Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

DEVELOPMENT OF NEW ANTIBACTERIAL DRUGS – ISSUES AND POSSIBILITIES

Zubov P.V. 1 Novikova V.V. 1
1 Perm State Pharmaceutical Academy
The article provides an overview of the situation on the field of antibiotics. Registration of new antibiotics in the last few years in Russia and the world is analyzed in article. The factors influencing the decision of pharmaceutical companies to invest in the development of new antibiotics such as the spread of resistant bacterial strains, the high cost of research and development of a new drug, long duration of return of investment, and others are reviewed. The second part of the article describes the modern approaches to the search for previously unknown targets in the bacterial cell and the new substances with antibacterial activity - the methods used for the screening of the mechanism of action of new derived compounds. Also a review of the works which are based on the analysis of the genome of producers of antibiotics is provided. The article can be useful to chemists specializing in synthesis of new biologically active substances, as well as for all professionals working in the field of pharmaceutical and medical chemistry.
genome analysis
screening
resistance
antimicrobials
Каждый год в мире от инфекционных заболеваний умирает 17 млн. человек, в соответствии с данными ВОЗ, на сегодняшний день инфекционные заболевания занимают 3-4 месте в рейтинге причин смертности [2]. В России, согласно отчету Росстата за 2014год,смертность от инфекционных заболеваний составляет порядка двух процентов от общего числа умерших, что говорит об относительно благополучной ситуации.Однако следует учитывать, что при статистическом анализе учитывают первичную причину смерти. Согласно нормативным документам, первоначальная причина смерти – это болезнь или травма, вызвавшая цепь событий, непосредственно приведших к смерти, поэтому, при подсчете количества умерших не учитываются осложнения или причины инфекционного происхождения, спровоцировавшие обострение основного заболевания и приведшего в итоге к летальному исходу. По этим причинам, вероятней всего, количество смертей, вызванных или спровоцированных микроорганизмами, выше, чем приведенная цифра. Таким образом, несмотря на наличие в настоящее время большого количества методов и средств для лечения инфекций, данная группа заболеваний остается достаточно значимой для здравоохранения и человечества в целом.

Особое опасение и тревогу вызывает распространение резистентных штаммов микроорганизмов [19]. На рисунке 1 приведен график на основании информации Американского общества специалистов по инфекционным болезням (IDSA), отражающий распространенность наиболее важных видов резистентных к антибиотикам микроорганизмов.На графике видно, что количество резистентных к антибиотикам штаммов, выявляемых в клиническом материале, растет год от года.

Рис. 1. Динамика распространения наиболее важных резистентных бактериальных штаммов. MRSA – метициллин резистентный Staphilococcusaureus, VRE–ванкомицин резистентные бактерии семейства Enterobacteriaceae, FQRP – резистентные к фторхинолонамPseudomonasaeruginosa [13]

Общую статистику по всем случаям инфекционных заболеваний, вызванных резистентными микроорганизмами, привести достаточно сложно. Считается, что порядка 70% внутригоспитальных инфекций вызваны штаммами, которые устойчивы к одному или нескольким антибиотикам. По последней доступной статистике за 2006 год в России ежегодно регистрируется около 60 тысяч случаев внутрибольничных инфекций [3], хотя, по оценкам экспертов, эта цифра выше в 40-50 раз [4].

Уже через 7 лет после введения в практику пенициллина, 50% штаммов Staphylococcusaureusбыли невосприимчивы к действию этого антибиотика по причине распространения штаммов бактерий, вырабатывающих пенициллиназу [23]. В дальнейшем, после введения в практику метициллина, устойчивого к воздействию указанного фермента, появились устойчивые бактериальные штаммы, объединенные в дальнейшем в группу MRSA (methicillinresistantStaphylococcusaureus), резистентность которых обусловлена другим механизмом – бактериальная клетка изменяла белок-мишень, предотвращая, таким образом, его блокирование. Кроме того, помимо снижения чувствительности к антибиотикам, штаммы MRSA более вирулентны – в частности, смертность при бактериемии, вызванной штаммами MRSA, значительно выше по сравнению с уровнем смертности при бактериемии, вызванной штаммами Staphylococcusaureus, чувствительными кметициллину [12].

Наибольшее внимание обращает на себя факт увеличения количества зарегистрированных случаев появления устойчивых к резервным антибиотикам штаммов, например, количество сообщений о появлении штаммов S. aureus, резистентных к ванкомицину,увеличилось с 2 в 2002 году до 12 в 2010 [21].

