Cорбиновая кислота (СБК) 2,4 гексадионовая кислота (СН3СН=СНОН=СНСОН) является природным противомикробным веществом. Впервые СБК была получена в 1859 году из рябинового сока Миллером (Германия) и несколько месяцев спустя независимо от него Гуддингом (США). В 1950 году она была синтезирована и установлено её высокое бактериостатическое и фунгистатическое действие, после чего она в возрастающих масштабах стала применяться как консервант пищевых продуктов. По основному характеру антиметаболического действия СБК связана с функциями КоА, катализирующего более 130 биохимических реакций, с которым она образует трудно метаболизируемый сорбил-КоА [11].
Поэтому по сравнению с другими антимикробными средствами СБК имеет весьма широкий спектр действия на микробные организмы. Это обусловлено её механизмом действия с охватом важных метаболических и ростовых процессов, с изменением структуры клеточных мембран, ингибированием транспортных систем и клеточных ферментов, потоком протонов в клетку и изменением pH внутренней среды [12]. Также установлено, что СБК конкурентно подавляет энолазу, предотвращая ферментацию глюкозы у дрожжей Saccharomyces cerevisiae [9].
Важным моментом основы механизма антиметаболического действия СБК является блокирование сульфгидрильных ферментов. СБК вызывает ингибирование активности фермента фумаразы, которое снижается добавлением в среду цистеина. Известно, что фумараза из винных дрожжей Pichia memranaefaciens содержит в активном центре имидазольную группу гистидина с SH-группой цистеина [4], и которая обнаружена как в митохондриях, так и в цитозоле клеток животных тканей. СБК тормозит также аспартазу и сукцинатдегидрогеназу, действие которой снижалось также добавлением тиола, что подтверждает механизм её действия против сульфгидрильных ферментов или кофакторов, которое обусловлено реакцией присоединения тиола с насыщением её двойных связей [10].
Все выше сказанное свидетельствует, что СБК является полифункциональным ингибитором с антиметаболическим действием.
Такой широкий спектр антиметаболического действия СБК, взаимодействующей с большим количеством важнейших ферментов, и особенно с КоА, вызывает значительный интерес к расширению исследований характера действия СБК и на растениях, как модели иной формы метаболизма клеток и растения в целом, на которых исследований крайне мало.
Целью наших исследований было изучение действия СБК на ключевые физиологические и метаболические процессы высших растений: энергию прорастания семян, их всхожесть, рост проростков, синтез хлорофилла и дыхание пшеницы и риса.
Материал и методы исследований
Изучали действие синтетической сорбиновой кислоты на проростки пшеницы (Triticum aestivum L.) и риса (Oriza sativum L.). Семена изучаемых культур стерилизовали 5%-ной перекисью водорода в течение 30 мин, раскладывали по 30 штук в чашках Коха на бумажную фильтровальную подложку и заливали 10 мл дистиллированной воды (контроль) и в опытные варианты растворы сорбиновой кислоты с концентрацией 50; 100; 200 и 400 мг/л. Семена проращивали в термостате при температуре 27 °С. Энергию прорастания в % определяли на 3-и сутки по количеству проросших семян, всхожесть в % – на 7-е сутки подсчетом всех проросших и наклюнувшихся семян. Сразу после этого выставляли проростки на свет под лампы ДРЛ -250 и через 24 часа определяли содержание хлорофилла в зеленеющих листьях в спиртовой вытяжке колориметрическим методом [7] c помощью электроколориметра КВК-2мП, с красным светофильтром длиной волны 670 нм, и рассчитывали по калибровочной кривой в мг на 1 г сырого веса. Интенсивность дыхания определяли методом Варбурга по количеству поглощенного кислорода в мкл 7-дневными проростками и пересчитывали на 1 г растительной массы за 1 час [3]. Рост корня и надземной части в мм измеряли на 10-е сутки у 10 растений каждого варианта и повторности. Повторность всех вариантов и биохимических определений трёхкратная. Результаты всех вариантов обрабатывали статистически с вычислением средней арифметической и стандартной ошибки опыта [6].
Результаты и их обсуждение
СБК оказала подавляющее действие как на энергию прорастания, так и на всхожесть семян обеих культур, соответственно возрастающим концентрациям. Однако пороговая концентрация 100 мг/л действует на эти процессы у пшеницы и риса по-разному. Оказалось, что в этой концентрации подавляющее действие СБК на энергию прорастания и всхожесть семян риса значительно слабее. Если у пшеницы энергия прорастания подавлялась на 43%, а всхожесть на 43,4%, то у риса подавление составило всего 17,4% и 12% соответственно.
