В последние время внимание исследователей обращено на изучение феномена гипоксии в опухоли [5, 15]. Показано, что гипоксия, возникающая в микроокружении опухолевых клеток, играет ключевую роль в регулировании метаболизма неоплазии и имеет большое клиническое и прогностическое значение [7, 4, 13]. Гипоксия индуцирует факторы, активирующие транскрипцию генов, которые вызывают ответ на гипоксическое воздействие [8, 6]. К факторам, индуцируемым гипоксией, прежде всего относятся наиболее изученные на сегодняшний момент факторы семейства HIF (hypoxia-inducible factors): HIF-1α, HIF-2α и HIF-3α [12]. Данные факторы переключают метаболизм опухолевых клеток с аэробного на анаэробный путь получения энергии, что придает клеткам значительно большие возможности к инвазии и метастазированию.
Нуклеофозмин/B23 — полифункциональный ядрышковый фосфопротеин с молекулярной массой 38 kD. Его функциями являются: участие в промежуточных и поздних стадиях сборки прерибосом, транспорт белковых компонентов рибосом из ядра в цитоплазму, контроль дублирования центросом [10]. Имеются данные, что синтез данного белка может активироваться гипоксией. Экспериментальными исследованиями показано, что при недостатке кислорода в ядрышках клеток культур злокачественных клеток отмечается гиперэкспрессия нуклеофозмина/B23 [9]. Гиперэкспрессия нуклеофозмина/B23 имеет прогностическое значение при ряде локализаций рака [2, 11, 14]. Исследования морфофункциональной активности нуклеолярного аппарата и экспрессии нуклеофозмина/B23 в условиях гипоксии при раке почки в литературе отсутствуют.
Целью исследования настоящей работы явилось изучение экспрессии белка нуклеофозмина/B23 и морфофункциональной активности нуклеолярного аппарата в клетках почечно-клеточного рака в зависимости от воздействия фактора гипоксии.
Материалы и методы исследования
Материалом для исследования послужили 109 почек, резецированных по поводу рака в Алтайском филиале РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, г. Барнаул. Средний возраст больных составил 58,0±0,8 лет. Мужчин было 53 (48,6%), женщин – 56 (51,4%). При изготовлении гистологических препаратов применялся метод тканевых матриц. В каждом случае из парафиновых блоков (блоков-доноров) после предварительного просмотра гистологического препарата иглой-панчером с внутренним диаметром 2,0 мм забирали столбики ткани. Далее столбики ткани (10–15 шт.) помещали в парафиновые блоки-реципиенты размером 20х20 мм. С парафиновых блоков-реципиентов при помощи роторного микротома изготовляли серийные гистологические срезы толщиной 4 мкм и переносили на стекла (с двух парафиновых блоков на одно стекло).
Изучение ядрышек опухолевых клеток осуществляли гистохимическим и иммуногистохимическим методами. Гистохимическое окрашивание ядрышек проводили по методу Daskal Y., et al., 1980, в нашей модификации [1]. Докраску ядер осуществляли 1%-ным раствором метилового зеленого. Ядрышки классифицировали в соответствии с морфофункциональной классификацией ядрышек П.В. Челидзе и О.В. Зацепиной (1988) [3]. Высчитывали следующие параметры нуклеолярного аппарата: среднее количество ядрышек на 1 ядро; среднюю площадь ядрышкообразующих зон (ЯОЗ) на 1 ядро; среднее количество фибриллярных центров (ФЦ) на 1 ядро; среднее содержание кольцевидных (КЯд), переходных (ПЯд) и нуклеолонемных (НЯд) типов ядрышек на 1 ядро.
Иммуногистохимическое выявление ядрышкового белка нуклеофозмина (B23) проводили с применением моноклональных антител – nucleophosmin n/B23, клон mouse mAb23 (фирма «Labvision»). Оценивали интегральную оптическую плотность (ИОП) нуклеофозмина/B23 в ядрышке с использованием системы компьютерного анализа изображения, состоящей из микроскопа Leica DМЕ, цифровой камеры Leica EC3 (Leica Microsystems AG, Германия), персонального компьютера и программного обеспечения ВидеоТест-Морфология 5.2. Значения ИОП нуклеофозмина/B23 выражали в условных единицах (у.е.).
В целях исследования плотности микроциркуляторного русла (ПМЦР) в опухоли проводили иммуногистохимическое окрашивание эндотелия сосудов на CD34 (клон QBEnd/10, фирма Ventana). Препараты фотографировали цифровым фотоаппаратом в 5 полях зрения при увеличении х400 и сохраняли фотоснимок в формате JPG. Затем проводили обработку снимков в программе Adobe Photoshop 6.0. и осуществляли подсчет среднего числа сосудов в 5 полях зрения в программе Image Tool 3.0. с помощью инструмента Count and Tag.
Статистический анализ проводили с использованием программы Statistica 6.0. При сопоставлении средних величин использовали критерий значимости Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05. Коррелятивные взаимоотношения оценивали с помощью критерия Пирсона.
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты проведенного исследования показали, что ПМЦР при ПКР в среднем составила 30,9±2,2 в 5 полях зрения, пределы колебаний числа сосудов составили от 3,6 до 104, медиана составила 28 сосудов. Поскольку медиана количества сосудов была равна 28 сосудам, то это значение было выбрано нами за критическую точку васкуляризации опухоли, позволяющую разделить больных на 2 группы. 1-ю группу составили больные с хорошо васкуляризированными опухолями, содержащими более 28 сосудов, 2-ю группу составили больные с плохо васкуляризированными опухолями, имеющими менее 28 сосудов, т.е. находящимися в состоянии гипоксии.