Более того, проблема инфекций, вызванных резистентными штаммами бактерий, начала выходить за рамки лечебных учреждений – сообщалось о случаях заболеваний, вызванных MRSA, полученных при использовании одного комплекта спортивного оборудования несколькими людьми [21].

На рисунке 2 приведена схема, отражающая время внедрения в практику антибиотика и время появления первых сообщений о появлении резистентных штаммов чувствительных ранее видов микроорганизмов. Как видно на схеме, скорость появления резистентных штаммов микроорганизмов к вновь введенным в практику антибактериальным препаратам варьирует от 1 до 10 лет.

Рис. 2. Внедрение в практику антибиотиков и появление резистентных штаммов [21]

Таким образом, очевидно, что на сегодняшний день, имеется острая необходимость в новыхантибактериальных препаратах. Однако, несмотря на это, ситуация с введением в практику препаратов этой группы год от года ухудшается – количество вводимых в практику антибиотиков падает.

Проанализировав информацию из литературных источников и отчетов FDA (Foodanddrugadministration), мы получили следующую закономерность (рис. 3). Из диаграммы видно, что ежегодно в среднем регистрируется порядка 1-2 антибиотиков преимущественно с известным ранее механизмом действия. Из 184 препаратов, зарегистрированных за последние пять лет ведомством FDA, только 12% были антимикробными препаратами.

Рис. 3. Количество зарегистрированных FDA антибиотиков с 2000 по 2014 год

В таблице 1 приведены зарегистрированные FDA с 2000 года антибиотики (на основании информации из [9] и отчетов FDA за 2013 и 2014 года), а также информация об их регистрации в России (на основании информации государственного реестра лекарственных средств по состоянию на 6 июля 2015 года). Из таблицы видно, что большая часть антибиотиков, зарегистрированных в западных странах, с некоторой задержкой, но регистрируется также и в России.

Таблица 1

Зарегистрированные с 2000 год антибиотики – их характеристики и статус регистрации в России.

Год регистрации

Название препарата

Класс

Спектр действия

Происхождение

Год регистрации в РФ

2000

Линезолид

Оксазолидиноны

Гр+*

Синт***

2006

2001

Телитромицин

Макролиды

Гр+ / Гр-**

Прир****

2004

2002

Биапенем

Карбапенемы

Гр+ / Гр-

Прир

-

2002

Эртапенем

Карбапенемы

Гр+ / Гр-

Прир

2008

2002

Прулифлоксацин

Фторхинолоны

Гр+ / Гр-

Синт

-

2002

Пазуфлоксацин

Фторхинолоны

Гр+ / Гр-

Синт

-

2002

Балофлоксацин

Фторхинолоны

Гр+ / Гр-

Синт

-

2003

Даптомицин

Липопептиды

Гр+

Прир

2009

2004

Гемифлоксацин

Фторхинолоны

Гр+ / Гр-

Синт

2006

2005

Дорипенем

Карбапенемы

Гр+ / Гр-

Прир

2008

2005

Тигециклин

Тетрациклины

Гр+ / Гр-

Прир

2009

2007

Ретапамулин

Плевромутилины

Гр+

Прир

2011

2007

Гареноксацин

Хинолоны

Гр+ / Гр-

Синт

-

2008

Цефтобипроламедокарил

Цефалоспорины

Гр+ / Гр-

Прир

2009

2008

Ситафлоксацин

Фторхинолоны

Гр+ / Гр-

Синт

-

2009

Тебипенемпивоксил

Карбапенемы

Гр+ / Гр-

Прир

-

2009

Телаванцин

Гликопептиды

Гр+

Прир

2015

2009

Антофлоксацин

Фторхинолоны

Гр+ / Гр-

Синт

-

2009

Безифлоксацин

Фторхинолоны

Гр+ / Гр-

Синт

-

2010

Цефтаролинафосамил

Цефалоспорины

Гр+ / Гр-

Прир

2012

2011

Фидаксомицин

Макроциклические антибиотики

Гр+

Прир

-

2012

Бедаквилин

Диарилхинолины

Гр+ (ТБ)

Синт

2013

2014

Далбаванцин

Гликопептиды

Гр+

Прир

-

2014

Тедизолид

Оксазолидиноны

Гр+

Синт

-

2014

Оритаванцин

Гликопептиды

Гр+

Прир

-

2014

Цефтолозан/тазобактам

Цефалоспорин+ ингибитор β-лактамаз

Гр+ / Гр-

Прир

-

* Гр+ – грамположительные, ** Гр- – грамотрицательные, *** Синт – синтетического происхождения, ****Прир – природного происхождения

Снижение количества вновь регистрируемых антибиотиков вызвано низкой инвестиционной привлекательностью данной группы препаратов у производителей. Помимо уже упомянутой высокой скорости распространения резистентных штаммов, данной ситуации способствуют еще несколько факторов:

1.                  Высокая стоимость разработки и вывода на рынок нового препарата

С 2003 года стоимость работ, проведенных до получения компанией-разработчиком регистрационного удостоверения от FDA, увеличилась более чем в два раза и в настоящее время составляет в среднем 2,6 миллиарда долларов [6], [14].

