В настоящее время накоплены значительные сведения о лечебных и профилактических эффектах различных пептидных препаратов тимуса в отношении целого ряда патологических процессов, их влиянии на состояние некоторых структур нейроэндокринной и иммунной систем, а также на стресс-лимитирующие процессы в ЦНС и реализацию высших интегративных функций мозга [1, 4, 10]. В то же время современные представления о взаимосвязи многоуровневых изменений в организме, вызванных действием пептидов тимуса, имеют фрагментарный характер. Закономерным этапом в развитии этих представлений является исследование влияния пептидных препаратов тимуса на структуру интегральных реакций организма. Целью настоящей работы явилось изучение изменений характера и напряженности общих неспецифических адаптационных реакций организма [2] при использовании тималина у экспериментальных животных предстарческого возраста.
Материалы и методы
Эксперименты проводили на 33 белых беспородных крысах-самцах в возрасте 19–20 месяцев (280–300 г) при соблюдении этических требований гуманного обращения с экспериментальными животными [6]. Препарат тималин, разведенный физиологическим раствором до концентрации 0.5 мг/мл, вводили внутримышечно в наружную поверхность бедра раз в 3 дня в течение 3 недель. При этом стартовая доза тималина составляла 0.14 мг/кг. В дальнейшем проводили изменение стартовой дозы препарата в пределах 0.14 – 0.40 мг/кг в соответствии с экспоненциальным режимом активационной терапии [2]. Использованные дозы, сопоставимые по значению с терапевтическими дозами тималина у людей [1], по своему биологическому действию на организм белых крыс могли быть аналогичны значительно более низким дозам (в 2–5 раз), в силу известной разницы в чувствительности людей и животных к целому ряду биологически активных веществ [7].
Для оценки характера и напряженности АР в ходе эксперимента использовали лейкоцитарную формулу и общее содержание лейкоцитов в крови, взятой из подкожной вены медиальной поверхности бедра. Лейкоцитарная формула рассчитывалась на 200 клеток. Сигнальным показателем характера АР служило относительное число лимфоцитов [2, 9]. Степень напряженности АР, отражающую уровень реактивности организма, на котором развивались АР, оценивали по выраженности отклонений от нормальных значений относительного содержания палочкоядерных нейтрофилов, моноцитов, эозинофилов и базофилов, а также общего содержания лейкоцитов [2].
По окончании эксперимента проводили декапитацию животных под эфирным наркозом. Определяли весовые коэффициенты (ВК) тимуса и надпочечников (вес органа в миллиграммах/вес животного в граммах), а также отношение веса тимуса к весу надпочечников – показателей, также используемых для характеристики АР [2, 9]. Изучение микрокартины тимуса проводили с помощью метода Браше, позволяющего выявлять нуклеопротеиды и оценивать зрелость и степень дифференцировки лимфоидных элементов, а также других клеток исследованного органа. Определяли стромально-паренхиматозный коэффициент (СПК), отражающий соотношение площади стромы и лимфоидной паренхимы тимуса, зависящее от активности лимфопролиферативных процессов в органе. Каждый случай характеризовался данными, полученными при анализе препарата в 10 полях зрения (х 400–900) в каждом из 3–5 срезов органа. По результатам ранжирования данных полуколичественного анализа препаратов тимуса в отдельных полях зрения и усреднения показателей по отдельным случаям оценивали относительное число тканевых базофилов ТБ), степень их дегрануляции, а также признаки их взаимодействия с тимоцитами – по взаимному расположению клеток этих двух видов («контакты»). При этом показатель дегрануляции ТБ мог изменяться в диапазоне от 0 («малое количество гранул у всех клеток и отсутствие признаков дегрануляции») до 3 («выраженная дегрануляция всех выявленных ТБ»). При статистической обработке результатов исследования использовали критерий Вилкоксона –Манна – Уитни и критерий Стьюдента, вариабельность полученных значений оценивали с помощью коэффициента вариации.
