Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

THE ROLE OF CERULOPLASMIN ON THE CORRECTION OF FREE RADICAL OXIDATION IN ACUTE EXERCISE

Ermolaeva E.N. 1 Krivokhizhina L.V. 1 Kantyukov S.A. 1 Yakovleva V.P. 2
1 South Ural State Medical University
2 Ural State University of Physical Culture
The aim of the study in the experiment to determine the influence of ceruloplasmin on the intensity of free radical oxidation in blood and serum during acute physical exertion. Effect of acute exercise in untrained rats is the increase of free radicals due to activation of free radical processes in whole blood, serum despite the controversial change in the activity and content of antioxidants. Prior administration of ceruloplasmin in the dose of 50 % of the physiological level does not lead to normalization of free radical processes in the blood and serum. In the blood are not normalized absolute values of basal and induced chemiluminescence (light sum, maximum luminosity). In the blood serum to the increase of the latent period, the rate of integral antioxidants capacity is not reduced indicators of iron induced chemiluminescence (light sum of the illumination, the amplitude of the fast and slow flash), remain elevated primary products of lipid peroxidation.
acute exercise
ceruloplasmin
free radical oxidation
chemiluminescence

Интенсивные физические нагрузки запускают окислительный стресс, значительно возрастающий в состоянии перенапряжения [13, 6]. Для коррекции негативных последствий физической нагрузки, особенно у недостаточно тренированных людей, и восстановления работоспособности эффективным может быть использование эндогенных веществ мультифакторного действия, в том числе и антиоксидантной направленности действия [12,9]. К группе подобных веществ относится церулоплазмин, функции которого разнообразны: главный антиоксидант крови; участник метаболизма железа; способен влиять на клеточный состав крови, гемостаз, проявления дислипидемии и др. [11,14,1].

Цель исследования – в условиях эксперимента выяснить влияние церулоплазмина (ЦП) на интенсивность свободнорадикального окисления в крови и сыворотке при острой физической нагрузке.

Материалы и методы. Исследование проведено на белых беспородных крысах, массой 200–250 грамм. Все эксперименты выполнены согласно Европейской Конвенции по защите экспериментальных животных. Было сформировано три группы животных. Первая группа (контрольная) – интактные животные. Вторая группа – моделировалась острая физическая нагрузка (ОФН). Нетренированные крысы плавали в течение 4-х минут с грузом массой 20 % от массы тела. Третья группа – за сутки до нагрузки однократно вводился церулоплазмин (НПО «Иммунопрепарат», Уфа) в дозе 50 % от физиологической концентрации в крови. Забор крови производился через 15–20 минут после физической нагрузки.

Интенсивность СРО в цельной крови исследовали методом люминол-усиленной хемилюминесценции (ХЛ) [15, 3]. Регистрировали базальную и индуцированную хемилюминесценцию цельной крови: светосумму (СС, у.е.•мин) и максимальную светимость (МС, у.е.) [2]. Показатели базальной и индуцированной ХЛ рассчитывали на 105 нейтрофильных лейкоцитов.

Интенсивность пероксидации липидов, как составляющей СРО, изучали методом железоиндуцированной хемилюминесценции сыворотки крови [15, 3].

Продукты ПОЛ в крови оценивали спектрофотометрическим методом в изопропаноловой фракции [4]. Активность супероксиддисмутазы (СОД) оценивали в реакции восстановления нитросинего тетразолия [16]; активность каталазы определяли в цветной реакции с молибдатом аммония [8]; активность глютатионредуктазы оценивали по способности окислять НАДН при длине волны 340 нм [2]; уровень церулоплазмина оценивали модифицированным методом Равина по способности окислять р-фенилендамин [7]. Общую антиокислительную активность (ОАО) оценивали фотометрическим тестом ImAnOx(TAS/TAC) Kit фирмы Immundiagnostik (Германия) по степени подавления оксидации в присутствии перекиси водорода. Статистическая обработка результатов исследования проводилась на персональном компьютере с помощью пакета программ анализа данных Statistica 6.0. Для оценки достоверности полученных результатов использовали непараметрический критерий Манна – Уитни.

Результаты исследования

ОФН привела к активации процессов СРО в цельной крови (табл. 1). Базальное светечение: светосумма (СС) возросла на 42 %, максимальная светимость (МС) на 48 %. СС индуцированного свечения увеличилась на 136 %, МС на 177 %. ОФН сопровождается миогенным лейкоцитозом, причем происходит достоверное увеличение нейтрофилов в абсолютных числах в 1,5 раза по сравнению с контролем. Пересчет на нейтрофильные лейкоциты, так как они являются основными источниками свободных радикалов, показал, что снижается базальное свечение (СС и МС) на 32 и 26 % соответственно; индуцированное свечение не меняется. Церулоплазмин практически не влияет на ХЛ цельной крови и производство свободных радикалов нейтрофильными лейкоцитами, способствуя лишь снижению относительно контроля СС индуцированного свечения при пересчете на нейтрофилы.

