Высокая биологическая активность и низкая токсичность оксиметилурацила послужили предпосылкой для создания на его основе комплексных соединений с органическими кислотами, обладающими гепатопротекторной активностью. С учетом известных фармакологических свойств оксиметилурацила (антитоксическое и антиоксидантное действие) разработаны два новых комплексных соединения: «оксиметилурацил + глицирризиновая кислота» и «оксиметилурацил + аскорбиновая кислота» для коррекции процессов перекисного окисления липидов и нарушений метаболизма, эффективных при хронических повреждениях печени химической этиологии.
Известно, что печень крыс обладает высокой чувствительностью к повреждающему действию технической смеси полихлорированых бифенилов (ПХБ) - совтола-1 с высоким содержанием хлора [11], что явилось основанием для создания двух новых моделей патологии – токсической гепатопатии [8] и цирроза печени [8; 11]. Дальнейшие эксперименты позволили выявить патогенетическую значимость оксидативного стресса и нарушение механизмов эндогенной цитопротекции, что позволило обосновать новый подход к фармакологической коррекции выявленных нарушений.
Цель данного исследования – сравнительная оценка гепатопротекторной активности оксиметилурацила (в форме комплексных соединений с глицирризиновой кислотой и аскорбатом) и референтного гепатопротектора силимарина на модели поражения печени ПХБ-содержащим препаратом «Совтол-1» и этанолом.
Материалы и методы исследования
В ходе экспериментального исследования отобрана модель цирроза печени [11] для изучения сравнительной гепатопротекторной активности гепатопротектора силимарина и двух комплексных соединений для перорального применения: «оксиметилурацил + глицирризиновая кислота» и «оксиметилурацил + аскорбат». Крысы самцы (n=40) массой 200±20 г были разделены на 5 равных групп. Животным 1-й группы вводили 50%-ный раствор совтола-1 на оливковом масле из расчета 0,25 мл на 100 г массы тела дважды в неделю в течение 4 недель. На протяжении опыта для питья животным давали 10%-ный раствор этанола. Крысам 2, 3 и 4-й групп, используя те же дозы, вводили токсиканты (ПХБ и этанол), однако во 2-й и 3-й группах животные дополнительно получали комплексы «оксиметилурацил + глицирризиновая кислота» и «оксиметилурацил + аскорбат». Препараты вводили перорально в течение 12 суток в дозе 50 мг/кг, начиная с 14-го дня эксперимента. В 4-й экспериментальной группе с целью коррекции использовали гепатопротектор силимарин в аналогичной дозе по вышеприведенной схеме. Интактным крысам (5-я группа) вводили растворитель в адекватном объеме. Все манипуляции выполнены в соответствии с международными нормативными документами, регламентирующими правила гуманного обращения с животными.
Проведена оценка показателей, характеризующих функциональное состояние печени: активность уроканиназы (Урн) [2], аланиновой аминотрансферазы (АлАТ), аспаргиновой аминотрансферазы (АсАТ), щелочной фосфатазы (ЩФ) определяли по кинетическому методу Henry на биохимическом анализаторе согласно прилагаемым инструкциям, а также концентрацию SH-групп, билирубина, холестерина, триглицеридов и содержания в крови общего белка [6; 10]. Антирадикальную активность препаратов оценивали на специальной установке по величине константы K7 – скорости реакции между молекулами изучаемого препарата (соединения) и перекисными радикалами этилбензола [13]. Состояние процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) исследовали методом прямой спектрофотометрии путем определения содержания в гомогенатах печени количества диеновых конъюгатов (ДК), триеновых конъюгатов (ТК) [3; 4]. Одновременно с процессами ПОЛ регистрировали активность супероксиддисмутазы (СОД) [12] и каталазы [5].
Результаты обрабатывали статистически. Оценку статистической значимости различий при межгрупповых сравнениях проводили по двустороннему Т-критерию Стъюдента. Различия считали статистически достоверными при значениях Р<0,05. Комплексные соединения синтезированы в Институте химии Уфимского научного центра РАН кандидатом химических наук Гимадиевой А.Р.
