Процесс созревания ооцитов млекопитающих регулируется гормонами, ростовыми факторами, циклическими нуклеотидами и другими веществами, которые воздействуют как на ооцит, фолликулярные клетки (кумулюсные и гранулярные), образующие с ооцитом метаболически единую систему, так и сосудистую систему гонад. Регулирование развития ооцита млекопитающих и процесс возобновления мейотического созревания активно изучают [1, 2, 3, 4, 6].В настоящее время появляется все больше доказательств использования позвоночными разнообразных путей передачи сигналов в процессе регуляции гомеостаза. Существенную роль здесь играют молекулы оксида азота (NO), монооксида углерода и сероводорода. Оксид азота является эффективным посредником многообразных биологических эффектов, в частности, через активацию растворимой гуанилатциклазы [5]. Среди мишеней: тонус гладких мышечных клеток, агрегация тромбоцитов и адгезия, клеточный рост и апоптоз, синапсис [5, 8, 10]. Так как эти механизмы связаны с патофизиологией некоторых репродуктивных процессов, стало ясно, что NO может играть значительную роль в репродукции.
NO и функции яичников. Об участии NO в модуляции функции яичников свидетельствует ряд исследований, направленных на демонстрацию продукции оксида азота в яичнике и на уточнение его роли в регуляции стероидогенеза, развития фолликулов, овуляции, лютеиновой функции и лютеиновой регрессии [6, 11, 13, 16].
NO и фолликулогенез. Хорошо известно, что фолликулогенез и овуляция регулируются множеством факторов, таких как цитокины, факторы роста, а также местные факторы регуляции, среди которых оксид азота, по-видимому, играет важную роль. Уровень оксида азота, как было показано, изменяется с ростом фолликулов. Развитие фолликулов у неполовозрелых крыс, связанно с увеличением экспрессии eNOS (но не iNOS), но последующая стимуляция ХГЧ вызывает увеличение обеих изоформ фермента [12, 19]. С другой стороны, описано снижение уровня мРНКiNOS в гранулезных клетках незрелых фолликулов крыс, следовательно, оксид азота может представлять собой цитостатический фактор [22]. Эта гипотеза была усилена результатами недавних исследований, проведенных на крысах, которые также показывают, что ГнРГ и эндотелиальный фактор роста индуцируют снижение уровня мРНКiNOS [9, 15].
В отличие от предыдущих исследований, рост-стимулирующее влияние NO поддерживается наблюдениями, что оксид азота увеличивает количество рецепторов к эндотелиальному фактору роста в гранулезных клетках яичника крысы [9]. Однако обработка гранулезных клеток фолликулов разных размеров у крупного рогатого скота донорами NO (SNAP) не влияет на пролиферацию [12]. Вышеприведенные результаты свидетельствуют о том, что точная роль NO в регуляции роста клеток еще до конца не изучена. Возможно, что эффект оксида азота сильно зависит от взаимодействия с другими модулирующими факторами роста, действующими внутри яичника [4, 5].
NO в фолликулярной жидкости и апоптоз фолликулярных клеток. Механизмом, через который NO может быть вовлечен в контроль развития фолликулов, является его влияние на апоптоз, запрограммированную гибель клеток, за счет которых большинство фолликулов яичников элиминируются во время постнатальной жизни [2, 5]. Различные данные некоторых авторов, изучавших человеческие клетки гранулезы, не подтверждают участие оксида азота в регуляции апоптоза. NO может также влиять на развитие фолликула, опосредующим эффектом гонадотропинов через фолликулярный барьер, таким образом, влияя на его проницаемость для различных веществ.
Считают, что NO в фолликулярной жидкости продуцируется еNOS гранулезных клеток, поскольку среди изолированных человеческих фолликулярных клеток по крайней мере 90 % - это клетки гранулезы [7]. Незначительная разница в уровне NO в больших и малых фолликулах предполагает различия в ответах на NO в разных типах фолликулов. Сообщают об отсутствии корреляции между фолликулярным уровнем NO и зрелостью или качеством фолликула [14].
Показана взаимозависимость в концентрации NO, фолликулярного роста и апоптоза клеток фолликулярного эпителия [23]. Есть данные о том, что низкие концентрации NO предотвращают апоптоз, тогда как высокие концентрации NO, как и усиленная генерация пероксинитрита из-за недостатка аргинина, увеличивают апоптоз эпителиальных клеток фолликула. Кроме того, ИЛ-1β-индуцированный антиапоптотический эффект также NO-опосредованный [21]. В малых фолликулах пациенток программы ЭКО процент апоптотических фолликулярных клеток с ядерной фрагментацией выше в сравнении с таковым в больших фолликулах [24]. Данные литературы позволяют утверждать, что NO вовлечен в фолликулогенез и апоптическую гибель фолликулярных клеток и принимает участие в регуляции мейотического созревания ооцитов. Ингибирование апоптоза с участием NO ассоциировано с активацией гуанилатциклазы, индукцией антиапоптических механизмов за счет гемооксигеназы и циклооксигеназ, ингибированием каспаз за счет S-нитрозилирования или через цГМФ-зависимые механизмы, ведущие к активации каспаз, индукции белка теплового шока Hsp70, а также подавлению экспрессии гена Bax [17].