Таблица 1

Хемилюминесценция цельной крови при острой физической нагрузке и при введении церулоплазмина (М±m;σ)

Группы сравнения/

показатели

Контроль

(n=9)

ОФН

(n=9)

ОФН+ЦП

(n=9)

Базальное свечение

СС, у.е.•мин

0,677±0,02

0,07

1,17±0,17*

0,51

1,18±0,06*

0,18

МС, у.е.

0,276±0,014 0,04

0,41±0,04*

0,12

0,4±0,02*

0,06

Индуцированное свечение

СС, у.е.•мин

2,66±0,21

0,63

6,27±0,65*

1,97

4,39±0,61*

1,84

МС, у.е.

0,79±0,14

0,43

2,19±0,37*

1,12

1,48±0,28*

0,85

Базальное свечение в пересчете на 105 нейтрофилов

СС, у.е.•мин

0,33±0,026

0,08

0,23±0,05*

0,14

0,24±0,02*

0,07

МС, у.е.

0,13±0,01

0,03

0,08±0,01* 0,036

0,082±0,008*

0,02

Индуцированное свечение в пересчете на 105 нейтрофилов

СС, у.е.•мин

1,29±0,13

0,39

1,19±0,13

0,4

0,87±0,09*

0,29

МС, у.е.

0,39±0,08

0,26

0,41±0,07

0,22

0,29±0,04

0,13

Достоверность по критерию Манна – Уитни: * – относительно контроля; ^ – относительно ОФН.

Острая физическая нагрузка не приводит к увеличению спонтанной светимости сыворотки крови, что говорит о сохранении стационарного состояния оксиданты-антиоксиданты (табл. 2). При ОФН возрастает СС за счет амплитуды быстрой вспышки, отражающей процессы накопления гидроперекисей липидов, и амплитуды медленной вспышки, максимально возможной интенсивности пероксидации липидов (ПОЛ). ЦП не изменяет спонтанную светимость сыворотки крови, не снижает светосумму свечения и амплитуду медленной вспышки; снижает, но не нормализует амплитуду быстрой вспышки; повышает длительность латентного периода, отражающего суммарную антиокисидантную активность сыворотки крови.

Таблица 2

Хемилюминесценции сыворотки крови при острой физической нагрузке и при введении церулоплазмина (М±m; σ)

Группы сравнения/

показатели

Контроль

(n=9)

ОФН

(n=9)

ОФН+ЦП

(n=9)

Спонтанная светимость, у.е.•мин

0,22±0,06; 0,23

0,23±0,05; 0,18

0,19±0,04; 0,11

Светосумма свечения, у.е.•мин

3,09±0,10; 0,42

4,87±0,19*;0,71

4,56±0,13*; 0,40

Амплитуда быстрой вспышки, у.е.

1,41±0,04; 0,15

2,07±0,096*; 0,35

1,68±0,1*^ 0,33

Амплитуда медленной вспышки, у.е.

1,65±0,05; 0,21

2,67±0,09*; 0,33

2,77±0,09*; 0,31

Длительность латентного периода, мм

17,82±0,69; 2,83

19,69±1,17; 4,21

28,4±0,85*^; 2,67

Достоверность по критерию Манна – Уитни: * – относительно контроля; ^ – относительно ОФН.

 

В крови при нагрузке возрастает содержание общих, первичных и промежуточных продуктов ПОЛ (табл. 3). Введение ЦП приводит к нормализации общих и промежуточных продуктов ПОЛ.

Таблица 3

Динамика продуктов ПОЛ в сыворотке крови при острой физической нагрузке и при введении церулоплазмина (М±m; σ)

Показатели/

сроки

Контроль

(n=10)

ОФН

(n=9)

ОФН +ЦП

(n=10)

∑ =220 ед/мл

2,99±0,21; 0,63

3,74±0,19*; 0,58

3,69±0,28; 0,84

∑ =232 ед/мл

1,28±0,095; 0,30

1,86±0,15*; 0,44

1,81±0,13*; 0,38

∑ =278 ед/мл

0,804±0,06; 0,21

1,26±0,14*; 0,43

1,13±0,13; 0,39

∑ =400 ед/мл

0,059±0,02; 0,06

0,155±0,07; 0,24

0,084±0,03; 0,10

Достоверность по критерию Манна – Уитни: * – относительно контроля; ^ – относительно ОФН.

