Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Согласно государственной программе развития здравоохранения Российской Федерации (2014), в настоящее время большая роль уделяется развитию и внедрению инновационных методов лечения с  основами персонализированной медицины. Несмотря на это, в современной системе подготовки врачей вопросам медицинской генетики уделяется все меньшее внимание. Это затрудняет внедрение современных достижений персонализированной медицины в практическое здравоохранение. Так, в Красноярском крае в течение последних лет в клиническую практику внедрен персонализированный подбор противоэпилептических препаратов (ПЭП) с учетом индивидуальных фармакогенетических особенностей [3]. Однако, по данным анкетирования, о важности параклинических методов диагностики эпилепсии и эпилептических синдромов неврологи Красноярского края поставили фармакогенетическое исследование ПЭП на промежуточное положение (таблица 1) [2]. Поэтому мы хотим еще раз привлечь внимание практикующих врачей к фармакогенетике препаратов вальпроевой кислоты, что представляется особенно важным при ведении  женщин репродуктивного возраста, страдающих с эпилепсией.

Таблица 1

Необходимость проведения дополнительных методов исследования пациентам, страдающим эпилепсией и эпилептическими синдромами [2]

Основная цель лечения эпилепсии - достижение полного контроля над приступами при отсутствии клинически значимых побочных эффектов [7]. Вопросы безопасности противоэпилептической терапии играют особенно важную роль в связи с длительностью лечения и необходимостью регулярного приема противоэпилептических препаратов (ПЭП): ежедневно, обычно несколько раз в день. Показатели безопасности терапии значительно варьируют у разных ПЭП [14]. Негативные последствия терапии, связанные с нежелательными лекарственными явлениями (НЛЯ) могут перевешивать любой положительный эффект терапии, связанный с редукцией приступов [1, 4]. Профилактика НЛЯ является одной из основных целей в оптимизации противоэпилептической терапии [11].

Существует несколько подходов к классификации НЛЯ. Одна из классификаций предусматривает выделение двух типов НЛЯ: тип А (фармакологические реакции), тип В (идиосинкразия). НЛЯ типа А встречаются значительно чаще; на их долю приходится около 80 % всех случаев НЛЯ [6]. Они развиваются или вследствие усиления первичного фармакологического эффекта препарата (например, брадикардия и нарушение атриовентрикулярной проводимости при применении карбамазепина), или вследствие вторичных фармакологических эффектов, которые не являются целью лечения, однако легко прогнозируются и вытекают из особенностей фармакодинамики/фармакокинетики лекарства (например, ожирение при лечении вальпроатами). Эти НЛЯ дозозависимы и поэтому уменьшаются или исчезают при снижении дозы препарата или его отмене. К НЛЯ типа В относятся непредвиденные НЛЯ, развитие которых невозможно предсказать исходя только из особенностей фармакокинетики/фармакодинамики лекарственного вещества. Считается, что многие НЛЯ типа В генетически детерминированы (фармакогенетика). Кроме того, в реакции идиосинкразии вовлекается иммунная система [8, 11]. Полиморфизм генов изоферментов, ответственных за метаболизм ПЭП, объясняет некоторые особенности индивидуального ответа на противоэпилептическую терапию [5, 9].

Недооценка фармакогенетических особенностей метаболизма ПЭП практикующими врачами неврологами, приводит к тому, что в ряде случаев увеличение частоты эпилептических приступов на стадии титрования дозы препаратов ВК расценивается не как проявление НЛЯ со стороны центральной нервной системы (токсичности ВК), а (по инструкции к ПЭП) как недостаточная (низкая) дозировка лекарственного средства. Пациентам необдуманно наращивается суточная доза препаратов ВК, что в свою очередь, приводит к резкому ухудшению их состояния и ошибочному отнесению данной формы эпилепсии к разряду фармакорезистентной, а также к оценке применяемых ПЭП группы ВК как "неэффективных", что в большинстве наблюдаемых нами клинических случаев не соответствовало действительности [4, 12].