Но уже в концентрации 200 мг/л тормозящее действие СБК на обеих культурах на эти процессы сравнялось и было в пределах для пшеницы соответственно 51,5% и 50% и для риса 57,6% и 55,5%, тогда как 400 мг/л вызывали у них полное подавление (табл. 1).
Стоит обратить внимание на пониженную чувствительность прорастающих семян риса к действию пороговой концентрации СБК. Мы считаем, что это может быть связано с биологическими особенностями риса. Установлено, что прорастание семян риса происходит при значительно низкой потребности в содержании кислорода, чем семян пшеницы. Семена риса легко прорастают при строжайшем исключении кислорода из среды [2]. Можно предположить, что для активного действия СБК необходимы реакции, зависящие от присутствия кислорода.
Таблица 1
Влияние сорбиновой кислоты на энергию прорастания и всхожесть семян пшеницы и риса
Сорбиновая кислота, мг/л |
Пшеница |
Рис |
||||||
Энергия прорас-тания, % |
Всхожесть, % |
% торможения |
Энергия прорас-тания, % |
Всхожесть, %
|
% торможения |
|||
Энергия прорастания |
Всхожесть |
Энергия прорас-тания |
Всхожесть |
|||||
0 |
58,4 |
60,0 |
0 |
0 |
97,0 |
98,0 |
0 |
0 |
100 |
29,6 |
34,0 |
43,0 |
43,4 |
80,2 |
81,2 |
17,4 |
12,0 |
200 |
28,3 |
30.0 |
51,5 |
50,0 |
60,5 |
63,4 |
57,6 |
55,5 |
400 |
0,9 |
0,0 |
98,5 |
100 |
0,6 |
98,6 |
99,6 |
99,4 |
Более эффективное ингибирующее действие СБК отмечено после прорастания и начала ростовых процессов корней и листьев проростков, сохраняя в определенной степени специфичное действие в отношении разных культур (табл. 2).
Таблица 2
Влияние сорбиновой кислоты на рост органов 10-дневных проростков пшеницы и риса
Сорбиновая кислота, мг/л |
Рост органов проростков |
|||||||
Пшеница |
Рис |
|||||||
Корень, мм |
Тормо- жение, % |
Листья, мм |
Тормо-жение, % |
Корень, мм |
Тормо- жение, % |
Листья, мм |
Тормо- жение, % |
|
0 |
91,3±2,3 |
0 |
86,6±4,1 |
0 |
72,4±3,3 |
0 |
47,5±2,1 |
0 |
100 |
39,5±1,2 |
56.7 |
84,4±3,5 |
2,5 |
38,6±1,4 |
46.7 |
43,8±2,7 |
7.9 |
200 |
23,4±0,8 |
74.4 |
53,8±2.0 |
37,9 |
15,7±0,8 |
78.3 |
45,6±2,2 |
4,0 |
400 |
0,0 |
100 |
0,0 |
100 |
0,0 |
100 |
0,0 |
100 |
Особенно активно проявляется тормозящее действие СБК на гетеротрофные корни практически одинаково как у пшеницы, так и риса, которое составило при концентрации СБК 100 и 200 мг/л соответственно у пшеницы 56,7% и 74,4% и у риса 46,7% и 78,3%. А вот листья обеих культур оказались более устойчивы к этим концентрациям. Рост листьев пшеницы снизился только в концентрации 200 мг/л на 37,9%, тогда как у риса в этих концентрациях тормозящее действие практически не наблюдалось. Однако концентрация СБК 400 мг/л оказалась токсичной для всех органов проростков пшеницы и риса, рост полностью отсутствовал, а проклюнувшиеся зачаточные корешки отмирали. Такой характер чувствительности прорастающих семян и роста органов проростков, особенно корней, можно объяснить особенностями прорастания семян. Известно, что первоначальное проклевывание прорастающих семян обусловлено увеличением сформированного зародыша не за счет новообразования в осевых органах, а за счет гидролитических процессов в эндосперме и возрастающего осмотического давления в клетках зародыша, которые насыщаются водой с образованием и увеличением вакуолей, растягивающих эластичные клеточные стенки зародышевых корешков.
Дальнейший рост корня связан с активацией метаболических процессов и новообразованием клеток и клеточных структур с участием ферментов и конечно КоА. А так как СБК является антагонистом КоА – это обеспечивает её активное ингибирующее действие, которое позволяет сделать вывод, что антиметаболическое действие СБК проявляется в активно метаболизирующих клетках.