Результаты и их обсуждение
Полученные результаты свидетельствуют о том, что токсическое поражение печени, вызванное введением совтола-1 и этанола, сопровождается нарушением белково-синтетической, детоксицирующей, липосинтезирующей функции печени, признаками цитолиза и холестаза, активацией процессов ПОЛ и подавлением антиокислительной системы. Эксперименты проведены в два этапа. На первом этапе исследовали активность процессов ПОЛ, систему антиоксидантной защиты и функционально-метаболическое состояние печени при сочетанном поражении ее совтолом и этанолом, на втором – сравнительную эффективность применения комплексных соединений «оксиметилурацил+ глицирризиновая кислота», «оксиметилурацил+аскорбиновая кислота» и референтного препарата силимарина. Как следует из данных, представленных в таблице 1, при развитии токсического процесса происходит накопление продуктов ПОЛ в ткани печени. Содержание ДК увеличивается почти в 2 раза, уровень ТК в 1,47 раза. Накопление продуктов ПОЛ сопровождается снижением активности антиоксидантных ферментов – каталазы и супероксиддисмутазы соответственно в 2 и 3,5 раза. Нарушения в системе ПОЛ-АОЗ протекают при одновременном снижении в печени общих тиоловых групп, которое достигает к 30 суткам 42,2% от показателей интактных животных, что может быть обусловлено неферментативной реакцией SH-групп со свободными радикалами липидов в результате активации ПОЛ.
Таблица 1
Влияние комплексных соединений с органическими кислотами «оксиметилурацил» и силимарина на активность процессов ПОЛ и антиоксидантной защиты в печени крыс при ее токсическом поражении (М±m)
Показатели |
Группы крыс |
||||
I |
II |
III |
IV |
V |
|
ДК (λ=232) усл. ед/г ткани |
2.95±0.23 |
2.5±0.33 |
3.1±0.1** |
1.0±0.02** |
1.52±0.09* |
ТК (λ=278) усл. ед/г ткани |
2.0±0.12 |
1.8±0.05 |
0.88±0.07** |
1.1±0.2** |
0.68±0.05* |
СОД, усл. ед/мг белка |
1.36±0.07 |
3.0±0.12** |
4.22±0.13** |
4.0±0.15** |
4.83±0.66* |
КАТ, моль в мин/г белка |
120.3±19.8 |
166±13.2 |
168±17.8** |
183±15.6** |
244.6±18.3* |
SH группы, мкг/мг белка |
8.2±0.44 |
14.2±0.66** |
12.5±0.68** |
8.8±0.9 |
19.4±0.09* |
Примечания: * р<0.05 между группами контроля;
** р<0.05 между группами, получавшими препараты, по сравнению с 1-й группой, получавшей только совтол-1 и этанол.
Таблица 2
Коррекция функционально-метаболических нарушений в печени на модели ее комбинированного повреждения совтолом-1 и этанолом (М±m)
Показатели |
Группы животных |
||||
I (токсикант) |
II |
III |
IV |
V (контроль) |
|
Количество выживших животных, % |
42.5 |
60 |
60 |
73.3 |
100 |
УрН, ммоль/г·л сдвиг показателя Δ |
54.9±3.5 |
38.6±8.9 -16.3 * |
32.6±7.2 -22.3 * |
43.6±6.3 -11.3 * |
0.89±0.03 -54.01 * |
АлАт, ммоль/г·л сдвиг показателя Δ |
9.45±0.45 |
8.8±0.23 -0.5 |
4.0±0.16 -5.45 * |
3.8±0.15 -5.65 * |
3.3±0.18 -6.15 * |
АсАт, ммоль/г·л сдвиг показателя Δ |
25.7±0.43 |
15.0±0.3 -10.7 * |
13.2±0.66 -12.5 * |
23.0±0.5 -2.7 |
10.7±0.14 -15 * |
ЩФ, ммоль/г·л сдвиг показателя Δ |
28.5±0.94 |
17.7±0.88 -10.8 |
17.8±0.91 -10.7 * |
15.3±0.74 -13.2 *
|
15.1±0.40 -13.4 * |
Билирубин, мкмоль/л сдвиг показателя Δ |
19.2±8.8 |
6.6±1.4 -12.6 |
7.3±0.9 -11.9 * |
18.0±15.6 -1.2 |
2.90±0.39 -16.3 * |
Холестерин, ммоль/л сдвиг показателя Δ |
4.3±0.33 |
2.0±0.5 -2.3 * |
2.3±0.21 -2.0 * |
3.2±0.3 -1.1 |
2.9±0.29 -1.4 |
Триглицериды, ммоль/л сдвиг показателя Δ |
1.9±0.12 |
0.39±81 -1.31 * |
0.18±0.09 -1.72 * |
0.88±0.07 -1.02 * |
0.23±0.97 - 1.47 * |
Общий белок, г/л сдвиг показателя Δ |
59.5±3.7 |
60.3±5.5 +0.8 |
64.3±5.2 +4.8 * |
63.5±2.8 +4 * |
65.4±2.9 +5.9 * |
Примечания:* сдвиг показателя (Δ) – разница между группами животных контроля, а также получавших комплексное соединение «оксиметилурацил+ глицирризиновая кислота», «оксиметилурацил+аскорбиновая кислота» и силимарин по сравнению с 1-й группой крыс, получавших только совтол-1 и этанол.