В течение последних лет в мировой практике для прогнозирования развития НЛЯ на фоне приема ПЭП рекомендуется оценивать скорость их метаболизма в организме человека (фармакокинетика ПЭП), а также фармакогенетические маркеры чувствительности к ПЭП различных фармакологических групп, например: препаратам вальпроевой кислоты (полиморфизм генов CYP2C9, CYP2A6, CYP2B6, CYP1A1, CYP2D6, CYP2E1), препаратам карбамазепина (полиморфизм генов CYP3A4, CYP3A5), препаратам ламотриджина (полиморфизм гена глутатион S-трансферазы m-GSTM1, гена глутатион-S-трансферазы - tGSTT1, гена глутатион-S-трансферазы n (1), гена глутатион-S-трансферазы n (2), гена натриевого канала SCN1VS5N, гена уридинфосфат-глюкуронозилтрансферазы - UGT1A4) и др. [13]. Важная роль в прогнозировании ответа на ПЭП отводится гетеро- и гомозиготному носительству мутантного полиморфного аллельного варианта гена транспортера лекарственных препаратов MDR1 (C3435T) [10]. Исследования зависимости метаболизма вальпроевой кислоты (ВК) и нежелательных лекарственных явлений от генотипа CYP2C9 немногочисленны, включают небольшое количество наблюдений.

Цель исследования: изучить ассоциацию полиморфных аллельных вариантов гена CYP2C9 изофермента 2С9 цитохрома Р450 печени с развитием нежелательных лекарственных явлений на фоне приема вальпроатов у женщин фертильного возраста.

Материалы и методы. В исследование включены 352 пациентки, фертильного возраста, страдающие эпилепсией. Работа выполнена в рамках комплексных исследований по теме «Эпидемиологические, генетические и нейрофизиологические аспекты заболеваний нервной системы (центральной, периферической и вегетативной) и превентивная медицина» (номер госрегистрации 0120.0807480) на базе неврологического центра эпилептологии, нейрогенетики и исследования мозга Университетской клиники (Красноярск). Исследование одобрено на заседании Локального этического комитета КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России. Включение пациенток в исследование осуществлялось после подписания добровольного информированного согласия.

Методы исследования: ретроспективный анализ жалоб и анамнеза (по амбулаторным картам); анализ суточных доз ПЭП; лабораторные методы исследования, включая биохимический скрининг, исследование концентрации противоэпилептических препаратов в плазме  крови, молекулярно-генетическое исследование полиморфных аллельных CYP2C9. исследование концентрации ВК в плазме крови проводилось методом хемилюминесцентного иммуноанализа в одной точке (через 2 часа после приема ПЭП), на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого (Красноярск), лаборатории «Инвитро» (Красноярск), лаборатории ФГБУ «НИИ медицинских проблем Севера» СО РАМН (г. Красноярск). Референсный коридор уровня ВК в крови составил 50-100 мкг/мл. Субтоксический уровень ВК определен в диапазоне от 90 до 100 мкг/мл, токсический уровень - свыше 100 мкг/мл.

