В настоящее время не вызывает сомнения, что для наиболее успешного решения современных вопросов, связанных с проблемами репродуктивной медицины, в том числе в области акушерства и перинатологии, необходимо привлечение высокотехнологичных методических подходов молекулярной биологии, в частности, постгеномных технологий. К таким технологиям относятся протеомные исследования, дающие представления о совокупности белков исследуемого объекта (протеоме) и позволяющие выяснить ранее неизвестные механизмы развития патологического процесса, а также создают качественно новые возможности для системных поисков его диагностических маркеров.
На протяжении последних десятилетий среди осложнений гестации, приводящих к перинатальной заболеваемости и смертности, важное место занимает плацентарная недостаточность (ПН) и преэклампсия. Однако, несмотря на большое число проведенных исследований, их патогенез остается недостаточно изученным [1,2]. В то же время именно модификация экспрессии таких полифункциональных молекул, как белки, играющие ключевую роль во всех клеточных процессах, может служить инициирующим фактором в сложной цепи нарушений, приводящих к развитию этих осложнений.
Поскольку развитие беременности связано с глубокими функциональными и метаболическими преобразованиями не только в организмах матери и плода, но и в плаценте, осуществляющей тесную взаимосвязь между ними, изучение последней может дать чрезвычайно ценную информацию о механизмах формирования акушерской патологии. Однако данные о протеомном составе плаценты при указанных акушерских патологиях неоднозначны.
В связи с вышеизложенным целью настоящей работы явилось изучение протеомного спектра плаценты при физиологической беременности, плацентарной недостаточности и преэклампсии.
Материал и методы исследования
В исследование были включены 53 женщины в возрасте от 23 до 32 лет (в среднем 25,2 ±0,4 года), составившие 3 группы. В 1-ю (контрольную) группу вошли 15 женщин с неосложненным течением беременности и родов, во 2-ю – 18 женщин с ПН, у 20 пациенток беременность осложнилась преэклампсией. Степень преэклампсии оценивали по международной классификации МКБ-10. По уровню артериального давления и протеинурии, наличию и степени отеков степень преэклампсии соответствовала коду О14.0 – преэклампсия (нефропатия) средней тяжести.
В 1-й группе 8 женщин были первобеременными и первородящими, у 7 имели место два и более прерывания беременности по желанию женщины. У 3 пациенток в анамнезе наблюдались воспалительные заболевания органов малого таза. Во 2-й группе были 8 первобеременных и первородящих, у 10 повторнобеременных и повторнородящих женщин имели место два и более прерывания беременности по желанию женщины. У 5 женщин в анамнезе отмечены воспалительные заболевания малого таза. В 3-й группе было 9 первобеременных и первородящих пациенток и 11 – повторнобеременных и повторнородящих. У 6 женщин отмечены воспалительные заболевания органов малого таза. По показаниям к оперативному родоразрешению со стороны плода у трех беременных с преэклампсией было произведено кесарево сечение. Самопроизвольные выкидыши у женщин обследованных групп отсутствовали. По возрасту, соматическому и акушерско-гинекологическому анамнезу пациентки были сопоставимы.
Материалом исследования служили плаценты, взятые сразу после родов при соблюдении холодового режима. Протеомные карты плацентарной ткани получали с помощью двумерного электрофореза в полиакриламидном геле (приборы Protein IEF Cell и Protean II xi Multi-Cell («Bio-Rad», США). После завершения электрофореза для визуализации белковых пятен в гелях фореграммы окрашивали азотнокислым серебром, сканировали и анализировали с использованием пакета программ PDQuest («Bio-Rad», США). Идентификацию белков после вырезания пятен из геля и процедуры трипсинолиза проводили методом времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF-MS) на масс-спектрометре Autoflex II («Bruker», Германия) с использованием программы Mascot MS Search (Matrix Science, Великобритания) и баз данных NCBI и Swiss-Prot.
Статистическую обработку данных протеомного анализа осуществляли с использованием лицензионного пакета программ Statistica (версия 6.0. фирмы StatSoft. Jnc.). Достоверность различий между сравниваемыми группами для каждого белка отличия определяли с помощью χ2-критерия. Результаты оценивали как статистически значимые при p<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Данные, полученные с помощью двухмерного электрофореза, свидетельствовали о том, что плацентарная ткань характеризовалась широким спектром белков (до 250 фракций) с границами молекулярных масс от 15 до 115 кДа и диапазоном изоэлектрических точек от 3,0 до 10,0. Масс-спектрометрический анализ позволил идентифицировать белки с различными свойствами, обеспечивающими возможность многосторонней регуляции функционирования плаценты. Результаты исследования представлены в виде таблиц, включающих идентифицированные белки отличия, характерные преимущественно для одной из обследованных групп женщин, с указанием их молекулярных масс, изоэлектрических точек и номеров в базе данных Swiss-Prot (табл. 1, 2).