Состояние антиоксидантной системы в сыворотке крови при острой физической нагрузке и введении ЦП представлено в таблице 4. В сыворотке крови при ОФН снижается активность каталазы, не изменяется активность СОД и глютатион-редуктазы, повышается церулоплазмин и общая антиокислительная активность. Глютатион-редуктаза, восстанавливающая окисленный глютатион, функционально связана с глютатион-пероксидазой. Введение ЦП приводит к повышению его в крови, нормализации активности каталазы, увеличению активности глютатион-редуктазы относительно контроля, не влияя на мощность общей антиокислительной активности.

Таблица 4

Антиокислительные системы в сыворотке крови при острой физической нагрузке и при введении ЦП (М±m; σ)

Показатели/

сроки

Контроль

(n=10)

ОФН

(n=9)

ОФН +ЦП

(n=10)

СОД, ед/мл

1,46±0,11; 0,40

1,22±0,20; 0,59

1,5±0,18; 0,55

Каталаза, мкат/л

22,84±3,38; 14,36

11,73±1,51*; 4,53

19,67±2,89; 8,66

Глютатионредуктаза, МЕ

8,04±0,32; 1,12

11,49±1,77; 5,01

13,21±1,46*; 4,13

ЦП, мг/л

333,95±22,87;

79,23

498,745±37,37*; 118,18

612,68±27,7*^;

87,64

ОАА, мкмоль/л

216,7±3,94; 18,95

255,6±7,05*; 33,86

253,89±6,69*; 20,09

* – достоверность по критерию Манна – Уитни относительно контроля; ^ – относительно ОФН.

Обсуждение. В настоящее время многочисленные публикации посвящены генерации активных форм кислорода их физиологическому и патологическому действию [10, 5]. Следствием ОФН у нетренированных крыс является увеличение свободных радикалов за счет активации свободнорадикальных процессов в цельной крови, наиболее вероятно связанных с миогенным лейкоцитозом. Это предположение подтверждается снижением СС и МС базального свечения при пересчете на нейтрофилы. Потенциальная способность нейтрофилов к продукции радикалов при ОФН не изменяется, так как величины индуцированного свечения в пересчете на нейтрофилы остаются в пределах контрольных значений. Железоиндуцированная ХЛ и содержание продуктов ПОЛ в сыворотке крови указывают на интенсификацию пероксидации липидов. При ОФН имеется дисбаланс между и ферментативными и неферментативными антиоксидантами и возрастание церулоплазмина, длительности латентного периода и общей антиокислительной активности не компенсирует свободнорадикальную нагрузку. Кроме того, отсутствуют согласованные изменения активности СОД, каталазы и глютатиопероксидазы. Указывается, что активность, стабильность и согласованное действие ключевых ферментов должны быть взаимосвязаны, так как СОД, каталаза, глютатионпероксидаза могут инактивироваться одним из продуктов их ферментативной реакции [5, 17,18]. Более того, продукты ПОЛ являются потенциальными ингибиторами глютатионпероксидазы [5]. Церулоплазмин относится к высокомолекулярным неферментативным антиоксидантам. Антиоксидантные свойства церулоплазмина связаны с хелаторным действием относительно двухвалентных ионов меди, способностью окислять двухвалентное железо и дисмутацией супероксидного анион-радикала [5]. Предварительное введение церулоплазмина не достаточно эффективно относительно ХЛ цельной крови и сыворотки. В крови нет нормализации абсолютных значений базальной и индуцированной ХЛ (светосуммы и максимальной светимости), несмотря на снижение функциональной возможности нейтрофилов к продукции свободных радикалов после введения ЦП. В сыворотке крови на фоне повышения латентного периода не нормализуются – светосумма свечения, амплитуда быстрой и медленной вспышки, первичные продукты ПОЛ. Введение церулоплазмина не способствует дополнительному повышению мощности общей антиокислительной активности (ОАА), но приводит к возрастанию активности каталазы и глютатиоредуктазы. Таким образом, в условиях интенсивной генерации свободных радикалов предварительное введение церулоплазмина не достаточно эффективно. Более того, существует опасность, что церулоплазмин, как металл-связывающий белок, при окислительном стрессе, снижении рН крови и окислительной деструкции может быть источником активных форм металлов переменной валентности [5], провоцирующих свободнорадикальное окисление.

Выводы

У нетренированных крыс предварительное однократное введение церулоплазмина в дозе 50 % от физиологического уровня не приводит к нормализации свободнорадикальных процессов в крови и сыворотке, инициированных острой физической нагрузкой.