Молекулярно-генетическое исследование проводилось методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием образцов олигонуклеотидных меченных флюорофором агентов (технология TaqMan, «Rotor-Gene 6000», Corbet Life Science, Австралия). Проведено исследование полиморфных аллельных вариантов гена CYP2C9 на хромосоме 10q24.1 - 24.3, кодирующего изофермент 2С9 цитохрома Р450 печени, включая: аллельный вариант "дикого" типа CYP2C9*1, не имеющий мутации в виде однонуклеотидной замены; полиморфный аллельный вариант CYP2C9*2 (R144C, c.430 С > Т - однонуклеотидная замена цитозина на тимин в положении 430); полиморфный аллельный вариант CYP2C9*3 (I359L, c.1075 А > С - однонуклеотидная замена аденина на цитозин в положении 1075). Молекулярно-генетическое исследование проводилось на базе Межкафедральной лаборатории медицинской генетики и Центральной научно-исследовательской лаборатории КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого (Красноярск), лаборатории Инвитро (Красноярск). Генотипы были определены в зависимости от наличия или отсутствия продукта амплификации с использованием двух ДНК-зондов (в 2 направлениях полиморфизма CYP2C9), каждый из которых содержал флуоресцентный знак и супрессоры флуоресценции. Наличие того или иного изучаемого полиморфизма (CYP2C9*2 или CYP2C9*3), определялось обнаружением флуоресценции в амплифицированной смеси. Отрицательный контроль был включен в каждом эксперименте, где матрица ДНК для ПЦР была заменена на дистиллированную воду. Всего выделено ДНК у 148 из 199 (74,4%) пациенток, принимающих препараты вальпроевой кислоты, и подписавших добровольное информированное согласие.

Описательная статистика для качественных учетных признаков представлена в виде абсолютных значений, процентных долей и ошибок долей. Данные для вариационных рядов с непараметрическим распределением описаны в виде медианы и 25 и 75 перцентилей - Ме [P25; P75]. Для выбора критерия оценки значимости различий проверяли соответствие формы распределения нормальному, используя критерий Шапиро-Уилкса. Общее межгрупповое различие оценивалось при помощи Н-критерия Крускала-Уоллиса. В случае обнаружения различия нескольких выборок проводили множественное сравнение с использованием непараметрических вариантов критериев: Даннета (для сравнения всех выборок с контрольной выборкой - без мутации гена) и Ньюмена-Кейлса (для попарного сравнения выборок). Для проверки гипотезы о равенстве долей использовали критерий χ2 с процедурой попарного сравнения (Мараскуило). Для оценки риска кумуляции вальпроевой кислоты в зависимости от генотипа CYP2C9 использовали коэффициент относительного риска. Для всех критериев критическое значение уровня значимости принималось p≤0,05. Статистическая обработка результатов проводилась с помощью пакетов прикладных программ STATISTICA v. 7.0, SPSS Statistics 17.0, XLSTAT.

Результаты и их обсуждение. Возраст пациенток варьировал от 16 до 47 лет; медиана возраста (Ме [Р25:Р75]) составила 27  [23:33] лет. В период диспансерного наблюдения у невролога-эпилептолога 199/331 (60,1±2,7%) человек получали препараты вальпроевой кислоты (ПВК).

Уровень ВК в плазме крови варьировал от 6 до 176 мкг/сут, медиана - 67 [51; 91] мкг/сут (референсный коридор 50-100 мкг/мл). В 37/137 (27,0±3,8%) случаях уровень ВК находился в субтоксическом, токсическом диапазоне (> 90 мкг/мл). Кумуляция ВК в крови выявлена статистически значимо чаще гетерозиготных  носительниц аллельного варианта CYP2C9*1/*2 (38,5%, p < 0,05), у компаунд-гетерозигот (100%, p < 0,05) и у гетерозиготных носительниц аллельного варианта CYP2C9*1/*3 (33,3%) по сравнению с гомозиготными носительницами распространенного аллельного варианта CYP2C9*1/*1 (p < 0,05) (таблица 2).

Таблица 2

Зависимость уровня вальпроевой кислоты в плазме крови от генотипов

гена CYP2C9 цитохрома Р450 печени

1p = 0,0445 между CYP2C9*1/*1 и CYP2C9*1/*2,

2p = 0,0482 между CYP2C9*1/*1 и CYP2C9*1/*3,

3, 5, 6p < 0,0001 между CYP2C9*2/*3 и CYP2C9*1/*1 (CYP2C9*1/*2, CYP2C9*1/*3),

4p = 0,7624 между CYP2C9*1/*2 и CYP2C9*1/*3 по критерию χ2 с процедурой Мараскуило

Однако наибольшая степень корреляции между генотипом и кумуляцией ВК выявлена у компаунд-гетерозигот (r = 0,9633) и гетерозиготных носительниц аллельного варианта CYP2C9*1/*3 (r = 0,933). Согласно анализу оценки риска, риск кумуляции был в 1,82, 2,1 и 5,46 раза выше при генотипах CYP2C9*1/*3, CYP2C9*1/*2 и CYP2C9*2/*3 соответственно, чем при генотипе CYP2C9*1/*1.