Таблица 1
Белки плаценты, идентифицированные при физиологически протекающей беременности и плацентарной недостаточности
|
№ № |
Название белка |
№ в базе Swiss-Prot |
Mm, кДа |
pI |
Физ. бер. |
ПН |
p |
|
1. |
α-актинин-4 (alpha-actinin-4) |
Q43707 |
105,4 |
5,2 |
– |
+ |
<0,005 |
|
2. |
Виментин (Vimentin) |
P08670 |
53,7 |
4,4 |
– |
+ |
<0,005 |
|
3. |
Ингибитор диссоциации Rab (Rab GDP dissociation inhibitor β) |
P50395 |
50,6 |
6,1 |
+ |
– |
<0,005 |
|
4. |
Цитратсинтаза митохондриальная (Citrate synthase, mitochondrial) |
O75390 |
38,0 |
7,0 |
+ |
– |
<0,005 |
|
5. |
Кислый рибосомальный белок 60S (60S acidic ribosomal protein P0) |
P05388 |
34,2 |
5,6 |
+ |
– |
<0,005 |
|
6. |
Тропомиозин β (Tropomyosin beta) |
P07951 |
32,8 |
5,1 |
– |
+ |
<0,005 |
|
7. |
Актин-подобный белок 2 (actin-related protein subunit 2) |
P61160 |
31,7 |
5,2 |
+ |
– |
<0,005 |
|
8. |
Диенол-КоА-изомераза митохондрий (d(3.5)-d(2.4)-Enoyl-CoA-isomerase, mitochondrial) |
Q13011 |
30,1 |
6,9 |
+ |
– |
<0,005 |
|
9. |
Прохибитин (Prohibitin) |
P35232 |
29,8 |
5,1 |
+ |
– |
<0,005 |
|
10. |
Эндоплазматический ретикулярный белок ERp29 (Endoplasmic reticulum protein ERp29) |
P30040 |
29,0 |
5,2 |
+ |
– |
<0,005 |
|
11. |
Аннексин А2 (Annexin A2) |
P07355 |
28,0 |
7,0 |
+ |
– |
<0,005 |
Примечание. Здесь и далее: «+» – присутствие белка, «–» – отсутствие белка.
Сопоставление белкового состава плаценты при нормальной и осложненной беременности выявило различную частоту обнаружения ряда белков. При ПН среди белков, экспрессия которых была резко снижена или полностью отсутствовала при патологически протекающей гестации, большое значение в регуляторных процессах имеют следующие: шапероны ERp 29 и прохибитин, ингибитор диссоциации Rab, актин-2, аннексин А2, митохондриальные цитратсинтаза и диеноил-КоА-изомераза, кислый рибосомальный белок 60S. Значительное уменьшение при ПН содержания указанных белков, участвующих в энергетическом обмене, окислительно-восстановительных реакциях, процессах межклеточного транспорта, может изменить метаболическую полноценность плаценты и гомеостаз во всей системе мать-плацента-плод.
Так, многофункциональный белок прохибитин, расположенный, преимущественно, на внутренней мембране митохондрий – шаперон этих субклеточных фракций, где он регулирует клеточный цикл. Кроме того, являясь потенциальным опухолевым супрессором, этот белок действует как мощный транскрипционный модулятор a-рецептора эстрогена, что особенно важно для плацентарной ткани [3].
Таблица 2
Белки плаценты, идентифицированные при физиологически протекающей беременности и преэклампсии
|
№ № |
Название белка |
№ в базе Swiss-Prot |
Mm, кДа |
pI |
Физ. бер. |
Пре экламп сия |
p |
|
1. |
Эндоплазмин (Endoplasmin) |
P14625 |
92,4 |
4,9 |
– |
+ |
<0,005 |
|
2. |
Аконитаза митохондриальная (Aconitate hydratase, mitochondrial) |
Q99798 |
85,4 |
7,9 |
– |
+ |
<0,005 |
|
3. |
Митохондриальный белок теплового шока 60кД (60 kDa heat shock protein, mitochondrial) |
P10809 |
61,0 |
4,8 |
– |
+ |
<0,005 |
|
4. |
Актин цитоплазматический-1 (Actin cytoplasmic 1) |
P60709 |
41,7 |
5,2 |
+ |
– |
<0,005 |
|
5. |
Аннексин А4 (Annexin A4) |
P09525 |
32,9 |
5,4 |
+ |
– |
<0,005 |
|
6. |
Тропомиозин α (Tropomyosin alpha) |
P09493 |
32,7 |
4,2 |
+ |
– |
<0,005 |
|
7. |
Пероксиредоксин-4 (Peroxiredoxin-4) |
Q13162 |
30,8 |
5,2 |
– |
+ |
<0,005 |
|
8. |
Белок 14-3-3 эпсилон (14-3-3 protein e) |
P62258 |
29,2 |
5,8 |
– |
+ |
<0,005 |
|
9. |
Субъединицa 2 комплекса актин-подобного белка 2/3 (actin-related protein 2/3 complex subunit 2) |
O15144 |
28,3 |
6,9 |
+ |
– |
<0,005 |
|
10. |
α субъединица 6 типа протеосомы (Proteasome subunit a type 6) |
P60900 |
27,4 |
6,4 |
+ |
– |
<0,005 |
Примечание. Здесь и далее: «+» – присутствие белка, «–» – отсутствие белка.