Результаты и обсуждение
К концу эксперимента у большинства крыс исследованных групп (более 80 %) относительное число лимфоцитов в лейкоцитарной формуле крови соответствовало АР спокойной или повышенной активации [2]. При этом у части самцов контрольной группы были повышены показатели содержания моноцитов (10–13 %), а также отмечалось наличие базофилов (1 %), что, согласно установленным ранее критериям, свидетельствовало о напряжении антистрессорных АР [2]. Гематологическим признакам напряженности АР у этих животных соответствовало снижение значения ВК тимуса и соотношения веса тимуса и надпочечников. Такие крысы-самцы были выделены в подгруппу 2, тогда как в подгруппу 1 вошли животные, у которых гематологические признаки напряженности отмечены не были, а ВК тимуса и отношение веса тимуса и надпочечников было выше значений этих показателей в подгруппе 2, соответственно в 1.7 и 1.4 раза (табл. 1). Выявленные различия позволяли говорить о более гармоничных регуляторных взаимоотношениях в организме крыс подгруппы 1, что указывало на более высокий уровень реактивности при развитии у них антистрессорных АР по сравнению с уровнем реактивности аналогичных АР у животных подгруппы 2.
В отличие от контрольной группы, в группе крыс, получавших тималин, не было выявлено отклонений параметров лейкоцитарной формулы и уровня лейкоцитов в крови от нормальных значений. В то же время анализ ВК тимуса и надпочечников, а также соотношения веса этих органов позволил выделить также и в этой группе две подгруппы животных, различавшихся по исследованным показателям. Аналогично различиям между подгруппами крыс контрольной группы, у животных, получавших тималин, которые составили подгруппу 1, были отмечены более высокие значения ВК тимуса и отношения веса тимуса к весу надпочечников, чем у самцов подгруппы 2 (табл. 1). При этом соотношения сравниваемых показателей в разных подгруппах животных, получавших тималин, совпадали с аналогичными соотношениями этих показателей у крыс разных подгрупп в контроле (1.7 и 1.4, соответственно, для ВК тимуса и отношения веса тимуса к весу надпочечников). Такой результат мог свидетельствовать о том, что у животных, получавших тималин, которые входили в разные подгруппы, так же, как и у крыс разных подгрупп контрольной группы, имелись отличия в уровнях реактивности, на которых развивались аналогичные антистрессорные АР.
Таблица 1
Изменения в структуре адаптационных реакций (АР) организма белых беспородных
крыс-самцов при воздействии тималина
Группа |
Преобладавшие АР |
ВК тимуса |
ВК надпочечн. |
Вес тимуса/ вес надпочечников |
|
Контроль |
1 n=9 |
СА и ПА |
0.67 ± 0.1 |
0.14±0.01 |
5.2±0.4 |
2 n=6 |
СА и ПА с признаками напряжения |
0.40 ± 0.02 ● |
0.18±0.04 |
3.7±0.2 ● |
|
Тималин |
1 n=13 |
СА и ПА |
0.85 ±0.07 ▲ |
0.11±0.003 ▲٭ |
7.3±0.5 ▲٭ |
2 n=5 |
СА и ПА |
0.50 ± 0.02 ● ٭ |
0.10±0.001 ٭ |
5.1±0.3 ● ٭ |
Обозначения: СА – АР спокойной активации, ПА – АР повышенной активации, ВК – весовой коэффициент;
- – достоверно отличается от значений в подгруппе 1 той же группы, p<0.05;
٭ – достоверно отличается от значений в аналогичной подгруппе контрольной группы, p<0.05;
▲ – достоверно отличается от значений в подгруппе 2 контрольной группы, p<0.05-0.01.
При этом введение тималина в режимах активационной терапии способствовало улучшению адаптационного статуса. Животные, получавшие тималин, отличались более высокими значениями ВК тимуса и весового соотношения тимуса и надпочечников, и более низкими значениями ВК надпочечников по сравнению с этими показателями в аналогичных подгруппах контрольной группы крыс-самцов (разница между соответствующими значениями более 1.2 раз, табл. 1). На основании результатов комплексного сравнения показателей, представленных в таблице 1, можно прийти к заключению о том, что животные подгруппы 1, получавшие тималин, отличались к концу эксперимента наиболее благоприятными характеристиками АР. Несколько ниже можно было оценить адаптационный статус крыс из подгруппы 2, получавших тималин, а также и состояние животных из подгруппы 1 контрольной группы. И, наконец, у крыс подгруппы 2 контрольной группы были отмечены наиболее выраженные признаки напряженности антистрессорных АР. Таким образом, результаты анализа исследованных показателей в целом указывали на повышение уровня реактивности при развитии антистрессорных АР под влиянием тималина.
