Учитывая тот факт, что показатель летальности от закрытых травм печени в России и в других Европейских странах, в том числе в Дании, Германии, Швейцарии, составляет 31,6–46,8 %, вопрос об ускорении регенеративных способностей печени с каждым годом остается очень актуальным [5, 8].
Высокую смертность можно объяснить тяжестью состояния пострадавших, у которых чаще всего наблюдается шок и в анамнезе имеется большая кровопотеря и другие сочетанные повреждения [2].
Частота послеоперационных осложнений встречается у 20–80 % пациентов [1]. Среди осложнений наиболее часто отмечаются: интраоперационные кровотечения, расстройства кровоснабжения и желчеоттока в остающихся отделах паренхимы печени, гидроторакс, развитие гнойных осложнений, желчных перитонитов, острой печеночной недостаточности и другие осложнения, вызванные высокой ксенобиотической нагрузкой компонентов общего наркоза [2].
Послеоперационные осложнения зависят также и от вида оперативного вмешательства [6].
Снижение послеоперационной летальности и восстановительного периода является приоритетным направлением для многих Российских медицинских центров.
Установлено, что регенеративный процесс очень энергозатратный. Известно, что синтез АТФ в клетках осуществляется в митохондриях при участии большого количества различных белков. Однако не всегда представляется изучить весь сектор белков. Именно благодаря исследованию показателя общего белка можно более правильно оценить состояние органа и, как следствие, в будущем правильно сбалансировать дальнейший лечебно-восстановительный процесс.
Цель работы: установить циркадианные колебания общего белка в гепатоцитах печени крыс на 3-е, 5-е и 7-е сутки после механической травмы органа.
Материалы и методы. Объектом исследования послужили 288 беспородных крыс средним весом 180±5 грамм, в возрасте 90 суток. Все животные содержались в стандартных условиях вивария. Выведение животного из эксперимента осуществлялось в первые минуты каждого часа.
Животные были разделены на 4 группы:
Контрольная группа – характеристика циркадианного ритма общего белка в гепатоцитах (72 крысы – самцы).
Экспериментальная группа № 1, 2, 3 – характеристика циркадианного ритма общего белка в гепатоцитах после механической травматизации органа на 3-е, 5-е, 7-е сутки, соответственно (по 72 крысы – самцы).
Каждое лабораторное животное помещали в специализированную камеру, вводили в медикаментозный сон с помощью эфирного наркоза в дозе 1 мл/180 гр, далее фиксировали на специализированном устройстве и приступали к эксперименту [7].
Протокол всей экспериментальной работы был составлен в соответствии с принципами биоэтики, с приказом МЗ РФ № 267 от 19.06.2003, «Об утверждении правил лабораторной практики»; правилами лабораторной практики (GLP) и одобрен этическим комитетом [3; 4].
У всех животных после выведения их из эксперимента брали участок печени для изготовления микропрепаратов. После фиксации в жидкости Бродского заливали по стандартной методике. Срезы толщиной 3–5 мкм изготавливали с помощью микротома МС2 – ТУ 64-1-1628-72. Далее проводилась окраска срезов в красителях, необходимых для анализа – гематоксилин и эозин по ван Гизону и гистохимическая окраска прочным зеленым при pH 2,2.
Животным экспериментальных групп осуществлялась хирургическая манипуляция, направленная на травматизацию органа анатомическим методом резекции: срединная лапаротомия. Повреждение органа осуществлялось скальпелем. Разрез проводился в V сегменте печени длиной 10 мм, глубиной 4 мм. После травматизации на печень накладывались узловые швы и послойно зашивались ткани. Выводили животное из наркоза и помещали в виварий. На 3-е, 5-е и 7-е сутки после механической травмы проводилось полное выведение крыс из эксперимента.
С помощью комплекса «Морфолог» проводилось количественное определение общего белка в контрольной и экспериментальных группах. Концентрация белка определялась в 300 гепатоцитах в цитоплазме клетки.
Все полученные материалы обрабатывались на персональном компьютере с помощью программ "Microsoft Office Windows 2007", " Microsoft Office Excel 2007".
Результаты и обсуждения. В ходе данной работы выявлены следующие колебания общего белка (табл. 1).
