Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Для разработки стратегии сохранения и рационального природопользования лесных ресурсов, обеспечивающей удовлетворение экономических потребностей общества и охрану биоразнообразия природных сообществ, необходимы глубокие знания о состоянии генофондов основных лесообразующих древесных видов растений [2]. Род Populus является модельным для генетических исследований древесных видов растений благодаря небольшому размеру генома, незначительной генетической изменчивости, быстрым темпам роста по сравнению с другими древесными видами [9]. Populus trichocarpa L. – первый вид из древесных растений, чей геном был секвенирован [13]. P. nigra играет важнейшую роль при сохранении пойменных экосистем и используется как источник древесины в промышленности и строительстве. Большое генетическое разнообразие и проблемы в таксономии клонов и гибридов указывают на применение именно популяционного подхода для изучения P. nigra [14]. Геном тополя чёрного не секвенирован полностью, но посредством молекулярного маркирования и SNP (Single Nucliotide Polymorphism) активно изучается как ядерная [5; 6; 12], так и хлоропластная [8; 15], а также митохондриальная ДНК [7]. В Пермском крае изучено генетическое разнообразие популяций тополя дрожащего на основании полиморфизма ISSR (Inter-Simple Sequence Repeats)-PCR маркеров и SNP-маркеров [4]. Генетическое разнообразие популяций P. nigra изучено на Среднем и Южном Урале на основе полиморфизма SSR (Single Nucleotide Repeats)-PCR маркеров [3], которые выявляют полиморфизм микросателлитных локусов. В качестве молекулярных маркеров, как показано на примере других видов тополей (P. tremula) на Урале [4], эффективны ISSR-маркеры, используемые при анализе полиморфизма межмикросателлитных последовательностей. Изучение генетического разнообразия, генетической структуры и дифференциации популяций тополя чёрного на Среднем и Южном Урале на основании межмикросателлитного анализа ранее не проводилось.

Целью данного исследования являлось определение генетического разнообразия и генетической структуры у четырёх популяций P. nigra на Среднем и Южном Урале на основании полиморфизма ISSR-PCR маркеров.

Материал и методы исследования

Объектами исследований являлись четыре популяции P. nigra из разных ботанико-географических районов Среднего и Южного Урала: первая популяция (Pn_1, или Спасская гора), расположенная в историко-природном комплексе «Спасская гора» в зоне островной Кунгурской лесостепи южной тайги Пермского края (Средний Урал); вторая популяция (Pn_2, или Бирск) находится около г. Бирск Республики Башкортостан в лесостепном районе Южного Урала; третья популяция (Pn_3, или Стерлитамак), расположенная около г. Стерлитамак Республики Башкортостан в степном районе Южного Урала; четвертая популяция (Pn_4, или Инзер) находится на территории Южно-Уральского заповедника в горном районе Южного Урала. Минимальное географическое расстояние между популяциями составило около 137 км (между Pn_3 и Pn_4), а максимальное – около 380 км (между Pn_1 и Pn_3).

Для молекулярно-генетического анализа P. nigra были собраны листья с 30-32 случайно избранных деревьев на расстоянии не менее 50 м друг от друга. Для выделения ДНК использовали модифицированную методику S.O. Rogers [11], в которой использовали в качестве детергента СТАВ+PVPP (цетилтриметиламониум бромид + поливинилполипирролидон). При выделении ДНК из листьев брали навеску по 100 мг. Концентрацию ДНК определяли с помощью спектрофотометра NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, USA) и для ПЦР выравнивали до 10 нг/мкл.

Анализ генетического разнообразия популяций P. nigra проведен ISSR-методом анализа полиморфизма ДНК [16]. Для полимеразной цепной реакции ISSR-PCR-методом реакционная смесь объемом 25 мкл содержала: 2 единицы Tag-полимеразы («Силекс М», Россия); 2,5 мкл стандартного 10х буфера для ПЦР («Силекс М», Россия); 25 пМ праймера («Синтол», Россия); 2,5 мМ MgCl2 («Силекс М», Россия); 0,25 мM dNTP («Fermentas», Литва); 5 мкл тотальной ДНК. Амплификацию ДНК проводили в термоциклере GeneAmp PCR System 9700 («Applied Biosystems», США) по стандартной для ISSR-PCR-метода программе [1] с пятью ISSR-PCR-праймерами. Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 1,7%-ном агарозном геле в 1х ТВЕ буфере, окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете в системе гель-документации GelDoc XR (Bio-Rad, USA). Для определения длины фрагментов ДНК использовали маркер молекулярного веса ООО «СибЭнзим-М» (Москва) и программу Quantity One (Bio-Rad, USA).