Изучение особенностей структурно-функционального состояния тимуса как центрального органа иммунной системы позволило получить более полное представление об изменениях в организме исследованных животных при развитии антистрессорных АР разных уровней реактивности, а также о влиянии тималина на иммунные процессы (табл. 2). Микрокартина тимуса в большинстве случаев в целом соответствовала характеру АР, идентифицированному по лимфоцитарному показателю и ВК тимуса и надпочечников [2]. В большинстве случаев при развитии АР спокойной и повышенной активации не менее половины долек отличались крупными размерами. При этом корковое вещество заметно преобладало над мозговым веществом. В то же время, наряду со сходными общими признаками, у крыс исследованных групп имелись особенности, указывающие на различия в состоянии лимфоидной паренхимы центрального органа иммунитета.
Таблица 2
Морфофункциональные изменения в тимусе белых беспородных крыс-самцов при воздействии тималина
Группа |
Характер преобладавших АР |
ВК тимуса |
СПК 103 (c.v.,%) |
Тканевые базофилы |
|||
N отн. |
Степень дегрануляции |
«Контакты» с тимоцитами |
|||||
Контроль |
1 n=9 |
СА и ПА |
0.67 ±0.1 |
12±3 (71%) |
2.0±0.1 |
0.75±0.11 |
отсутствуют |
2 n=6 |
СА и ПА с признаками напряжения |
0.40±0.02 ● |
30±9 ● (67%) |
1.3±0.1 ● |
0.60±0.01 |
отсутствуют |
|
Тималин |
1 n=13 |
СА и ПА |
0.85 ±0.07 ▲ |
11±0.1 ▲ (3%) |
2.2±0.1 ▲ |
1.0±0.07 ▲٭ |
в 20–30 % полей зрения |
2 n=5 |
СА и ПА |
0.50 ±0.02 ●٭ |
12±0.1 ٭ (2%) |
2.0±0.3 ٭ |
1.0±0.30 |
отсутствуют |
Обозначения: СА – АР спокойной активации, ПА – АР повышенной активации, ВК – весовой коэффициент; СПК – стромально-паренхиматозный коэффициент в тимусе, c.v. – коэффициент вариации; Nотн. –среднее число тканевых базофилов в поле зрения (х 900).
Примечания: ● – достоверно отличается от значений в подгруппе 1 той же группы, p<0.05;
٭ – достоверно отличается от значений в аналогичной подгруппе контрольной группы, p<0.05;▲ – достоверно отличается от значений в подгруппе 2 контрольной группы, p<0.05-0.01.
Так, у животных подгруппы 2 контрольной группы наблюдались максимальные значения СПК, в 2.5 раза и более превышавшие значения данного показателя у остальных крыс (табл. 2) и свидетельствовавшие о выраженном сдвиге соотношения элементов стромы и паренхимы в тимусе самцов данной подгруппы в сторону стромы. Это соответствовало представлению о наиболее низком уровне реактивности у этих животных и указывало на относительно невысокую активность лимфопролиферативных процессов в дольках тимуса при развитии напряженных антистрессорных АР.
У крыс остальных исследованных подгрупп были отмечены значительно более низкие значения СПК, свидетельствующие об активизации лимфопролиферативных процессов по сравнению с отмеченным у животных с напряженными антистрессорными АР. При этом вариабельность данного показателя значительно различалась у животных контрольной группы и самцов, получавших тималин. Так, в контрольной группе крыс-самцов коэффициент вариации значений СПК был выше 60 %, что отражало значительные колебания интенсивности процессов пролиферации в лимфоидной паренхиме тимуса этих животных. В то же время у крыс, получавших тималин, рассматриваемый показатель не превышал 3 % (табл. 2), что свидетельствовало о практическом совпадении уровня лимфопролиферативной активности в тимусе крыс данной группы. Это позволяло говорить о сочетании активизирующего и синхронизирующего влияния тималина на пролиферативные процессы в лимфоидной паренхиме центрального органа иммунной системы.