Таблица 1
Уровень показателя белка в гепатоцитах
Время суток |
Количество общего белка |
|||
Контрольная группа |
3-е сутки после механической травмы |
5-е сутки после механической травмы |
7-е сутки после механической травмы |
|
00.00 |
4802±15 |
6264±11 |
6137±21 |
6004±14 |
01.00 |
4758±14 |
6319±07 |
6254±13 |
6167±11 |
02.00 |
4697±22 |
6412±07 |
6341±18 |
6219±06 |
03.00 |
4648±08 |
6499±13 |
6412±11 |
6314±23 |
04.00 |
4601±09 |
6557±15 |
6506±17 |
6453±12 |
05.00 |
4580±10 |
6647±11 |
6587±15 |
6528±09 |
06.00 |
4547±09 |
6701±07 |
6631±18 |
6594±11 |
07.00 |
4494±14 |
6777±24 |
6708±16 |
6634±14 |
08.00 |
4450±12 |
6825±13 |
6796±14 |
6701±22 |
09.00 |
4403±07 |
6978±19 |
6909±12 |
6783±12 |
10.00 |
4363±10 |
7034±15 |
7000±17 |
6957±13 |
11.00 |
4320±12 |
7294±17 |
7270±13 |
7244±11 |
12.00 |
4222±11 |
7390±18 |
7371±20 |
7325±08 |
13.00 |
4348±14 |
7263±16 |
7254±13 |
7232±14 |
14.00 |
4421±12 |
7088±09 |
7001±17 |
6912±24 |
15.00 |
4498±11 |
7001±11 |
6930±13 |
6844±04 |
16.00 |
4528±11 |
6924±12 |
6881±15 |
6816±10 |
17.00 |
4565±08 |
6853±17 |
6709±18 |
6741±23 |
18.00 |
4603±16 |
6750±13 |
6687±12 |
6604±07 |
19.00 |
4647±17 |
6661±10 |
6598±19 |
6511±17 |
20.00 |
4706±07 |
6584±14 |
6503±12 |
6415±13 |
21.00 |
4732±14 |
6493±19 |
6411±18 |
6327±16 |
22.00 |
4763±12 |
6412±16 |
6317±14 |
6213±27 |
23.00 |
4834±13 |
6303±17 |
6218±16 |
6127±19 |
Проводя анализ данных таблицы 1, нельзя не обратить внимание на обратную зависимость между значениями показателей в группах. Min показатель белка в контрольной группе приходится на полдень и составляет 4222±11 усл. ед. В экспериментальных группах в это время наблюдается всплеск активации регенеративных показателей -max значение 7390±18, 7371±20 и 7325±08 усл. ед. В 23 часа в контрольной группе наблюдается max значение, оно составляет 4834±13 усл. ед., в экспериментальных группах наблюдается min в 24 часа – 6264±11, 6137±21 и 6004±14 усл. ед., соответственно, в группах № 1, № 2, № 3.
Установив этот факт, можно сделать вывод, что в дневные часы, когда наблюдается функциональный спад работы органа, регенеративные процессы у животных протекают медленнее, чем у крыс, получивших повреждение в часы активности.
Из данных также видно, что почти равные значения наблюдаются на 3-е сутки в 3 и 21 час и составляют 6499±13 усл. ед. и 6493±19 усл. ед, соответственно. Абсолютно равное значение соответствует 2 и 22 часам и составляет 6412 усл. ед.
Статистическая обработка данных о количественном колебании общего белка на 3-е сутки после механической травмы печени, согласно таблице 1, выявила, что средняя арифметическая величина – М составляет 6751 усл. ед., среднеквадратическое отклонение – σ составляет 316 усл. ед., а средняя ошибка средней арифметической величины – m равно 3,22. В интервале М±3σ находится 100 % всех вариант ряда. Данное процентное соотношение показывает абсолютную достоверность данных.
Среднее отличие между уровнем белка в двух группах составляет 2187 ус. ед. Max отличие приходится на 12 часов и составляет 3169 усл. ед., min 1463 усл. ед. зарегистрировано в 24 часа. Почти равные значения отклонений наблюдались в 10 и 14; 7 и 17 часов.
