В настоящее время у растений методы культуры тканей in vitro применяются для ускорения и повышения эффективности селекционного процесса [1, 7].
Морфогенез клеток растений in vitro может происходить различными путями – от дифференцировки отдельных клеток до развития целого растения. Регенерация растений in vitro может осуществляться путем эмбриогенеза непосредственно из соматических клеток экспланта или каллуса, или путем формирования почек в процессе органогенеза [5, 6]. Регенерация растений из каллуса может осуществляться через органогенез [9, 12] или через соматический эмбриогенез [1, 3, 10].
Применение биотехнологических методов для улучшения характеристик подсолнечника ограничивается слабой регенерационной способностью большинства генотипов в культуре тканей in vitro [1, 7]. Многими авторами показано, что частота регенерации in vitro у подсолнечника варьирует в зависимости от типа использованного экспланта, генотипа растения-донора и состава питательных сред [1-3, 5-7, 9, 10, 12]. В то же время не достаточно информации о влиянии конкретных генетических систем или отдельных генов на этапы морфогенеза соматических клеток подсолнечника в культуре тканей in vitro. Гены короткостебельности оказывают существенное влияние на морфологические, физиологические и биохимические признаки растений, они связаны с балансом эндогенных фитогормонов [11] и, следовательно, могут детерминировать морфогенетические процессы клеток и тканей, в том числе в культуре in vitro.
Целью данного исследования является изучение влияния генотипа и консистенции питательной среды на процессы каллусогенеза и регенерации растений на инициальной питательной среде в культуре соматических тканей in vitro подсолнечника.
Материал и методы исследований
Объектами исследований являлись самофертильная высокорослая линия-реципиент ЮВ-28Б и десять экспериментальных короткостебельных линий подсолнечника, созданных в генофоне линии ЮВ-28Б методом беккроссов на основе использования разных dw-генов. Высота растений у разных короткостебельных линий снижена dw-генами на 35–50 % по сравнению со стандартной линией ЮВ-28Б [4].
Донорные растения исследуемых генотипов выращивали в полевых условиях. Корзинки подсолнечника срезали через две недели после начала цветения. Выбирали семянки из крайних рядов корзинки, стерилизовали 30 % раствором хлорсодержащего препарата «Белизна» в течение 15 минут, промывали стерильной дистиллированной водой не менее 3–4 раз. Незрелые зародыши в стерильных условиях вычленяли и помещали на питательную среду.
На этапе инициации каллусогенеза использовали два варианта среды Мурасиге-Скуга (жидкую без агар-агара и твердую с содержанием агар-агара 8 г/л) с добавлением гидролизата казеина 400 мг/л, фитогормонов 6-бензилоаминопурина (6 БАП) 4 мг/л и нафтилуксусной кислоты (НУК) 2 мг/л. Экспланты, высаженные на питательные среды, культивировали в течение 4 недель в темноте при температуре 25 оC.
Полученные тканевые культуры для регенерации переносили на твердую питательную среду Мурасиге-Скуга с содержанием агар-агара 8 г/л с добавлением 6 БАП 0,5 мг/л, гидролизата казеина 500 мг/л и инозита 100 мг/л. Культивирование проводили на свету при температуре 25 оC. Регенерировавшие побеги пересаживали для корнеобразования на питательную среду Мурасиге-Скуга с добавлением индолилуксусной кислоты (ИУК) 0,2 мг/л, кинетина 0,5 мг/л, гидролизата казеина 500 мг/л и инозита 500 мг/л.
Эксперименты проводили в течение 2008–2010 гг., каждый вариант имел четырехкратную повторность. Полученные данные обрабатывали методом двухфакторного дисперсионного анализа с использованием пакета программ Agros 2.09 [8].
Результаты исследований и их обсуждение
Из тканей экспланта в процессе дедифференциации формировался каллус, к концу четвертой недели на нем выделялись плотные окрашенные зоны меристематической активности, в которых во множестве формировались эмбриоиды. Эти зоны, выделенные из морфогенных каллусов, после переноса на среду для регенерации дифференцировались в почки от 1 до 10 штук на одном каллусе. Другим вариантом морфогенеза являлась прямая регенерация почек и побегов с листьями непосредственно из тканей зародыша, содержащих меристематические клетки.
