируют экспрессию генов PTHrP в сосудистой сети, тогда как другие вазоактивные вещества, такие как предсердный натрийуретический пептид, нейрокинин и вещество Р не вызывают этого эффекта. Кроме того, ангиотензин II вызывает быстрое и временное повышение секреции PTHrP, что свидетельствует о непосредственных генетически обусловленных ответах в гладкомышечных клетках [126]. Кроме того, PTHrP ингибирует ангиотензин II-индуцированный рост клеток гладкой мускулатуры. Это свидетельствует о том, что локальная продукция PTHrP может служить в качестве противовеса модулятора сократительного и / или ростовых эффектов ангиотензина II, и, возможно, других сосудосуживающих средств. Таким образом, PTHrP может являться локальным фактором, ограничивающим или проявляющим антагонистическую биологическую активность, по меньшей мере, в отношении некоторых вазоконстрикторов в стенке артериальных сосудов.
ПТГрП способен активировать базальную секрецию кортикостероидов. В надпочечниках обнаружены рецепторы как к ПТГ, так и к ПТГрП [104,160].
Все три изоформы ПТГрП обнаружены в нормальной ткани предстательной железы при дифференциальной ПЦР-РВ. Дальнейший анализ с использованием в гибридизации экзон-специфических зондов показал, что все три изоформы ПТГрП присутствовали в нейроэндокринных клетках предстательной железы в которых они и продуцируются[65,169]. Методом ферментного коньюгирования с использованием моноклональных антител против N-терминального фрагмента (1-34) установлено присутствие ПТГрП в цитозоле эпителиальных клеток нормальной ткани простаты [65]. Было установлено, что локализация и продукция ПТГрП в простатических нейроэндокринных клетках может являться эндокринно-паракринным фактором, участвующим в росте и дифференциации ткани простаты[12].Зрелые формы ПТГрП могут оказать свое модулирующее воздействие на простатические эпителиальные клетки, а также участвовать в гомеостатической регуляции семенной жидкости человека[65].
В экзокринной части поджелудочной железы секреция PTHrP в ацинарных клетках очень низкая и нет сведений о его влиянии на функции экзокринной поджелудочной железы при базальных условиях. PTГрП продуцируется в панкреатических островках, где он увеличивает клеточную пролиферацию и секрецию инсулина, и ингибирует апоптоз, посредством СОК-опосредованного пути [164,112,25], а также влияет на увеличение внутриклеточного кальция в бета-клетках [164]. Кроме β-клетокПТГрП секретируется α-клетками, δ-клетками, а также эндокринными клетками, продуцирующими панкреатический полипептид [34]. Сверхэкспрессия ПТГрП, а также введение ПТГрП (1-36) увеличивают пролиферацию β-клеток посредством специфической активации клеточного цикла [76,168]. Избыточная экспрессия ПТГрП в β-клетках приводит к гиперплазии панкреатических островков и инсулинопосредованной гипогликемии, которая ассоциируется с снижением апоптоза β-клеток [25]. Этот эффект был также получен при введении экзогенного ПТГрП (1-36) и последующего увеличения секреции β-клетками инсулина.
ПТГрП и его рецепторы широко экспрессируются в центральной нервной системе, и, по всей видимости, влияют на выживание нейронов несколькими механизмами.
Как видно из приведенных выше примеров, ПТГрП оказывает глубокое воздействие на большое количество физиологических процессов. Новые исследования этого мультипотентного биологически активного фактора наверняка выявят дополнительные эффекты в этой сложной системе.
Научные достижения, связанные с исследованием ПТГрП, становятся предметом практических разработок в области медицины. Отмечается все возрастающий интерес к использованию физиологических эффектов ПТГрП в терапевтических целях. Это определяет активную разработку фармакологических субстанций на основе аналогов этого белка, а также его пептидных доменов и исследование возможности их применения в качестве лекарственных средств [99].
Биофармацевтическая компания «RadiusHealth» разработала фармпрепарат ВА058 (Abalaparatid), являющийся аналогом человеческого ПТГрП (1-34), который позиционируется как средство для лечения остеопороза и снижения риска переломов в критических анатомических участках скелета. Препарат прошел в 2014 году 3-ю фазу рандомизированных, двойных слепых плацебо и компаратор контролируемых клинических испытаний в рамках международного многоцентрового исследования в США, Великобритании, Индии, Аргентине[109]. Результаты испытаний зафиксировали высокую эффективность ВА058 в стимуляции роста и увеличения минеральной плотности костной ткани в шейке бедренной кости и в поясничном отделе позвоночника, значительно превосходящую влияние на костную ткань единственного разрешенного к применению в США препарата для лечения остеопороза – терипаратида (аналога паратгормона) [150,74].Другой аналог ПТГ-подобного пептида RS-66271(Семпаратид ацетат) был изучен в двух рандомизированных плацебо-контролируемых исследованиях по оценке влияния на минеральную плотность костной ткани у женщин с постменопаузальным остеопорозом. На фоне терапии семпаратидом биохимические маркеры костеобразования (сывороточный проколлаген пептида 1 типа, костная щелочная фосфатаза,остеокальцин) и резорбции (деоксипиридинолин и N-телопептид/креатинин в моче) продемонстрировали дозозависимое увеличение уже через три недели после начала лечения. Результаты исследования показывают, что ежедневное применение семпаратида при постменопаузальном остеопорозе приводит к быстрому и достоверному увеличению минеральной плотности костной ткани позвонков и бедренной кости, которое сохраняется через 6 месяцев после прекращения лечения [41]. По прогнозам экспертов фармацевтического рынка продажи аналогов ПТГ и ПТГрП достигнут к 2018 году объемов в 2,3 млрд долларов США и превысят объемы продажи бисфосфонатов.
В настоящее время ПТГрП рассматривается как один из ключевых регуляторов морфофункциональных, биохимических и патофизиологических процессов в организме[105]. Полимодальный спектр биологических, физиологических и биохимических свойств ПТГрП определил доминирующую в мировой научной литературе его характеристику как «все еще малоизученного белка». Мультипотентность этой уникальной биологически активной молекулы, по-видимому, будет предметом многочисленных исследований в последующие годы.