Интенсивные физические нагрузки запускают окислительный стресс, значительно возрастающий в состоянии перенапряжения [13, 6]. Для коррекции негативных последствий физической нагрузки, особенно у недостаточно тренированных людей, и восстановления работоспособности эффективным может быть использование эндогенных веществ мультифакторного действия, в том числе и антиоксидантной направленности действия [12,9]. К группе подобных веществ относится церулоплазмин, функции которого разнообразны: главный антиоксидант крови; участник метаболизма железа; способен влиять на клеточный состав крови, гемостаз, проявления дислипидемии и др. [11,14,1].
Цель исследования – в условиях эксперимента выяснить влияние церулоплазмина (ЦП) на интенсивность свободнорадикального окисления в крови и сыворотке при острой физической нагрузке.
Материалы и методы. Исследование проведено на белых беспородных крысах, массой 200–250 грамм. Все эксперименты выполнены согласно Европейской Конвенции по защите экспериментальных животных. Было сформировано три группы животных. Первая группа (контрольная) – интактные животные. Вторая группа – моделировалась острая физическая нагрузка (ОФН). Нетренированные крысы плавали в течение 4-х минут с грузом массой 20 % от массы тела. Третья группа – за сутки до нагрузки однократно вводился церулоплазмин (НПО «Иммунопрепарат», Уфа) в дозе 50 % от физиологической концентрации в крови. Забор крови производился через 15–20 минут после физической нагрузки.
Интенсивность СРО в цельной крови исследовали методом люминол-усиленной хемилюминесценции (ХЛ) [15, 3]. Регистрировали базальную и индуцированную хемилюминесценцию цельной крови: светосумму (СС, у.е.•мин) и максимальную светимость (МС, у.е.) [2]. Показатели базальной и индуцированной ХЛ рассчитывали на 105 нейтрофильных лейкоцитов.
Интенсивность пероксидации липидов, как составляющей СРО, изучали методом железоиндуцированной хемилюминесценции сыворотки крови [15, 3].
Продукты ПОЛ в крови оценивали спектрофотометрическим методом в изопропаноловой фракции [4]. Активность супероксиддисмутазы (СОД) оценивали в реакции восстановления нитросинего тетразолия [16]; активность каталазы определяли в цветной реакции с молибдатом аммония [8]; активность глютатионредуктазы оценивали по способности окислять НАДН при длине волны 340 нм [2]; уровень церулоплазмина оценивали модифицированным методом Равина по способности окислять р-фенилендамин [7]. Общую антиокислительную активность (ОАО) оценивали фотометрическим тестом ImAnOx(TAS/TAC) Kit фирмы Immundiagnostik (Германия) по степени подавления оксидации в присутствии перекиси водорода. Статистическая обработка результатов исследования проводилась на персональном компьютере с помощью пакета программ анализа данных Statistica 6.0. Для оценки достоверности полученных результатов использовали непараметрический критерий Манна – Уитни.
Результаты исследования
ОФН привела к активации процессов СРО в цельной крови (табл. 1). Базальное светечение: светосумма (СС) возросла на 42 %, максимальная светимость (МС) на 48 %. СС индуцированного свечения увеличилась на 136 %, МС на 177 %. ОФН сопровождается миогенным лейкоцитозом, причем происходит достоверное увеличение нейтрофилов в абсолютных числах в 1,5 раза по сравнению с контролем. Пересчет на нейтрофильные лейкоциты, так как они являются основными источниками свободных радикалов, показал, что снижается базальное свечение (СС и МС) на 32 и 26 % соответственно; индуцированное свечение не меняется. Церулоплазмин практически не влияет на ХЛ цельной крови и производство свободных радикалов нейтрофильными лейкоцитами, способствуя лишь снижению относительно контроля СС индуцированного свечения при пересчете на нейтрофилы.