Установлено, что NO изменяет ДНК-связывающую активность многих транскрипционных факторов за счет S-нитрозилированиятиоловых групп цистеина и последующего образования S-нитрозотиолов, что служит пусковым механизмом трансдукции сигнала. С помощью S-нитрозилирования может регулироваться функция многих тиолсодержащих ферментов, включая транскрипционные факторы NF-kBAP и СКЕВ [5]. NF-kB, в свою очередь, может стимулировать экспрессию антиапоптических генов bcl-XL, x-IAP, cI-API, cIAP2 и A20 [3, 5].
Зависимость направленности апоптической реакции от концентрации NO прослеживается на примере функционирования митохондрий. Эти органеллы содержат большое количество гемсодержащих, а также железо- и серосодержащих белков, с которыми NO активно соединяется [25]. Было показано, что NO в низких концентрациях оказывает стабилизирующее действие на мембрану митохондрий, высокие же концентрации разобщают окислительное фосфорилирование на уровне цитохромоксидазы, увеличивая количество супероксидного аниона и синтез пероксинитрита. Пероксинитрит, в свою очередь, ингибирует практически все компоненты электронной транспортной цепи путем окисления цистеина, нитролизирования тирозина и повреждения Fe-S-центров белков. Пероксинитритприводит к открытию пор во внешней митохондриальной мембране, усугубляя процессы дегенерации [25].
Обобщая результаты о влиянии NO на фолликулогенез можно предположить, что местная продукция оксида азота способствует модулированию развития фолликула и, возможно, предотвращает апоптоз, по крайней мере, в низких концентрациях, в то время как высокие уровни могут способствовать гибели клеток через образование пероксинитрита.
NO и овуляция. Процесс овуляции зависит от скоординированной активности гонадотропинов и стероидных гормонов, а также медиаторов, вовлеченных в воспалительные реакции, такие как цитокины, простагландины, лейкотриены и так далее. Результаты недавних исследований свидетельствуют о вовлеченности NOS/NO системы в овуляторный механизм, в основном посредством его воздействия на сосудистую сеть и простагландины. Местное применение ингибиторов iNOS подавляет процесс овуляции у крыс. Аналогичные результаты были получены при ХГЧ-обработке кроликов и системного определения блокаторов NO, тормозящих овуляцию и подавляющих положительное влияние ИЛ-1 на ЛГ-индуцированную овуляцию у крыс [11, 12, 21].Роль eNOS в овуляции кажется более важной, чем iNOS, даже если результаты по-прежнему противоречивые. На самом деле, у крысы текальный и стромальныйкомпартментыэкспрессируют высокий уровень eNOS во время овуляции. Кроме того, недостаточность eNOS у мышей показывает взаимосвязь с уменьшением овуляторного потенциала после идукции суперовуляции и при недостаточности eNOS у самок с нокаутированным геном наблюдалось значительное снижение ХГЧ-индуцированной овуляции [11]. Возможный механизм стимуляции овуляторного процесса с помощью NO включает в себя выработку простагландинов (ПГ), которые усиливают воспалительный процесс в периовуляторный период путем прямой активации циклооксигеназы [11]. Перекрест биосинтетических путей между NO и ПГ наблюдается также, как и стимулирующий эффект от NO на продукцию ПГF2α в больших фолликулах у коров. Было высказано предположение, что оксид азота может способствовать разрыву фолликула через увеличение внутрифолликулярного давления, либо за счет усиления сосудистого кровотока и пропотевания жидкости в полость фолликула, стимулируя сократительные элементы стенки фолликула [12]. По утверждению авторов, именно NO запускает увеличение притока крови в яичник, что важно для осуществления овуляции [10].
NO и созревание ооцитов. Синтез оксида азота, вероятно, также будет иметь важное значение для созревания яйцеклетки, так как у мышей с нокаутированным геном eNOS выявлено уменьшение числа ооцитов в метафазе II мейоза и высокий процент яйцеклеток остался в метафазе I [20]. Определено влияние блокаторов NOS и доноров NO на количество овариальных ооцитов мышей на разных стадиях эстрального цикла и на способность таких ооцитов осуществлять мейотическое созревание іnvіtro[21]. Доноры NO увеличивают количество овариальных ооцитов и их способность к возобновлению мейоза у самок мышей на стадии проэструса, стимулируют способность ооцитов к завершению мейотического созревания у мышей на стадии как диэструса, так и проэструса. Под влиянием доноров NO увеличивается количество ооцитов с атипической морфологией. Блокаторы NOS уменьшают количество овариальных ооцитов, влияют на количество ооцитов с атипической морфологией и угнетают мейотическое созревание ооцитов на всех стадиях эстрального цикла у мышей. Максимальное уменьшение количества овариальных ооцитов происходит у самок мышей на стадии эструса, а максимальное угнетение способности к завершению мейотического созревания овариальными ооцитами - на стадии проэструса [1, 21].