Часть сформировавшихся побегов на среде с добавлением ИУК 0,2 мг/л, кинетина 0,5 мг/л образовывали корни и после пересадки в почву укоренялись. Вторая часть почек имела аномалии развития: утолщение гипокотиля, отсутствие роста эпикотиля, витрификация побегов, раннее зацветание с образованием одной или нескольких корзинок. Такую особенность развития почек in vitro у подсолнечника отмечают многие авторы [1, 3, 5-7, 9, 12].
Анализ экспериментальных данных показал, что на жидкой среде клетки активно делились без дифференциации и формировалась масса каллусных клеток неокрашенных и активно пролиферирующих. На твердой среде преимущественно наблюдалась прямая регенерация побегов из клеток эксплантов. На раневых поверхностях некоторых эксплантов образовывался каллус плотный меньшего объема.
Анализ результатов экспериментов с помощью двухфакторного дисперсионного анализа позволил оценить влияние факторов А (консистенция питательной среды, 2 градации фактора) и В (генотип изучаемых линий подсолнечника, 11 градаций фактора).
По показателю «выход каллусов от общего количества эксплантов» нулевые гипотезы для изучаемых вариантов, фактора А, фактора В и взаимодействия АВ отвергались. Достоверные различия между вариантами установлены для консистенции питательной среды. На жидкой питательной среде показатель «выход каллусов от общего количества эксплантов» на 22,8 % достоверно больше, чем на твердой питательной среде. На жидкой питательной среде линии с генами dw 1, dw 3, dw 4, dw 5, dw 6, dw 7, dw 8 и dw 10 достоверно превосходили стандарт на 6,7–58,3 %, а линии с генами dw 2 и dw 9 находились на уровне линии-стандарта ЮВ-28Б. На твердой питательной среде линии с генами dw 1, dw 3, dw 5, dw 6 и dw 7 достоверно превышали линию-стандарт на 12,5–44,2 %, линии с генами dw 2, dw 4, dw 8, dw 9 и dw 10 находились на уровне линии-стандарта. В среднем на двух питательных средах линии с генами dw 1, dw 3, dw 4, dw 5, dw 6, dw 7, и dw 10 достоверно превосходили стандарт на 22,5–37,1 %, а линии с генами dw 2, dw 8 и dw 9 находились на уровне линии-стандарта ЮВ-28Б (табл. 1).
Таблица 1
Влияние генотипа и консистенции питательной среды на выход каллусов от общего количества эксплантов в культуре in vitro соматических клеток и тканей подсолнечника (2008–2010 гг.), %
Градации фактора А |
Градации фактора В |
Средняя по фактору А |
|||||||||||
ЮВ-28Б st |
ЮВ-28Б dw 1 |
ЮВ-28Б dw 2 |
ЮВ-28Б dw 3 |
ЮВ-28Б dw 4 |
ЮВ-28Б dw 5 |
ЮВ-28Б dw 6 |
ЮВ-28Б dw 7 |
ЮВ-28Б dw 8 |
ЮВ-28Б dw 9 |
ЮВ-28Б dw 10 |
|||
Жидкая питательная среда |
15,0 |
73,3 |
17,5 |
71,7 |
23,3 |
45,0 |
60,8 |
66,7 |
21,7 |
16,7 |
59,2 |
42,8 |
|
Твердая питательная среда |
10,8 |
25,0 |
11,7 |
23,3 |
11,7 |
55,0 |
28,3 |
27,5 |
7,5 |
7,5 |
11,7 |
20,0 |
|
Средняя по фактору В |
12,9 |
49,2 |
14,6 |
47,5 |
17,5 |
50,0 |
44,6 |
47,1 |
14,6 |
12,1 |
35,4 |
- |
|
Варианты |
Fфакт. |
92,232* |
|||||||||||
НСР0,5 |
6,5 |
||||||||||||
Фактор А |
Fфакт. |
517,387* |
|||||||||||
НСР0,5 |
2,0 |
||||||||||||
Фактор В |
Fфакт. |
102,407* |
|||||||||||
НСР0,5 |
4,6 |
||||||||||||
Взаимодействие АВ |
Fфакт. |
39,540* |
|||||||||||
НСР0,5 |
6,5 |
* – здесь и далее Fфакт.≥ Fтеор.
