Целью работы явилось исследование особенностей получения и применения аутологичных стволовых клеток у больных с критической ишемией нижних конечностей.
Материал и методы исследования. Под наблюдением находились 58 пациентов, разделенных на две группы. В первой группе (26 человек) в составе комплексной терапии применяли внутримышечное введение аутологичных стволовых клеток. Средний возраст больных I группы составил 60,9±7,7 лет. По клиническим проявлениям ишемии нижних конечностей (классификация А.В.Покровского - Фонтейна) пациенты распределились следующим образом: IIa ст. - 8 пациентов (25%); IIб ст. - 12 пациентов (45%); III ст. - 4 пациента (20%); IV ст. - 2 пациента (10%). Во второй (контрольной) группе (n=32) мужчин было 24 человека, женщин - 8. Средний возраст составил 59,5±5,1 лет. Критерии включения в исследование: возраст старше 18 лет; клинические проявления ишемии конечности не менее 1 месяца IIa-IV стадии по А.В. Покровскому-Фонтейну; проходимость проксимального артериального русла; наличие неоперабельного (для выполнения открытой или чрескожной реваскуляризации) дистального поражения артерий нижних конечностей или анатомо-функциональной недостаточности коллатеральных путей кровотока. Противопоказания к включению в исследование: острый коронарный синдром или острое нарушение мозгового кровообращения в предшествующий месяц; стенокардия IV функционального класса (по NYHA), наличие инфекционных осложнений; наличие онкологических заболеваний, в т.ч. в анамнезе; тяжелая почечная и печеночная недостаточность; дыхательная недостаточность III ст; нефротический синдром; наличие алкогольной или наркотической зависимости; ВИЧ-инфекция. Процедура мобилизации СКПК у пациентов проводилась в соответствии с стандартным монорежимом с использованием филграстима (Г-КСФ). Выбранная доза филграстима - 10 мкг на килограмм массы тела больного вводилась подкожно в течение 3-х последовательных дней. Процедура лейкоцитафереза производилась на 4-й день от начала введения филграстима на аппарате Haemonetics MCS+ с использованием протокола PBSC (стволовые клетки периферической крови) через венозный доступ (кубитальная вена). Объем удаляемой плазмы был- 30 мл. В качестве антикоагулянта использовался ACD-A, соотношение антикоагулянта к объему крови - 1:9. Конечный объем продукта, содержащего СКПК и удовлетворяющий целям исследования, был 50-60 мл. Анализ гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) в периферической крови, в лейкоцитаферезном концентрате выполнялся с помощью проточной цитофлуориметрии. Исследование проводилось на проточном лазерном цитофлуориметре «Cytomics FC 500» («Beckman Coulter»,США) с использованием набора реагентов «Stem-KIT Reagents» («Beckman Coulter»,США). Анализ учета CD34+ клеток проводится в модифицированном протоколе ISHAGE. Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием методов описательной статистики.
Результаты исследования и их обсуждение. Было проведено 26 операций афереза СКПК у 26 пациентов. Все операции проводились при условии достижения лейкоцитоза в периферической крови пациента не менее 10 х 109/л. Обязательным было во всех случаях проведение профилактики тромбоэмболических осложнений с учетом нарастания лейкоцитоза в периферической крови (на 3 сутки стимуляции содержание лейкоцитов в периферической крови 37,6±5,9 х109/л). Профилактика развития тромбоэмболических осложнений проводилась с помощью низкомолекулярного гепарина (фраксипарин 0,6 мл или клексан 0,4 мл 1 раз в сутки подкожно). Всем пациентам в предоперационном периоде, как и пациентам группы контроля, проводилась комплексная терапия включающая метаболические средства (актовегин 1 г, цитофлавин 10 мл), антиагрегантные препараты (клексан/ фраксипарин 0,3-0,6 мг, тромбоАСС 0,1 или кардиомагнил 0,15). Показатели проведенных операций афереза приведены в таблице 1.
Таблица 1
Показатели афереза СКПК у пациентов с облитерирующими заболеваниями артерий
Длительность афереза, мин |
Объем сепарированной крови, мл |
Объем концентрата СКПК, мл |
72,7± 9,6 |
1715,7±198,5 |
48,4±16,1 |
Установлено, что средняя длительность афереза СКПК составляла 72,7 мин, за этот период времени было переработано 1715,7 мл крови для сепарации стволовых клеток. При этом нежелательные явления в виде усиление болевого синдрома в пораженной конечности наблюдались у 2 пациентов.
Исследование CD34+ клеток в периферической крови больных проводили до начала стимуляции Г-КСФ, в 1-й, 2-й, 3-й день стимуляции филграстимом и в продукте лейкоцитарного афереза (табл. 2).