К сожалению, нам не удалось найти исследований, посвященных стоимости исследовательских работ, проводимых российскими фармацевтическими компаниями до вывода препарата на рынок. Приведем лишь размеры выплат государственным органам за процедуры, необходимые для регистрации препарата. В случае регистрации препарата, который не был в обращении на территории РФ в течение более чем 20 лет, размер государственной пошлины составит 350 000 рублей, а в случае отсутствия проведенных клинических исследований, сумма увеличится еще на 100 000 рублей (на основании требований Налогового кодекса РФ и ФЗ № 61). Таким образом, сумма только государственных пошлин при регистрации препарата в РФ, составляет около полумиллиона рублей.

Ситуацию усугубляет короткий срок действия патентной защиты – 20 лет. За это время необходимо провести доклинические и клинические испытания, зарегистрировать препарат, что занимает, в среднем, около 10 лет. Таким образом, фармацевтические компаниирасполагают сроком около10 лет,чтобы вернуть затраченные средства и получить прибыль.

2.                  Короткий курс приема антибактериальных препаратов

В отличие от препаратов, применяемых для лечения сердечнососудистых, пульмонологических, онкологических и других заболеваний, курс приема антибиотиков редко превышает 4 недели, даже в самых серьезных случаях. В среднем прием антибиотиков длится 7 – 14 дней. Этот факт также способствует отказу фармацевтических компаний от дальнейшей разработки антибактериальных препаратов, по причине недостаточно большого объема средств, получаемых от реализации антибиотиков.

3.                  Введение антибиотиков в резерв

После регистрации новых антибактериальных препаратов, регуляторные органы, как правило, в целях предотвращения быстрого развития резистентности, ограничивают обращение этих препаратов [11]. Данный факт еще более ухудшает положение антибиотиков в качестве объекта для инвестиций.

Все вышеперечисленные причины приводят к тому, что крупные фармацевтические компании все чаще отказываются от работ в области разработки новых антибиотиков.

Подходы к получению новых антибактериальных препаратов

Несмотря на все вышеперечисленные причины, новые антибиотики регистрируются. В настоящее время разработкой новых антибактериальных препаратов занимаются небольшие биотехнологические компании, которые, как правило, расположены в США (например, Achaogen, AiCuris, Basilea, Cempra, и др.)[17]. Рассмотрим основные тенденции в области поиска новых биологически активных веществ с антибактериальными свойствами.

Сплошной и направленный скрининг вновь синтезированных или выделенных из природных источников веществ

Скрининг вновь синтезированных соединений – это ранний подход в поиске новых веществ с антибактериальной активностью. Данное направление широко используется российскими учеными[1], [5]. Сплошной скрининг вновь полученных веществ имеет ряд неоспоримых преимуществ –возможность изучения широкого круга соединений, простота используемых методик, возможность быстрого получения практического результата анализа.Тем не менее, этот подход не обладает должной продуктивностью и вытесняется современными методиками, которые учитывают биологические особенности микроорганизмов и человека и, как следствие, позволяют получать более активные и безопасные вещества быстрее и с меньшими усилиями.

Анализ генома патогенных бактерий на предмет выявления потенциальных мишеней

Отличительной чертой большинства используемых в настоящее время методов поиска антибиотиков является широкое использование информации, получаемой в ходе анализа генома микроорганизмов – как патогенных болезнетворных, являющихся мишенью антибиотиков, так и генома основных известных продуцентов антибиотиков (например, актиномицетов).

В 1995 году был полностью секвенирован геном Haemophilusinfluenzae[15]. Сразу после публикации результатов секвенирования генома Haemophilusinfluenzaeкомпанией GlaxoSmithKline были начаты работы по выявлению генов наиболее важных белков упомянутой бактерии, которые впоследствии могли бы стать мишенями для новых антибиотиков. Используя антисмысловыемикроРНК и плазмиды с индуцибельными промоторами (более подробно использованные методы описаны в статьях –[18], [10], [22]), регулируя экспрессию генов, анализировали физиологические проявления пониженной экспрессии тех или иных генов бактерии, после чего анализируемый ген вырезали, получая нокаутные штаммы. При культивировании подобного рода нокаутных штаммов не должно было наблюдаться роста, что подтверждало критическую важность тех или иных белков бактерии.