Таблица 1
Хемилюминесценция цельной крови при острой физической нагрузке и при введении церулоплазмина (М±m;σ)
|
Группы сравнения/ показатели |
Контроль (n=9) |
ОФН (n=9) |
ОФН+ЦП (n=9) |
|
|
Базальное свечение |
СС, у.е.•мин |
0,677±0,02 0,07 |
1,17±0,17* 0,51 |
1,18±0,06* 0,18 |
|
МС, у.е. |
0,276±0,014 0,04 |
0,41±0,04* 0,12 |
0,4±0,02* 0,06 |
|
|
Индуцированное свечение |
СС, у.е.•мин |
2,66±0,21 0,63 |
6,27±0,65* 1,97 |
4,39±0,61* 1,84 |
|
МС, у.е. |
0,79±0,14 0,43 |
2,19±0,37* 1,12 |
1,48±0,28* 0,85 |
|
|
Базальное свечение в пересчете на 105 нейтрофилов |
СС, у.е.•мин |
0,33±0,026 0,08 |
0,23±0,05* 0,14 |
0,24±0,02* 0,07 |
|
МС, у.е. |
0,13±0,01 0,03 |
0,08±0,01* 0,036 |
0,082±0,008* 0,02 |
|
|
Индуцированное свечение в пересчете на 105 нейтрофилов |
СС, у.е.•мин |
1,29±0,13 0,39 |
1,19±0,13 0,4 |
0,87±0,09* 0,29 |
|
МС, у.е. |
0,39±0,08 0,26 |
0,41±0,07 0,22 |
0,29±0,04 0,13 |
|
Достоверность по критерию Манна – Уитни: * – относительно контроля; ^ – относительно ОФН.
Острая физическая нагрузка не приводит к увеличению спонтанной светимости сыворотки крови, что говорит о сохранении стационарного состояния оксиданты-антиоксиданты (табл. 2). При ОФН возрастает СС за счет амплитуды быстрой вспышки, отражающей процессы накопления гидроперекисей липидов, и амплитуды медленной вспышки, максимально возможной интенсивности пероксидации липидов (ПОЛ). ЦП не изменяет спонтанную светимость сыворотки крови, не снижает светосумму свечения и амплитуду медленной вспышки; снижает, но не нормализует амплитуду быстрой вспышки; повышает длительность латентного периода, отражающего суммарную антиокисидантную активность сыворотки крови.
Таблица 2
Хемилюминесценции сыворотки крови при острой физической нагрузке и при введении церулоплазмина (М±m; σ)
|
Группы сравнения/ показатели |
Контроль (n=9) |
ОФН (n=9) |
ОФН+ЦП (n=9) |
|
Спонтанная светимость, у.е.•мин |
0,22±0,06; 0,23 |
0,23±0,05; 0,18 |
0,19±0,04; 0,11 |
|
Светосумма свечения, у.е.•мин |
3,09±0,10; 0,42 |
4,87±0,19*;0,71 |
4,56±0,13*; 0,40 |
|
Амплитуда быстрой вспышки, у.е. |
1,41±0,04; 0,15 |
2,07±0,096*; 0,35 |
1,68±0,1*^ 0,33 |
|
Амплитуда медленной вспышки, у.е. |
1,65±0,05; 0,21 |
2,67±0,09*; 0,33 |
2,77±0,09*; 0,31 |
|
Длительность латентного периода, мм |
17,82±0,69; 2,83 |
19,69±1,17; 4,21 |
28,4±0,85*^; 2,67 |
Достоверность по критерию Манна – Уитни: * – относительно контроля; ^ – относительно ОФН.
В крови при нагрузке возрастает содержание общих, первичных и промежуточных продуктов ПОЛ (табл. 3). Введение ЦП приводит к нормализации общих и промежуточных продуктов ПОЛ.
Таблица 3
Динамика продуктов ПОЛ в сыворотке крови при острой физической нагрузке и при введении церулоплазмина (М±m; σ)
|
Показатели/ сроки |
Контроль (n=10) |
ОФН (n=9) |
ОФН +ЦП (n=10) |
|
∑ =220 ед/мл |
2,99±0,21; 0,63 |
3,74±0,19*; 0,58 |
3,69±0,28; 0,84 |
|
∑ =232 ед/мл |
1,28±0,095; 0,30 |
1,86±0,15*; 0,44 |
1,81±0,13*; 0,38 |
|
∑ =278 ед/мл |
0,804±0,06; 0,21 |
1,26±0,14*; 0,43 |
1,13±0,13; 0,39 |
|
∑ =400 ед/мл |
0,059±0,02; 0,06 |
0,155±0,07; 0,24 |
0,084±0,03; 0,10 |
Достоверность по критерию Манна – Уитни: * – относительно контроля; ^ – относительно ОФН.