При исследовании нуклеофозмина/B23 экспрессия белка была четко видна во всех опухолевых клетках, при этом выявлялась только ядрышковая локализация в виде окрашивания нуклеолы в цвета от светло-желтого до бурого. В целом в клетках ПКР ИОП белка нуклеофозмина/B23 составила 1551,1±51,35 у.е. на 1 ядро, пределы колебаний ИОП составили от 118,9 до 15779,1 у.е., медиана составила 890 у.е. В группе больных с хорошо васкуляризированными карциномами ИОП белка составила 963,7±66,3 у.е., а в группе пациентов с плохо васкуляризированными опухолями ИОП достоверно возрастала до 2036,0±79,15 у.е. (p = 0,0000001) (рис. 1, 2; табл.). ИОП нуклеофозмина/B23 коррелировала с ПМЦР опухоли (r = 0,46; p = 0,0001); c наличием некроза в опухоли (r = 0,43; p = 0,0001); c размером опухоли (r = 0,45; p = 0,0001) и наличием метастазов (r = 0,40; p = 0,0001).
Рис. 1. Опухоль с высокой ПМЦР и низкой ИОП нуклеофозмина/B23 на 1 ядро: а – иммуногистохимическая реакция на CD34, увеличение х 400; б — иммуногистохимическая реакция на нуклеофозмин/B23, увеличение х 1000
Рис. 2. Опухоль с низкой ПМЦР и высокой ИОП нуклеофозмина/B23 на 1 ядро: а – иммуногистохимическая реакция на CD34, увеличение х 400; б — иммуногистохимическая реакция на нуклеофозмин/B23, увеличение х 1000
При исследовании нуклеолярного аппарата обнаружено, что количество ядрышек в опухолях с высокой ПМЦР составило 1,6±0,05 на 1 ядро, а в карциномах с низкой ПМЦР оно достоверно возрастало до 1,8±0,04 (p = 0,0009). Средняя площадь ЯОЗ на 1 ядро в опухолях с высокой ПМЦР равнялась 1,7±0,06 мкм2, а с низкой – 2,9±0,08 мкм2 (p = 0,0000001). Содержание КЯд, ПЯд и НЯд в ядрах клеток опухолей с высокой ПМЦР составило 27,3%, 52,7%, 19,9%, а в карциномах с низкой ПМЦР 21,7%, 40,2% и 38,6% соответственно. В новообразованиях с низкой ПМЦР значимо возрастало количество ФЦ на 1 ядро до 10,9±0,4 по сравнению с карциномами с высокой ПМЦР (5,0±0,2) (p = 0,0000001) (табл.).
Параметры нуклеолярного аппарата опухолевых клеток ПКР в зависимости от ПМЦР опухоли
|
Параметры нуклеолярной активности |
ПМЦР |
|
|
< 28 сосудов |
> 28 сосудов |
|
|
ИОП нуклеофозмина/B23 (у.е.) |
2036,0±79,15* |
963,7±66,3* |
|
Число ядрышек на 1 ядро |
1,8±0,04* |
1,6±0,05* |
|
Площадь ЯОЗ (мкм2) |
2,9±0,08* |
1,7±0,06* |
|
Число ФЦ на 1 ядро |
5,0±0,2* |
10,9±0,4* |
|
Число КЯд на 1 ядро (%) |
21,7 |
27,3 |
|
Число ПЯд на 1 ядро (%) |
40,2 |
52,7 |
|
Число НЯД на 1 ядро (%) |
38,6 |
19,9 |
Примечание: * p < 0,05.
Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что в плохо васкуляризированных карциномах по сравнению с хорошо васкуляризированными отмечено возрастание экспрессии ядрышкового белка нуклеофозмина/B23. Данный феномен оказывал влияние на морфофункциональные характеристики нуклеолярного аппарата опухолевых клеток ПКР. Так, в клетках опухоли возрастали количество ядрышек и площадь ядрышкообразующих зон на 1 ядро. Также гиперэкспрессия нуклеофозмина/B23 в ядрах клеток сопровождалась изменением распределения морфофункциональных типов нуклеол: в опухолях с высокой плотностью микроциркуляторного русла уменьшалось число кольцевидных и переходных вариантов ядрышек и возрастало содержание нуклеолонемных типов ядрышек. Данные перестройки нуклеолярного аппарата в конечном итоге проводили к значительному увеличению количества фибриллярных центров в ядрышках опухолевых клеток опухолей с низкой плотностью микроциркуляторного русла.
Как показано современными исследованиями, гипоксия оказывает значительное влияние на прогрессию, метастазирование опухоли и имеет прогностическое значение. Данным исследованием показано, что одним из патогенетических механизмов воздействия фактора низкой оксигенации на прогрессию опухоли является активация экспрессии ядрышкового белка нуклеофозмина/B23, который приводит к увеличению темпов роста опухолевых клеток за счет возрастания рибосомального синтеза. Понимание механизмов активации и регуляции экспрессии нуклеофозмина/B23 важно еще и в связи с тем, что в настоящее время активно разрабатываются таргетные препараты, ингибирующие данный белок, которые позволят улучшить качество и продлить жизнь онкологических больных.
Рецензенты:
Лепилов В.В., д.м.н. профессор, заведующий кафедрой патологической анатомии с секционным курсом ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Минздрава РФ, г. Барнаул;
Бородина Г.Н., д.м.н., зав. кафедрой анатомии ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Минздрава РФ, г. Барнаул.