Известно, что NO увеличивает уровень циклического цГМФ в клетках-мишенях [14, 15]. Считают, что именно цГМФ с помощью активации ооцитарнойцАМФ-фосфодиэстеразы уменьшает уровень цАМФ и запускает созревание ооцитов [19]. Есть данные о том, что сосредоточение цГМФ в кумулюсно-ооцитарных клеточных комплексах не является ответственным за влияние NO на мейотическое созревание ооцитов, а временное уменьшение внутриооцитарного уровня NO может вызвать возобновление мейотического созревания ооцитов млекопитающих [20].
Экспериментальные данные с использованием донора и блокатора NOS показывают, что NO, продуцированный кумулюсными клетками, оказывает регуляторное влияние на уровень митохондриальной полярности в субплазмолеммальной цитоплазме соответствующего ооцита. Культивирование изолированных и окруженных клетками кумулюса ооцитов в условиях низкой и высокой концентрации кислорода предполагает, что конкурирование между кислородом и NO на уровне митохондрий может регулировать уровень митохондриальной полярности и поддерживать митохондриальный гомеостаз в преовуляторном ооците, а также сдвигать его в сторону более высоких значений (полярности), которые регистрируются после овуляции [23, 25].
Таким образом, NO - важный регуляторный агент в обеспечении нормальной овуляции, особенно в период роста и созревания главного фолликула, содержащего внутри себя ооцит.
NO и желтое тело. Некоторыми авторами показано, что на всех стадиях фолликулярного развития клетки жeлтого тела (КЖТ) синтезировали оксид азота, и скорость его синтеза была максимальной в КЖТ из лютеинизированных яичников. Используя иммунофлуоресцентный анализ, показали, что КЖТ из лютеинизированных яичников экспрессируют как эндотелиальную, так и индуцибельную формы синтазы оксида азота. Авторы считают, что оксид азота вовлечен в функциональную регрессию желтых тел за счет подавления им стероидогенеза [11].
Многие факторы свидетельствуют о том, что NO участвует в регуляции развития и функции желтого тела, но эти данные не однозначны и противоречивы. Mottaetal. (2001) отмечают, что в стадию расцвета желтого тела NO стимулирует как глутатион, основной антиоксидант, так и прогестерон, тем самым способствуя поддержанию желтого тела [16]. Оксид азота вместе с ПГЕ воздействует на сосудистую сеть и протеолитические процессы. Недавние результаты указывают на то, что iNOS-опосредованная NO секреция стимулирует синтез ПГЕ, который в свою очередь, эффективно повышает продукцию прогестерона. Положительный эффект оксида азота на синтез прогестерона в лютеиновых клетках также был показан и у крыс. Авторы предположили, что NO может уменьшить или предотвратить лютеолитический эффект простагландинов и, таким образом, поддержать адекватный уровень прогестерона, но точные механизмы, с помощью которых он оказывает это действие, остаются до конца не изученными. Оксид азота также, возможно, участвует в контроле лютеиновой васкуляризации. В самом деле, NO, вырабатываемый эндотелиальными лютеиновыми клетками, увеличивает приток крови, стимулируя расслабление гладких мышц артериол, и способствует ангиогенезу за счет увеличения продукции сосудистого эндотелиального фактора роста в капиллярных клетках [18]. Экспрессия eNOS, а также общая активность NOS, уменьшается со старением желтого тела у различных животных и человека [2, 18].
Заключение. К настоящему времени, несмотря на интенсивные исследования роли газотрансмиттеров в реализации внутриклеточных преобразований в различных органах, не существует детальной картины данного процесса в важнейшем органе репродуктивной системы - яичнике. Различные механизмы, активирующие или подавляющие стероидогенез, фолликулогенез и сосудистые реакции, тесно переплетены между собой и, зачастую, трудно выделить конкретное влияние NO. Сегодня накоплено равное количество фактических данных, свидетельствующих как о защитных, так и о цитотоксических эффектах NO, H2S и CO, иногда напрямую противоречащих друг другу. Четкого представления о механизмах и зависимости овариального цикла от присутствия оксида азота в настоящее время не сложилось и требует дальнейших исследований. Создание экспериментальной модели и изучение влияния газовых посредников на преобразования в яичниках позволит получить фундаментальные знания для разработки подходов к лечению заболеваний репродуктивной системы.
Рецензенты:Матвеева Н.Ю., д.м.н., профессор, зав. кафедрой гистологии, эмбриологии и цитологии, ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ,г.Владивосток;
Калиниченко С.Г., д.м.н., ст. научный сотрудник, ЦНИЛ ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ, г.Владивосток.