Замечено, что в среднем за один час в экспериментальной группе № 1 количество общего белка изменялось на 93 усл. ед., max значение наблюдается между 10 и 11 часами и составляет 260 усл. ед., min значение соответствует промежутку времени между 23 и 24 часами и составляет 39 усл. ед. Также высокий скачок колебания общего белка наблюдается между 8 и 9 часами и составляет 153 усл. ед., между 13 и 14 часами – 175 усл. ед. и между 12 и 13 часами 126 усл. ед. Абсолютное равное изменение значений наблюдается между 15 и 16, 19 и 20 часами, и соответствует 77 усл. ед.
Изучая колебания общего белка в гепатоцитах печени на 5-е сутки после оперативного вмешательства, видно, что среднее значение показателя разницы каждого часа на 5-е сутки после операции составляет 103 усл. ед., минимальное изменение зафиксировано между 5 и 6 часами и составляло 44 усл. ед., максимальное значение зафиксировано с 10 до 11 и составляет 270 усл. ед. Высокое значение разницы зафиксировано также в интервале времени между 13 и 14 часами, оно составляет 253 усл. ед. Абсолютное равное изменение значений наблюдается между 2 и 3, 14 и 15 часами, и соответствует 71 усл. ед., а также между 4 и 5, 21 и 15 часами, составило 94 усл. ед.
Приблизительные равные средние показатели общего белка в контрольной группе наблюдаются в 4 и 18 часов и составляют 4602±10 и 4604±17 усл. ед., соответственно, а также в 7 и 15 часов – 4493±15 и 4499±10 усл. ед., соответственно.
Проведя анализ на достоверность данных по критерию правила «трех сигм», выяснено, что средняя арифметическая величина – М составляет 6689 усл. ед., среднеквадратическое отклонение – σ составляет 335 усл. ед., а средняя ошибка средней арифметической величины – m равно 3,42. В интервале М±3σ находится 100 % всех вариант ряда. Исходя из этих данных, можно сделать вывод, что данное процентное соотношение показывает абсолютную достоверность данных.
Средняя арифметическая величина – М в экспериментальной группе №3 составляет 6611 усл. ед., среднеквадратическое отклонение – σ составляет 355 усл. ед., а средняя ошибка средней арифметической величины – m равно 3,31. В интервале М±3σ находится 100 % всех вариант ряда. Данное процентное соотношение показывает абсолютную достоверность данных.
Рис. 1. Показатель разницы снижения колебаний общего белка
Анализируя рис. 1, видно, что самый медленный восстановительный процесс наблюдается в интервале времени между 10 и 12 часами, в частности, в 12 часов разница между количеством общего белка составила всего 9 и 22 усл. ед., между 3 и 5; 5 и 7 сутками, соответственно.
Рис. 2. Общий показатель разницы снижения колебаний общего белка
Изучая рис. 2, заметно, что самый интенсивный восстановительный процесс наблюдается в 23 часа, когда количество общего белка составило 260 усл. ед. Интенсивность восстановления также наблюдается в 21, 22, 1,2 и 8 часа и составляют 199, 176, 193, 195 усл. ед., соответственно. Также заметно, что в период с 15 до 23 идет тенденция к росту показателя противовоспалительного эффекта. Min приходится на 10 и 12 часов, 50 и 31 усл. ед., соответственно.
Выводы:
- Активность работы гепатоцитов в норме у крыс наблюдается к 23 часам.
- После полудня начинается постепенная активация синтетических процессов в гепатоцитах, максимальный уровень содержания общего белка достигается в 23 часа.
- Механическая травматизация, как один из мощнейших стрессовых факторов, вызывает смещение циркадианных колебаний общего белка в гепатоцитах.
- Регенеративные процессы активируются более быстрее, если травматизация органа происходила в момент его гиперактивности.
- В период с 10 до 12 утра наблюдается самый неблагоприятный промежуток времени для восстановительного процесса в печени.
- Выбор времени проведения оперативного вмешательства на печени может способствовать ускорению восстановительного процесса и, как следствие, снижению количества койка-дней пребывания в стационаре.