Таблица 2
Содержание CD34+ клеток в периферической крови в ходе стимуляции, афереза и в концентрате СКПК у пациентов с облитерирующими заболеваниями артерий
Группы пациентов |
Содержание CD34+ клеток, % |
Абсолютное содержание CD34+ клеток х109/л |
Содержание лейкоцитов, х109/л |
Жизнеспособность клеток , % |
I группа пациентов |
|
|
|
|
до стимуляции Г-КСФ в периферической крови (исходные значения) |
0,026 ± 0,004 |
0,0020 ± 0,0003
|
7,99 ± 0,58
|
98,1 ± 0,3
|
после стимуляции Г-КСФ в периферической крови |
0,079± 0,012 *, ** |
0,044± 0,010 *, ** |
46,47 ± 6,45 *, ** |
98,3 ± 0,4
|
в продукте лейкоцитарного афереза |
0,280 ± 0,044
|
0,779 ± 0,167
|
236,19±28,52
|
97,7 ± 0,9 |
II группа пациентов |
0,032 ± 0,003 |
0,0040 ± 0,0010 |
9,07± ,57 |
97,7±0,3 |
Примечание: * - различия достоверны по отношению к показателям контрольной группы; ** - различия достоверны по отношению к исходным значениям.
Установлено, что относительное и абсолютное содержание CD34+клеток в периферической крови больных I группы до стимуляции Г-КСФ не различалось с показателями в контрольной (II) группе, p>0,05. После стимуляции содержание CD34+ клеток в периферической крови возрастало в среднем в 2,6 раза, а абсолютное - в 22 раза (р<0,05). В продукте лейкоцитарного афереза отмечалось увеличение содержания СКПК по сравнению с показателями в периферической крови после стимуляции Г-КСФ. Так содержание CD34+ клеток в лейкоцитарном концентрате было в 3,5 раза больше, чем в периферической крови после стимуляции и более чем в 10 раз превышало показатели в периферической крови до стимуляции Г-КСФ. Жизнеспособность CD34+клеток во всех наблюдениях была выше 95%.
Хранение и маркировку концентрата СКПК осуществляли в соответствии с действующими нормативными документами как компонента аутологичной крови [4, 5]. Среднее время хранения концентрата СКПК от момента окончания афереза до введения пациенту составила 35,3±21,3 мин. Введение трансплантата (концентрат СКПК) проведено внутримышечно из 30 точек по 1 мл, под контролем ультразвукового исследования (УЗИ) (аппарат «Aloka 1700», программа МS, линейный датчик 7,5 МГц). Средняя доза введения СКПК пациенту составила 2,337 х107/л CD34+ клеток. Расстояние между пункциями и их глубина определялось под контролем УЗИ, что позволило контролировать введение СКПК строго субфасциально, определять глубину введения (от 10 мм до 15 мм) и распределение СКПК в мышечной ткани (феномен расслоения перистой структуры мышц), добиться равномерного распределения трансплантата по объему мышц без образования полостей накопления (псевдогематом), локализовать малую подкожную вену, мышечные артериальные ветви и избежать пункции сосудов.
Введение СКПК во всех случаях прошло без осложнений. В 2 случаях в ходе введения развился спастический синдром мышц обеих голеней, носивший характер диффузных фибрилляций. Данное состояние было расценено нами как проявление субкомпенсированной гипокальциемии в раннем постаферезном периоде, было эффективно купировано внутривенным введением 10% раствора хлорида кальция. Следует отметить, что у обоих пациентов перед аферезом уровень кальция в плазме находился в пределах нормальных значений. В ближайшем послеоперационном периоде клинически, а также по оценке лодыжечно-плечевого индекса и дистанции безболевой ходьбы, степень артериальной недостаточности не нарастала, трофические изменения мягких тканей стопы не увеличивались; ампутации не проводились.
Во всех случаях введение СКПК сопровождалось умеренным болевым синдромом в местах пункций в первые сутки послеоперационного периода без ухудшения трофики мягких тканей. Ультразвуковое исследование (лодыжечно-плечевой индекс и пальцевые артерии стопы) не выявило отрицательной динамики состояния кровообращения. Клинически в раннем посттрансплантационном периоде (1 месяц) отмечены признаки положительной динамики критической ишемии: стихание болей в покое, купирования ригидности икроножных мышц, улучшение трофики стопы.
В сроки наблюдения до 2 лет 6 месяцев изучена эффективность применения пересадки полученных аферезом аутологичных стволовых клеток, достигнуто клиническое улучшение у 89,7% больных, не проводилось больших ампутаций и сохранена трудоспособность у работающей группы пациентов.
Выводы:
- Процедура лейкоцитафереза на 4-й день от начала введения филграстима (10 мкг на килограмм массы тела) на аппарате Haemonetics MCS+ с использованием протокола PBSC (стволовые клетки периферической крови) позволяет у пациентов с ишемией нижних конечностей получать концентрат СКПК с содержанием CD34+ клеток 0,779±0,167х109/л, витальностью 97,7 ± 0,9%.
- Применение ультразвукового исследования повышает безопасность и эффективность введения СКПК в мышцы голени у пациентов с ишемией нижних конечностей.
- Осложнений, связанных с лейкоцитаферезом и применением аутологичных стволовых клеток у пациентов, отобранных для клеточной терапии согласно предложенным критериям, не наблюдалось.
Рецензенты:
Бойченко Э.Г., д.м.н., зав.отделением онкологии, гематологии и химиотерапии, СПб ГБУЗ «Детская больница №1», г. Санкт-Петербург;
Скрябин О.Н., д.м.н., профессор, заместитель главного хирурга Комитета по здравоохранению Петербурга, СПб ГБУЗ «Клиническая больница Святителя Луки», г. Санкт-Петербург.