Таким образом, частота кумуляции ВК в крови у компаунд-гетерозигот была в 8 раз выше, при гетерозиготном носительстве аллеля CYP2C9*2 в 2,6 раза выше и при гетерозиготном носительстве CYP2C9*3 в 3 раза выше, чем при гомозиготном носительстве аллеля CYP2C9*1. В целом больший риск замедления метаболизма ВК в печени отмечен у гетерозиготных носительниц аллельного варианта CYP2C9*2, несмотря на меньшую частоту его встречаемости в исследуемой выборке по сравнению с CYP2C9*3 (13,5 % против 20,3 % соответственно, р < 0,01).

На фоне приема вальпроатов НЛЯ зарегистрированы у 131/199 (65,8 ± 3,4 %) женщины (р < 0,01). Со стороны ЦНС наблюдались НЛЯ у 48/131 (63,9 ± 4,2 %) пациенток, включая: снижение внимания - 2/131 (1,5 ± 1,1 %) случая, сложности усвоения нового материала - 9/131 (6,9 ± 2,2 %), головокружение - 1/131 (0,8 %), общую слабость - 2/131 (1,5 ± 1,1 %), сонливость в дневное время - 8/131 (6,1 ± 2,1 %), снижение настроения- 1/131 (0,8 %), головные боли - 2/131 (1,5 ± 1,1 %), тремор кистей - 19/131 (14,5 ± 3,1 %), усиление частоты приступов - 6/131(4,6 ± 1,8 %). Клинически явления гипераммониемической энцефалопатии на фоне токсического уровня ВК в плазме крови зарегистрированы в 10/131 (7,6 ± 2,3 %) случаях.

Со стороны ЖКТ регистрировались НЛЯ у 50/131 (38,2 ± 4,2 %) пациенток: изжога - 2/131 (1,5 ± 1,1 %) случая, тошнота - 8/131 (6,1 ± 2,1 %), чувство горечи во рту - 1/131 (0,8 %), боль в эпигастрии - 5/131 (3,8 ± 1,7 %), увеличение аппетита - 2/131 (1,5 ± 1,1 %), потеря аппетита - 1/131 (0,8 %), повышение аппетита в сочетании с повышением массы тела, без ожирения - 32/131 (24,4 ± 3,8 %), запор - 1/131 (0,8 %). Нарушение функции печени, по данным лабораторных методов исследования, зарегистрировано в 7/131 (5,3 ± 1,9 %) случаях, нарушение функции поджелудочной железы - 1/131 (0,8 %).

Со стороны эндокринной системы НЛЯ регистрировались у 51/131 (38,9 ± 4,3 %) пациентки: алиментарное ожирение - 10/131 (7,6 ± 2,3 %), нарушение менструального цикла - 37/131 (28,2 ± 3,9 %), положительная реакция мочи на кетоны - 1/131 (0,8 %), гипераммониемия - 3/131 (2,3 ± 1,3 %).

Со стороны кожи и ее дериватов НЛЯ регистрировались у 59/131 (38,9 ± 4,3 %) пациенток: сыпь - 8/131 (6,1 ± 2,1 %) случаев, сухость кожных покровов - 2/131 (1,5 ± 1,1 %), их комбинация - 2/131 (1,5 ± 1,1 %), выпадение волос (алопеция) - 48/131 (36,6 ± 4,2 %), нарушение структуры ногтей и волос - 4/131 (3,0 ± 1,5 %).