Специфический характер действия СБК как антагониста КоА четко проявился на процессах синтеза хлорофилла и дыхания проростков пшеницы и риса.
Известно, что КоА принимает непосредственное участие в синтезе хлорофилла, превращая низкомолекулярные соединения ацетата, гликокола или глутамата с образованием в биохимическом цикле предшественника хлорофилла аминолевулиновой кислоты, скорость образования которой лимитирует весь процесс синтеза хлорофилла [1]. В связи с этим наблюдается сходство характера действия СБК на образование хлорофилла при зеленении листьев пшеницы и риса в течение суток на свету с характером действия на ростовые процессы этих культур.
Влияние СБК на синтез хлорофилла по характеру действия был совершенно аналогичным как в листьях пшеницы, так и в листьях риса. В низкой концентрации порядка 50 мг/л наблюдалось заметное стимулирование образования хлорофилла в листьях пшеницы и риса на 25,0% и 20,6% соответственно, что можно объяснить ответной реакцией на биохимический стресс. Более высокие концентрации 100 и 200 мл/л уже вызвали заметное торможение синтеза хлорофилла обеими концентрациями в листьях пшеницы (12,5%), тогда как у риса торможение в этих концентрациях было незначительно, в пределах ошибки опыта (2% и 5%). А вот при максимальной концентрации порядка 400 мг/л синтез хлорофилла в листьях пшеницы и риса подавлялся полностью (табл. 3).
Таким образом, СБК как ингибитор КоА через образование трудно метаболизируемого сорбил-КоА исключает КоА из метаболических процессов, связанных с синтезом предшественника хлорофилла.
Таблица 3
Влияние сорбиновой кислоты на образование хлорофилла в зеленеющих листьях проростков пшеницы и риса
Сорбинова кислота, мг/л |
Содержание хлорофилла в мг на 1 г сырого веса листа |
|||
пшеница |
рис |
|||
мг/г |
% торможения |
мг/г |
% торможения |
|
0 |
1,20±0,03 |
0 |
1,02±0,04 |
0 |
50 |
1,50±0,07 |
+ 25,0 |
1,23±0,05 |
+ 20,6 |
100 |
1,05±0,02 |
12,5 |
1,00 ±0,02 |
2.0 |
200 |
1,05±0,02 |
12,5 |
0,97±0,02 |
5,1 |
400 |
0 |
100 |
0 |
100 |
Это согласуется с влиянием СБК и на процесс дыхания, которое имеет совершенно одинаковый характер действия, что может указывать на сходство в этих процессах механизма действия СБК. Как известно, КоА участвует в первичных реакциях запуска окислительного процесса пировиноградной кислоты в аэробной фазе дыхания (цикл Кребса), а СБК образует с ним трудно метаболизируемый комплекс сорбил-КоА [11]. Логично возникает вопрос, как будет влиять СБК на процесс дыхания растений с различными биологическими свойствами пшеницы и риса, отличающихся устойчивостью к кислородной гипоксии. Рис обладает высокой устойчивостью к кислородному голоданию не только прорастающих семян, но и его проростков [13].
Действие СБК на интенсивность дыхания оказалось зависимым не только от её концентрации, но и от биологических особенностей тестируемых культур (табл. 4).
Таблица 4
Влияние сорбиновой кислоты на интенсивность дыхания проростков пшеницы и риса
Сорбиновая кислота, мг/л |
Пшеница |
Рис |
||
поглощение О2, мкл/г /час |
% торможения |
поглощение О2, мкл/г /час |
% торможения |
|
0 |
26,7±2,0 |
0 |
12,8±1,7 |
0 |
50 |
27,9±1,9 |
+4,5 |
13,5±1.9 |
+ 5,4 |
100 |
14,3±1,1 |
46,4 |
12,8±1,1 |
0 |
200 |
2,4±0,8 |
91,0 |
4,3±1,3 |
33,6 |
Общим для обеих культур является то, что СБК в низкой концентрации действовала на поглощение кислорода при дыхании так же биполярно, как и в синтезе хлорофилла, слабо стимулируя процесс в низкой концентрации (50 мг/л), и подавляла при высоких (100-200 мг/л). Причем подавление поглощения кислорода проростками пшеницы было значительно выше по сравнению с рисом. Если у проростков пшеницы торможение при 100 и 200 мг/л составляло 46,% и 91,0% соответственно, то торможение у риса было отмечено только в концентрации 200 мг/л и составляло всего 33,6%. То есть чувствительность риса к антиметаболическому действию СБК значительно ниже, чем пшеницы. Вероятно, это связано с особенностями отношения риса к кислородному дыханию. Из данных таблицы 4 видим, что в контроле у пшеницы поглощение кислорода при дыхании значительно интенсивнее, чем у риса, и составило 26,7 мкл О2 на грамм сырого веса/час, тогда как у риса оно составило всего 12,8 мкл/г/час. Эта биологическая особенность может быть объяснением повышенной устойчивости риса к действию СБК.