По показателю «выход регенерантов от общего количества эксплантов» нулевые гипотезы для вариантов, фактора А, фактора В и взаимодействия АВ отвергались. Достоверные различия между вариантами установлены для консистенции питательной среды. На твердой питательной среде показатель «выход регенерантов от общего количества эксплантов» на 22,7 % достоверно больше, чем на жидкой питательной среде. На жидкой питательной среде линии с генами dw 3, dw 5, dw 6, и dw 7 достоверно превосходили стандарт на 7,5–44,2 %, линии с генами dw 1, dw 2, dw 4, dw 8, dw 9 и dw 10 находились на уровне линии-стандарта ЮВ-28Б. На твердой питательной среде линии с генами dw 1, dw 3, dw 6 и dw 7 достоверно превышали линию-стандарт на 16,7–25,8 %, линии с генами dw 5 и dw 8 на уровне линии-стандарта, а линии с генами dw 2, dw 4, dw 9 и dw 10 значимо уступили на 15,8–27,5 % стандарту. В среднем на двух питательных средах независимо от концентрации питательной среды линии с генами dw 1, dw 3, dw 5, dw 6 и dw 7 достоверно превосходили стандарт на 12,0–23,3 %, линия с геном dw 8 находилась на уровне линии-стандарта ЮВ-28Б, а линии с генами dw 2, dw 4, dw 9 и dw 10 значимо уступили на 9,6–10,9 % стандарту (табл. 2).
Таблица 2
Влияние генотипа и консистенции питательной среды на выход регенерантов от общего количества эксплантов в культуре in vitro соматических тканей подсолнечника (2008–2010 гг.), %
Градации фактора А |
Градации фактора В |
Средняя по фактору А |
|||||||||||
ЮВ-28Б st |
ЮВ-28Б dw 1 |
ЮВ-28Б dw 2 |
ЮВ-28Б dw 3 |
ЮВ-28Б dw 4 |
ЮВ-28Б dw 5 |
ЮВ-28Б dw 6 |
ЮВ-28Б dw 7 |
ЮВ-28Б dw 8 |
ЮВ-28Б dw 9 |
ЮВ-28Б dw 10 |
|||
Жидкая питательная среда |
12,5 |
15,8 |
15,8 |
28,3 |
19,2 |
56,7 |
32,5 |
20,0 |
11,7 |
15,0 |
9,2 |
21,5 |
|
Твердая питательная среда |
45,0 |
67,5 |
20,0 |
64,2 |
17,5 |
47,5 |
70,8 |
61,7 |
39,2 |
23,3 |
29,2 |
44,2 |
|
Средняя по фактору В |
28,8 |
41,7 |
17,9 |
46,3 |
18,3 |
52,1 |
51,7 |
40,8 |
25,4 |
19,2 |
19,2 |
- |
|
Варианты |
Fфакт. |
56,836* |
|||||||||||
НСР0,5 |
7,5 |
||||||||||||
Фактор А |
Fфакт. |
390,604* |
|||||||||||
НСР0,5 |
2,3 |
||||||||||||
Фактор В |
Fфакт. |
53,297* |
|||||||||||
НСР0,5 |
5,3 |
||||||||||||
Взаимодействие АВ |
Fфакт. |
26,999* |
|||||||||||
НСР0,5 |
7,5 |
Заключение
На инициальной питательной среде наблюдалось два варианта морфогенеза тканей эксплантов в культуре тканей in vitro подсолнечника: каллусогенез и прямая регенерация побегов по отдельности или одновременно. Установлено достоверное влияние консистенции питательной среды на направление морфогенеза. Использование жидкой питательной среды стимулировало каллусогенез, а на твердой питательной среде преобладала прямая регенерация побегов.
Достоверный положительный эффект на процессы каллусогенеза и регенерации на среде для инициации в культуре тканей in vitro отмечен у короткостебельных линий, несущих гены dw 1, dw 3, dw 5, dw 6, dw 7 и dw 10. Установлено достоверное взаимодействие между консистенцией питательной среды и генотипом изучаемых линий.