Компьютерный анализ молекулярно-генетического полиморфизма ДНК проведен с помощью общепринятых компьютерных программ POPGENE 1.31 и специализированного макроса GenAlEx6 для MS-Excel с определением доли (Р95) полиморфных локусов, абсолютного (na) числа аллелей, эффективного (ne) числа аллелей, ожидаемой (HE) гетерозиготности. Для описания генетической структуры популяции были использованы следующие параметры: ожидаемая доля гетерозиготных генотипов () во всей популяции, как мера общего генного разнообразия; ожидаемая доля гетерозиготных генотипов () в субпопуляции, как мера ее внутрипопуляционного разнообразия; доля межпопуляционного генетического разнообразия в общем разнообразии или показатель подразделенности популяций ().

На основе матрицы бинарных признаков была рассчитана матрица генетических различий, на основании которой невзвешенным парно-групповым методом UPGMA (unweighed pair-group method using arithmetic average) была построена дендрограмма, отражающая степень сходства исследуемых популяций по ISSR-спектрам при помощи компьютерных программ Treecon 1.3b. Генетическое расстояние между ценопопуляциями определяли по формуле M. Нея и В. Ли [10].

Результаты и их обсуждение

В четырех популяциях P. nigra выявлено 49 ISSR-PCR-маркеров, из которых 43 (P95=0,878) были полиморфными. Число амплифицированных ISSR-маркеров варьировало в зависимости от праймера от 12 (праймер CR-215, X10, M27) до 13 (праймер M3), а их диапазон длин от 210 до 740 пн. Установлено, что число полиморфных маркеров в общей выборке изменялось от 10 до 12, а доля полиморфных локусов (P95) в зависимости от ISSR-праймера варьировала от 0,769 до 1. Наименьшая доля полиморфных локусов (P95=0,725) отмечена в популяции Pn_4, а наибольшая (P95=0,788) – в Pn_3.

Ожидаемая гетерозиготность () в общей выборке P. nigra составила =0,221. Наибольшие значения ожидаемой гетерозиготности (=0,233) отмечены в Pn_3, а наименьшие (=0,187) – в Pn_1. Абсолютное число аллелей (na) в общей выборке равно 1,878, а эффективное число аллелей (ne) ? 1,494. Максимальный показатель (na =1,593) отмечен в популяции Pn_3, а минимальный (na = 1,550) – в Pn_1. Наибольшее значение эффективных аллелей (ne) выявлено также в популяции Pn_4 и составило 1,425, а наименьшее – в Pn_1 и оказалось равным 1,302.

Для характеристики генетического разнообразия популяций важны редкие (R), то есть встречающиеся с частотой менее 5%, маркеры. В изученных популяциях P. nigra выявлено 6 редких ISSR-маркеров, которые равномерно распределены (R=2) в популяциях Pn_1, Pn_2, Pn_4, а в Pn_3 они отсутствовали.

Все вышеперечисленные данные свидетельствуют о том, что популяция Pn_3, произрастающая вблизи г. Стерлитамак, характеризуется более высоким уровнем генетического разнообразия в сравнении с другими изученными популяциями (HE = 0,233; ne=1,425; R=2), а популяция Pn_1 («Спасская гора») – наиболее низкими показателями генетического разнообразия (HE = 0,187; ne = 1,302; R=0).

В результате молекулярно-генетического анализа популяций тополя чёрного на основании полиморфизма микросателлитных последовательностей наибольшие показатели генетического разнообразия (na = 7,667; ne = 3,948; = 0,715) были также выявлены в Pn_3, а наименьшие ? в Pn_1 (na=4,167; ne=2,585), но наименьшей ожидаемой гетерозиготностью (HE = 0,517) обладает популяция Pn_4 [3].

Анализ генетической структуры четырех популяций P. nigra показал, что общее генное разнообразие или ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в общей выборке (HT) составило 0,291, а ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в субпопуляции (HS) ? 0,221. Показатель подразделённости популяций () невысок и равен 0,239 (табл.). Наименьшее генетическое расстояние между исследуемыми популяциями P. nigra отмечено между Pn_2 «Бирск» и Pn_3 «Стерлитамак» (D=0,132), наиболее генетически удаленными являются популяции Pn_1 «Спасская гора» и Pn_3 «Стерлитамак» (D=0,242).