Различия между животными исследованных групп наблюдались также и по показателям активности популяции ТБ тимуса (табл. 2). Так, при развитии напряженных антистрессорных АР у крыс подгруппы 2 контрольной группы количество ТБ, выявленных в дольках тимуса, было ниже, чем у остальных животных (табл. 2). Они могли содержать различное количество гранул, однако при этом признаки дегрануляции не отмечались. Как правило, ТБ были локализованы в области соединительнотканных прослоек между дольками, то есть в отдалении от тимоцитов. Признаки наибольшей активности рассматриваемых клеток иммунной системы были отмечены у самцов подгруппы 1, получавших тималин, с наиболее высоким уровнем реактивности антистрессорных АР по показателям, представленным в табл.1, и гематологическим показателям. Это выражалось в более высокой степени дегрануляции ТБ тимуса этих животных по сравнению с отмеченной у крыс контрольной группы (табл. 2), а также в изменении локализации этих клеток и перемещения значительной их части в корковое вещество долек. Кроме того, только у животных рассматриваемой подгруппы были обнаружены признаки взаимодействия между тимоцитами и ТБ («контакты» клеток) (табл. 2).
Последнее обстоятельство имеет значение, поскольку расположение ТБ с признаками дегрануляции в непосредственной близости к тимоцитам создает условия для воздействия целого ряда биологически активных веществ, содержащихся в гранулах ТБ, на функциональное состояние лимфоидных элементов тимуса [3, 8, 10]. Это воздействие на тимоциты может осуществляться как непосредственно, так и опосредовано, через изменение активности других клеток микроокружения лимфоцитов тимуса [3, 8]. В результате такого воздействия возможно изменение функциональной активности тимоцитов, динамики процессов их созревания, дифференцировки, а также устойчивости к действию проапоптотических факторов, что, в свою очередь, может оказать существенное влияние на иммунные процессы в крови и тканях. Кроме того, имеются сведения о возможном участии ТБ тимуса в нейроиммунных взаимодействиях также и в качестве эффекторных элементов, модифицирующих активность нервных структур [3, 4, 10]. Это может иметь значение для развития интегральных реакций организма под влиянием тималина.
Таким образом, результаты анализа микрокартины тимуса так же, как и анализа гематологических показателей в комплексе с весовыми характеристиками тимуса и надпочечников, указывают на различия в характеристиках антистрессорных АР у крыс-самцов исследованных групп и свидетельствуют о повышении уровня реактивности под влиянием тималина.
Заключение
Результаты проведенного исследования свидетельствуют о благоприятном влиянии тималина, применявшегося в соответствии с алгоритмами активационной терапии, на характеристики общих неспецифических АР организма у белых беспородных крыс-самцов предстарческого возраста. Изменения гематологических показателей, весовых коэффициентов тимуса и надпочечников и их соотношения указывают на повышение уровня реактивности организма при развитии антистрессорных АР, среди которых преобладали АР спокойной и повышенной активации. О повышении уровня реактивности организма под влиянием тималина свидетельствовали также и отмеченные в тимусе морфофункциональные признаки усиления лимфопролиферативных процессов и взаимодействия тимоцитов и тканевых базофилов – клеток, определяющих локальный гомеостаз и способных оказывать влияние на функциональное состояние, дифференцировку и устойчивость Т-лимфоцитов, а также на динамику процессов в нервной системе. При этом внутригрупповые различия в уровне реактивности АР исследованных животных, обусловившие разделение на подгруппы, очевидно, были связаны с различиями в исходном состоянии и индивидуальной чувствительности крыс-самцов в пределах каждой группы.
Как известно, развитие антистрессорных АР спокойной и повышенной активации высоких уровней реактивности в наиболее значительной степени способствует повышению устойчивости организма к действию повреждающих факторов и замедлению процессов старения [2]. Таким образом, повышение уровня реактивности организма под влиянием тималина может иметь большое значение для профилактики патологических процессов и возрастного снижения чувствительности гипоталамуса к сигналам обратной связи [5]. Полученные результаты расширяют представления о биологическом действии препаратов тимуса, указывают на системный механизм, который может определять их профилактические и геропротекторные эффекты, а также на перспективность алгоритмов активационной терапии при использовании факторов тимуса в клинической практике.