Отсутствие прохибитина приводит также к повышению чувствительности к стимулам, вызывающим апоптоз и увеличение генерации активных форм кислорода, что сопровождается внутриклеточной гипоксией и развитием окислительного стресса, характерного для развития ПН. Уменьшение продукции при ПН еще двух белков, связанных с митохондриальными структурами – цитратсинтазы и диенол-КоА-изомеразы, ухудшает функционирование этих важных субклеточных органелл и приводит к уменьшению генерации энергии в клетках плаценты.
Важное значение в развитии ПН, по-видимому, играет снижение содержания эндоплазматического ретикулярного белка ERp29, который служит ключевым фактором в фолдинге эндогенных секреторных белков [9]. Уменьшение продукции данного белка модифицирует функции протеасом и степень клеточной пролиферации.
К числу белков, экспрессия которых практически отсутствует или значительно снижена при ПН, относится аннексин А2 – представитель группы аннексинов, локализованный как на плазматической мембране, так и в цитоплазме, и контролирующий связи между ними, что позволяет ему регулировать внутри- и межклеточный транспорт биосубстратов. Известна и роль этого белка в формировании цитоскелета [5]. Падение продукции в плаценте при ПН установлено также для кислого рибосомального белка 60S, который участвует в контроле над процессами трансляции. Приведенные функции вышеуказанных белков отличия подтверждают возможность развития гомеостатического дисбаланса при их значительном снижении или отсутствии.
Наряду с отсутствием ряда белков при ПН установлено появление дополнительных полипептидов. К их числу относится a-актинин-4. Этот цитоскелетный белок опосредованно участвует в передаче клеточных сигналов из цитоплазмы в ядро, способствуя увеличению экспрессии генов, усиливающих апоптоз (4). Повышенно экспрессируются при ПН белки цитоскелета – виментин и β-тропомиозин. Виментин представляет собой белок, отвечающий за сохранность структуры клетки, участвующий во взаимодействиях различных систем цитоскелета и мембранном транспорте. β-тропомиозин в комплексе с другими белками также принимает участие в формировании структуры и функционировании цитоскелета. Поэтому увеличение их продукции может иметь компенсаторное значение. Однако усиление экспрессии этих протеинов не компенсирует отрицательные последствия подавления продукции большого количества мультифункциональных белков, что создает условия для развития ПН и перинатальных осложнений.
Протеомный анализ плаценты при беременности, осложнившейся преэклампсией, в отличие от физиологической беременности, выявил отсутствие пяти белков. В их числе следует отметить цитоплазматический актин 1, субъединицу 2 комплекса Arp 2/3 (actin-related protein – актин-подобный белок), которая, соединяясь с другими структурными полипептидами, составляет центральное звено в передаче ряда внеклеточных сигналов, в том числе сигнала, вызывающего ядерную полимеризацию актина [8]. В свою очередь, поскольку немышечные изоформы актина находятся в цитоплазматических структурах в виде микрофиламентов, участвующих в переносе внешнего сигнала с поверхности клетки в ядро, то уменьшение их продукции приводит к нарушению внутриклеточного транспорта.
Определенный вклад в указанные процессы вносит снижение содержания a-тропомиозина. Он способен связываться с актиновыми филаментами, обеспечивая тем самым миграцию клеток и цитокинез [6]. Еще два белка, экспрессия которых уменьшается при преэклампсии – a субъединица 6 типа протеосомы, ответственная за интенсивность катаболической фазы плацентарного метаболизма и аннексин А4. Последний, подобно аннексину А2, снижающемуся при ПН, участвует в трансмембранных переходах и моделировании цитоскелета [7].
Развитие преэклампсии сопровождается также появлением дополнительных белков отличия. Повышение экспрессии митохондриальной аконитатгидратазы и пероксиредоксина-4, очевидно, играет значительную роль в изменении свободнорадикальных процессов и редокс-статуса плаценты, что является важной составляющей развития окислительного стресса, отмеченного при прогрессировании преэклампсии. Появление белка 14-3-3 эпсилон приводит к усилению апоптоза путем влияния на активность трансформирующего фактора роста-β и фактора некроза опухоли-a [10]. Установленная повышенная продукция митохондриального белка теплового шока 60кД и эндоплазмина, контролирующих процессы ремоделирования нативного состояния белков, может в какой-то степени иметь компенсаторный характер в поддержании корректного фолдинга ряда регуляторных белков.
Выводы
Резюмируя полученные данные, можно заключить, что развитие осложнений беременности происходит на фоне изменения плацентарной продукции ряда регуляторных белков, ответственных за дифференцировку, пролиферацию клеток, апоптоз, редокс-статус, обладающих антиоксидантными свойствами, функциями шаперонов и трансдукторов клеточной сигнализации. Сравнительный анализ результатов исследования при ПН и преэклампсии выявил определенные отличия в протеомном спектре плаценты при этих акушерских патологиях. Поскольку именно белки осуществляют информационную программу клеток, полученные данные позволяют расширить наши представления о молекулярных механизмах развития ПН и преэклампсии, а идентифицированные белки отличия могут служить объективными диагностическими маркерами этих акушерских патологий.