Со стороны системы кроветворения НЛЯ регистрировались у 19/131 (38,9 ± 4,3 %) пациенток: повышенная кровоточивость - 14/131 (10,7 ± 2,7 %). Тромбоцитопения по данным развернутого анализа крови зарегистрирована у 6/131 (4,6 ± 1,8 %) пациенток.

Результаты анализа клинико-лабораторных проявлений НЛЯ со стороны различных органов и систем в зависимости от носительства различных полиморфных аллельных вариантов  гена изофермента 2С9 цитохрома Р450 печени (таблица 2). Среди пациенток с исследованным генотипом CYP2C9 НЛЯ зарегистрированы в 86/148 (58,1 %) случаях. Как показано в таблице 3, статистически значимо чаще серьезные НЛЯ со стороны ЦНС (75,0%), эндокринной системы (75,0%) и органов кроветворения (37,5 %) встречались у носительниц полиморфного аллельного варианта CYP2C9*1/*2 по сравнению с носительницами полиморфного аллельного варианта CYP2C9*1/*3 (p < 0,05) и распространенного («дикого») аллельного варианта CYP2C9*1/*1 (p < 0,05).

Таблица 3

Частота встречаемости нежелательных лекарственных явлений в зависимости от генотипа гена CYP2C9 цитохрома Р450 печени

1-       наличие статистически значимых различий с CYP2C9*1/*1 по χ2-критерию при p<0,05

2-       наличие статистически значимых различий с CYP2C9*1/*2 по χ2-критерию при p<0,05

3-       наличие статистически значимых различий с CYP2C9*1/*3 по χ2-критерию при p<0,05

Выводы. Случаи кумуляции ВК в крови были ассоциированы с гетерозиготным носительством аллельного варианта CYP2C9*2 (38,5 %) и компаунд-гетерозиготным носительством CYP2C9*2/CYP2C9*3 (100 %), в меньшей мере - у гетерозиготных носительниц аллельного варианта CYP2C9*3 (33,3 %). НЛЯ на фоне приема вальпроатов со стороны ЦНС (75,0 %), эндокринной системы (75,0 %) и органов кроветворения (37,5 %) регистрировались чаще у гетерозиготных носительниц аллельного варианта CYP2C9*2 по сравнению с носительницами аллельного варианта CYP2C9*3 (в 2,4 раза) и CYP2C9*1 (в 1,8 раза).

Поэтому при проведении молекулярно-генетического исследования в рамках фармакогенетического тестирования важно уточнять носительство «медленных» полиморфных аллельных вариантов гена CYP2C9 изофермента 2С9 цитохрома Р450 печени. Женщины - носительницы аллельного варианта CYP2C9*2, входящие в группу высокого риска кумуляции ВК и НЛЯ на среднетерапевтических дозах вальпроатов, должны находиться под пристальным диспансерным наблюдением невролога-эпилептолога, как на стадии титрации дозировок ПЭП при первичной диагностике эпилепсии, так и при хроническом приеме ПЭП группы вальпроатов, особенно в рамках предгравидарной подготовки и диспансерного наблюдения во время вынашивания беременности.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Краевого государственного автономного учреждения «Красноярский краевой фонд поддержки научной и научно-технической деятельности» (грант на выполнение инициативного проекта «Исследование механизмов развития генетически-детерминированных нежелательных лекарственных явлений при приеме противоэпилептических препаратов» в рамках Конкурса научно-технического творчества молодежи).

Киссин М.Я., д.м.н., профессор, руководитель Санкт-Петербургского городского эпилептологического центра, профессор кафедры психиатрии и наркологии Первого Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И.П. Павлова Минздрава России, г. Санкт-Петербург;

Можейко Е.Ю., д.м.н., доцент кафедры нервных болезней с курсом медицинской реабилитации ПО ГБОУ ВПО «КрасГМУ им. проф. В.В. Войно-Ясенецкого» Минздрава России, г. Красноярск.