Состояние антиоксидантной системы в сыворотке крови при острой физической нагрузке и введении ЦП представлено в таблице 4. В сыворотке крови при ОФН снижается активность каталазы, не изменяется активность СОД и глютатион-редуктазы, повышается церулоплазмин и общая антиокислительная активность. Глютатион-редуктаза, восстанавливающая окисленный глютатион, функционально связана с глютатион-пероксидазой. Введение ЦП приводит к повышению его в крови, нормализации активности каталазы, увеличению активности глютатион-редуктазы относительно контроля, не влияя на мощность общей антиокислительной активности.
Таблица 4
Антиокислительные системы в сыворотке крови при острой физической нагрузке и при введении ЦП (М±m; σ)
|
Показатели/ сроки |
Контроль (n=10) |
ОФН (n=9) |
ОФН +ЦП (n=10) |
|
СОД, ед/мл |
1,46±0,11; 0,40 |
1,22±0,20; 0,59 |
1,5±0,18; 0,55 |
|
Каталаза, мкат/л |
22,84±3,38; 14,36 |
11,73±1,51*; 4,53 |
19,67±2,89; 8,66 |
|
Глютатионредуктаза, МЕ |
8,04±0,32; 1,12 |
11,49±1,77; 5,01 |
13,21±1,46*; 4,13 |
|
ЦП, мг/л |
333,95±22,87; 79,23 |
498,745±37,37*; 118,18 |
612,68±27,7*^; 87,64 |
|
ОАА, мкмоль/л |
216,7±3,94; 18,95 |
255,6±7,05*; 33,86 |
253,89±6,69*; 20,09 |
* – достоверность по критерию Манна – Уитни относительно контроля; ^ – относительно ОФН.
Обсуждение. В настоящее время многочисленные публикации посвящены генерации активных форм кислорода их физиологическому и патологическому действию [10, 5]. Следствием ОФН у нетренированных крыс является увеличение свободных радикалов за счет активации свободнорадикальных процессов в цельной крови, наиболее вероятно связанных с миогенным лейкоцитозом. Это предположение подтверждается снижением СС и МС базального свечения при пересчете на нейтрофилы. Потенциальная способность нейтрофилов к продукции радикалов при ОФН не изменяется, так как величины индуцированного свечения в пересчете на нейтрофилы остаются в пределах контрольных значений. Железоиндуцированная ХЛ и содержание продуктов ПОЛ в сыворотке крови указывают на интенсификацию пероксидации липидов. При ОФН имеется дисбаланс между и ферментативными и неферментативными антиоксидантами и возрастание церулоплазмина, длительности латентного периода и общей антиокислительной активности не компенсирует свободнорадикальную нагрузку. Кроме того, отсутствуют согласованные изменения активности СОД, каталазы и глютатиопероксидазы. Указывается, что активность, стабильность и согласованное действие ключевых ферментов должны быть взаимосвязаны, так как СОД, каталаза, глютатионпероксидаза могут инактивироваться одним из продуктов их ферментативной реакции [5, 17,18]. Более того, продукты ПОЛ являются потенциальными ингибиторами глютатионпероксидазы [5]. Церулоплазмин относится к высокомолекулярным неферментативным антиоксидантам. Антиоксидантные свойства церулоплазмина связаны с хелаторным действием относительно двухвалентных ионов меди, способностью окислять двухвалентное железо и дисмутацией супероксидного анион-радикала [5]. Предварительное введение церулоплазмина не достаточно эффективно относительно ХЛ цельной крови и сыворотки. В крови нет нормализации абсолютных значений базальной и индуцированной ХЛ (светосуммы и максимальной светимости), несмотря на снижение функциональной возможности нейтрофилов к продукции свободных радикалов после введения ЦП. В сыворотке крови на фоне повышения латентного периода не нормализуются – светосумма свечения, амплитуда быстрой и медленной вспышки, первичные продукты ПОЛ. Введение церулоплазмина не способствует дополнительному повышению мощности общей антиокислительной активности (ОАА), но приводит к возрастанию активности каталазы и глютатиоредуктазы. Таким образом, в условиях интенсивной генерации свободных радикалов предварительное введение церулоплазмина не достаточно эффективно. Более того, существует опасность, что церулоплазмин, как металл-связывающий белок, при окислительном стрессе, снижении рН крови и окислительной деструкции может быть источником активных форм металлов переменной валентности [5], провоцирующих свободнорадикальное окисление.
Выводы
У нетренированных крыс предварительное однократное введение церулоплазмина в дозе 50 % от физиологического уровня не приводит к нормализации свободнорадикальных процессов в крови и сыворотке, инициированных острой физической нагрузкой.