Через некоторое время после начала описанных выше работ, были опубликованы результаты полного секвенирования генома Moraxellacatarrhalis, Streptococcuspneumoniae, Staphylococcusaureus и Enterococcusfaecalis. Для выбора общих, универсальных для бактерий белков, в целях определения мишеней для антибактериальных веществ широкого спектра действия, был проведен анализ геномов на выявление белков с наиболее консервативной аминокислотной последовательностью среди перечисленных бактерий и Haemophilusinfluenzae. Таким образом было выделено более 300 консервативных белков, которые в дальнейшем были также проанализированы на значимость для каждого из видов бактерий с использованием описанной выше методики. По результатам анализа из 300 белков были выделены 160 наиболее важных белков, блокирование которых вызывает гибель бактериальной клетки [18], [20].

Таким образом, на сегодняшний день доступна вся требуемая информация для проведения направленного синтеза веществ с антибактериальным действием – белки-мишени определены, информация о белках имеется в открытом доступе.

Анализ вторичных метаболитов продуцентов антибиотиков

Другим важным направлением поиска антибиотиков является анализ генома микроорганизмов-продуцентов. Наибольшее количество имеющихся на рынке антибиотиков являются продуктами жизнедеятельности актиномицетов. Эти вещества используются не только в качестве антибактериальных препаратов, но и играют большую роль при лечении онкологических заболеваний [7], [21].После анализа данных, полученных при полном секвенировании генома актиномицетов, выяснилось, что размер генома актиномицетов несколько больше по сравнению с геномом других групп бактерий. В ходе дальнейших исследований выяснилось, что избыток генетического материала кодирует белки, вовлеченные в процессы, связанные с вторичными метаболитами. По этой причине, в настоящее время пристальное внимание уделяется этой группе веществ.

Помимо актиномицетов, второй группой организмов, являющихся традиционно источником новых антибактериальных препаратов, являются грибы. Около 42% всех антибиотиков имеют грибковое происхождение [8]. По этой причине, данная группа организмов также является объектом пристального внимания со стороны исследователей, занимающихся поиском новых антибиотиков.

Для изучения вторичных метаболитов упомянутых двух групп микроорганизмов, в большинстве случаев используют следующий подход – анализируют геном микроорганизма на предмет наличия генов с неизвестной функцией. Вырезают искомый ген рестриктазами и получают нокаутный по данному гену микроорганизм. Культивируют нокаутный штамм параллельно с обычным штаммом микроорганизма. После этого анализируют культуральную жидкость хроматографическими методами с чувствительным детектором и выявляют наличие дополнительных пиков на хроматограммекультуральной жидкости, полученной при культивировании микроорганизма обычного штамма. Эти дополнительные пики соответствуют тем веществам, биосинтез которых был заблокирован у нокаутных штаммов по причине удаления гена. Затем генно-инженерным способом получают вещества и описывают их свойства. Более подробно методы описаны в работах [8], [16].

Заключение

В заключении стоит отметить, что в настоящее время накоплено достаточно большое количество знаний об особенностях жизнедеятельности микроорганизмов, имеется большой выбор стратегий и методов поиска новых антибактериальных препаратов.

Тем не менее, к сожалению, подавляющее большинство публикаций, посвященных синтезу антимикробных препаратов, в российских журналах по медицинской и фармацевтической химии, описывают, как правило, химическую часть и общую противомикробную активность веществ, оставляя в тени механизмы, обеспечивающие антимикробную активность нового вещества. Однако, очевидно, что в научном поиске новых веществ с антибактериальной активностью необходимо использовать методы не только медицинской химии, но и молекулярной биологии, генетики и других биологических дисциплин, основные направления, применения которых мы описали. И поскольку крупные фармацевтические компании отказываются от разработок антибиотиков, на сегодняшний день большая надежда в области поиска новых антибиотиков сегодня возлагается на небольшие некоммерческие научные группы, которые имеют частичное государственное финансирование.

 

Рецензенты:

Игидов Н.М., д.фарм.н., профессор, профессор кафедры общей и органической химииГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России, г. Пермь;

МолоховаЕ.И., д.фарм.н., профессор, профессор кафедры промышленной технологии лекарств с курсом биотехнологииГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России, г. Пермь.