Это согласуется и с литературными данными [13], в которых показано, что в условиях строгого исключения кислорода в клетках растений риса сохраняется интактная ультраструктура, что обеспечивает синтез белков и даже довольно активный рост надземной части проростков. У них наряду с активацией ферментов при кислородной недостаточности индуцируются события на генном уровне, приводящие к de novo синтезу ферментов, катализирующих реакции энергосбережения клетки. В этом, по-видимому, и заключается один из главных «секретов» биохимической адаптации растений риса, способных, в отличие от других видов, длительно обходиться без кислорода.
Кроме того, у риса оксидаза гликолевой кислоты обладает высокой активностью в листьях и стеблях и весьма слабой у корней, тогда как у сухопутных растений, в том числе и пшеницы, её активность слабая или отсутствует вообще. Считается, что оксидаза гликолевой кислоты специфична для риса [8]. Поэтому листья риса наиболее устойчивы к гипоксии и действию СБК.
Заключение
Таким образом, СБК в зависимости от концентрации оказывает антиростовое и антиметаболическое действие на высшие растения. В пределах 100 и 200 мг/л оказывает тормозящее действие на энергию прорастания и всхожесть семян, рост корней и листьев, синтез хлорофилла и дыхание проростков пшеницы и риса. Причем СБК действует дифференцированно, проявляя более высокую активность на процессы пшеницы, чем риса, а в концентрации 50 мг/л заметно стимулирует синтез хлорофилла и дыхания у обеих культур, тогда как в концентрации 400 мг/л проявляет токсичность и полностью подавляет все процессы обеих культур. Повышенная резистентность проростков риса к действию СБК обусловлена особенностями его биологических свойств, которые характеризуются высокой устойчивостью к кислородной гипоксии, синтезом de novo ферментов, катализирующих реакции энергосбережения клетки и высокой активностью оксидазы гликолевой кислоты.
Результаты наших исследований о воздействии СБК на высшие растения и литературные данные о широком спектре механизма её антибиотического действия привели к мысли связать это с тем, что СБК является широко используемым консервантом в пищевой промышленности (консервант Е200). В предписаниях к её применению она характеризуется как безопасное органическое соединение при допустимой пороговой норме 25 мг/кг массы здорового человека [5]. Результаты наших экспериментов показали, что 400 мг/л СБК проявляют токсичность и полностью подавляют как ростовые, так и метаболическое процессы у высших растений. Учитывая весьма широкое применение СБК для консервирования продуктов питания: в производстве напитков, в кондитерском и пекарском деле, в составе мясных и колбасных изделий, сыров, икры, молочных продуктов и др., возникает опасение, что она при определенных обстоятельствах может поступать в организм человека в количествах, превышающих допустимую пороговую норму, и наносить вред здоровью. И факты вредного действия на животный организм, в том числе и человека, описаны в научной литературе.
Так, отмечены при употреблении СБК (Е200) аллергические реакции у человека, кроме того, вред ее заключается в разрушении цианокобаламина (витамина В12) в человеческом организме, что может провоцировать гибель нервных клеток и привести к различным неврологическим расстройствам [5]. Оказалось, что окислительный стресс, вызванный при кормлении мышей едой с высоким уровнем доз сорбиновой кислоты, индуцировал у них гепатому в печени, что было связано с образованием труднометаболизируемого сорбил-КоА и истощением в печени восстановленного глутатиона [14; 16]. Кормление мышей с добавлением 15% СБК к весу пищи индуцировало пероксисомные Н2О2, генерирующие ферменты, вызываюшие повреждение печени [15]. Поэтому мы предлагаем учитывать это при использовании СБК в качестве консерванта пищевых продуктов, которые часто и в значительных количествах употребляются человеком, чтобы не превысить допустимый пороговый уровень и не нанести вред здоровью.