Генетическая структура и дифференциация четырех популяций P. nigra

Примечание: – ожидаемая доля гетерозиготных генотипов как мера общего генного разнообразия во всей популяции; – ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в субпопуляции, как мера ее внутрипопуляционного разнообразия или среднее выборочное генное разнообразие по всем локусам; – доля межпопуляционного генетического разнообразия в общем разнообразии или показатель подразделенности популяций; в скобках даны стандартные отклонения

На дендрограмме (рисунок) популяции Pn_2 «Бирск» и Pn_3 «Стерлитамак» образуют один кластер, к ним примыкает популяция Pn_4 «Инзер», в свою очередь, Pn_1 – «Спасская гора», самая северная из изученных популяций,представлена отдельной ветвью.

UPGMA-дендрограмма по ISSR-спектрам четырех изученных популяций P. nigra,

где Pn_1 – «Спасская гора», Pn_2 ? «Бирск», Pn_3 – «Стерлитамак», Pn_4 – «Инзер»; шкала сверху – генетические дистанции по формуле M. Нея, В. Ли [10], цифрами указаны значения бутстрепа

Анализ генетической структуры и дифференциации популяций тополя чёрного на основании полиморфизма SSR-PCR-маркеров показал, что ожидаемая доля гетерозиготных генотипов в общей популяции (НT) равна 0,759, аналогичный показатель в субпопуляции (НS) составляет 0,615. Показатель подразделённости популяций (GST) равен 0,168. Следовательно, 16,8% генетического разнообразия приходится на межпопуляционную компоненту, а 83,2% - на внутрипопуляционную [3].

На основании результатов выполненного исследования для сохранения и возобновления генетических ресурсов P. nigra можно рекомендовать третью популяцию (Pn_3), произрастающую вблизи г. Стерлитамак, обладающую наиболее высокими показателями генетического разнообразия (=0,233; =1,425; R=2). При отборе деревьев для лесовосстановления необходимо учитывать их генотип, а также наличие редких ISSR-маркеров, которые наряду с другими молекулярными маркерами могут быть использованы и для идентификации популяций. Для сохранения генетического разнообразия тополя чёрного на популяционном уровне необходимо учитывать генетическую структуру популяций и уровень внутри- и межпопуляционной дифференциации. В целях сохранения генетического разнообразия популяции Pn_1 (=0,187; =1,302; R=0), расположенной в историко-природном комплексе «Спасская гора» в зоне островной Кунгурской лесостепи на Среднем Урале, а также Pn_4, произрастающей на территории Южно-Уральского заповедника в горном районе Южного Урала, необходимо соблюдение мер охраны, предусмотренных статусом ООПТ.

Заключение

В ходе исследований генетического полиморфизма популяций P. nigra с применением ISSR-метода анализа полиморфизма ДНК было установлено, что вид характеризуется высокой долей полиморфных локусов (=0,878), но средними значениями ожидаемой гетерозиготности (=0,221) и эффективного числа аллелей (=1,494). Самые высокие показатели доли полиморфных локусов (=0,788), значения эффективных аллелей (=1,425) и ожидаемой гетерозиготности (=0,233) отмечены в популяции Pn_3 в окрестностях г. Стерлитамак. А популяция Pn_1 на территории ООПТ «Спасская гора» обладает самым низким значением ожидаемой гетерозиготности (=0,187), а также эффективных аллелей (= 1,302). Низкая доля полиморфных фрагментов (=0,725) отмечена в популяции Pn_4 на территории Южно-Уральского заповедника вблизи г. Инзер. Установлено, что все изученные популяции P. nigra характеризуются средним уровнем генетической подразделенности (=0,239). На основании полученных результатов даны рекомендации по сохранению генетического разнообразия популяций P. nigra на Среднем и Южном Урале. Изучение генетической изменчивости природных популяций древесных растений может быть использовано для составления генетически обоснованных программ по сохранению, восстановлению и рациональному использованию лесных генетических ресурсов.

Работа выполнена при финансовой поддержке задания 2014/153 государственных работ в сфере научной деятельности в рамках базовой части государственного задания Минобрнауки России (проект 144, № гос. рег. 01201461915).