Токсическое поражение печени вызывает снижение концентрации белка, увеличение уровня билирубина, холестерина и триглицеридов (табл. 2). В крови животных значительно повышается активность печеночно-специфического фермента-уроканиназы, а также активность АлАТ, АсАТ и ШФ в 2.8, 2.4 и 1.9 раза соответственно.
Лечение отравленных крыс комплексными соединениями «оксиметилурацил + глицирризиновая кислота» и «оксиметилурацил + аскорбиновая кислота», так же как и гепатопротектором силимарином, благоприятно влияет на функционально-метаболическое состояние печени. Препараты оказывают гепатопротекторное действие: снижают гиперферментемию, частично нормализуют практически все нарушенные показатели, характеризующие метаболическое состояние печени (табл. 2). Комплекс оксиметилурацила с глицирризиновой кислотой менее эффективен, поскольку его введение крысам не изменяет концентрацию билирубина и холестерина, а также уровень АсАТ в крови отравленных крыс. В основе гепатозащитного действия комплексных соединений лежат их антиоксидантные свойства. Однако механизмы их антиоксидантного действия, по-видимому, различны: если комплексное соединение, содержащее аскорбат, проявляет прямую антирадикальную активность, то глицирризинат оксиметилурацила такой активностью не обладает (табл. 3).
Имеются данные о том, что глицирризиновая кислота не влияет на продукцию активных форм кислорода (АФК) активированными нейтрофилами, подавляет эту продукцию при инкубации с фагоцитами, активированными форболовым эфиром и лигандом специфических рецепторов на их мембране – хемотоксическим пептидом N-формил-Мет-Лей-Фен. На основании этих данных сделан вывод о том, что ограничивающее действие глицирризиновой кислоты на генерацию АФК связано либо с блокадой передачи рецепторного сигнала на НАДФН-оксидазу, либо с ингибирующим влиянием на протеинкиназу С [1].
Таблица 3
Константа скорости взаимодействия перекисных радикалов этилбензола с оксиметилурацилом, оксиметилурацилом-глицирризинатом, аскорбатом, глицирризиновой кислотой и ионолом (К 7)
Препарат (соединение) |
Константа К7, моль/л ·с |
К 7 препарата |
К 7 ионола |
||
* Ионол (2-метил-2.6-дитретбутилфенол) |
(2.3±0.6) • 104 |
1 |
Оксиметилурацил-основание |
(2.6±0.8) • 104 |
1.17 |
Оксиметилурацил-аскорбат |
(1.3±0.4) • 105 |
5.7 |
Оксиметилурацил-глицирризинат |
(2.6±0.8) • 104 |
1.17 |
Глицирризиновая кислота |
(1.3±0.4) • 102 |
5.6 • 10 -3 |
Примечание: * ионол (2-метол-2.6-дитретбутил-фенол) – референтный ингибитор свободно-радикального окисления.
Заключение
Гепатопротекторное действие силимарина и комплексных соединений «оксиметилурацил + глицирризиновая кислота» и «оксиметилурацил + аскорбиновая кислота» реализуется на метаболическом уровне. Метаболический эффект препаратов проявляется в снижении цитолиза, холестаза, а также в уменьшении интенсивности липопероксидации.
Антиоксидантные свойства комплексных соединений препаратов подтверждаются благоприятным влиянием препаратов на активность антиоксидантных ферментов – супероксиддисмутазу и каталазу. С точки зрения получения конечного результата силимарин и комплексное соединение «оксиметилурацил + аскорбиновая кислота» имеют некоторое преимущество перед комплексным соединением «оксиметилурацил + глицирризиновая кислота» в условиях модельной патологии, вызванной комбинацией совтола-1 и этанола. Возможно, при данном патологическом состоянии наиболее перспективными по механизму действия являются препараты с прямым антирадикальным действием, что требует дальнейшего экспериментального изучения.