Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

DYNAMICS OF PATHOLOGICAL MANIFESTATIONS IN PLASMA AND ERYTHROCYTES RATS MODELS OF THE SERIES HYPERTENSION AND DYSLIPIDEMIA

Skoryatina I.A. 1 Medvedev I.N. 1
1 Kursk Institute of social education (branch of the institute RSSU (Russian State Social University))
Objective: To assess the dynamics of pathological manifestations in plasma and platelets of rats in experimental sequential formation of arterial hypertension and dyslipidemia.The study included 68 male rats Wistar aged 2.5-3 months. Of these, 33 animals have made the control group. 35 rats after sequential formation of their hypertension, dyslipidemia, and then made the experimental group. Rats in the experimental group during the creation of both of them types of pathology were examined 5 times. In experimental and control rats used biochemical, hematological and statistical methods. The sequential formation of arterial hypertension and dyslipidemia in rats showed a gradual increase in lipid peroxidation in plasma, platelet count decrease, discocytes and increase in the number of units. With the development of the rat arterial hypertension and dyslipidemia found a gradual increase in lipid peroxidation in platelets and increase their aggregation. In control rats observed consistently normal level accounted for biochemical and haematological characteristics.
model of arterial hypertension
and dyslipidemia
platelets
aggregation
surface geometry
В настоящее время медицина уделяет большое внимание изучению ранних этапов развития различной патологии и начальных механизмов ее реализации [10]. Весьма большой интерес проявляется исследователями к функциональным и реологическим особенностям различных форменных элементов крови [4, 5], особенно к основе системы гемостаза - тромбоцитам - при различных заболеваниях, в том числе при весьма распространенных в настоящее время сердечно-сосудистых и обменных заболеваниях. Среди них во всем цивилизованном мире одну из лидирующих позиций занимает артериальная гипертония (АГ), приводящая к широкой инвалидизации населения и вносящая существенный вклад в показатели смертности у лиц трудоспособного возраста. В цивилизованных странах на фоне АГ нередко развивается дислипидемия, что весьма негативно сказывается на общем прогнозе. Было замечено, что при развернутой клинической картине АГ, особенно отягощенной обменными нарушениями, отмечаются высокая активность тромбоцитов [9] и ослабление сосудистого контроля над ними, что существенно активирует гемостаз, снижает эффективность микроциркуляции и интенсивность обмена веществ во всех тканях [6, 7]. Вместе с тем состояние гемостатических характеристик тромбоцитов на самых ранних этапах развития АГ в сочетании с дислипидемией изучено весьма недостаточно.

Большая трудность патофизиологии связана с тем, чтобы проследить наиболее ранние этапы возникновения гемостатических нарушений тромбоцитов на человеке ввиду частого выпадения из поля зрения клиницистов лиц с первыми признаками АГ и возникающей на ее фоне дислипидемии. Это диктует потребность проведения экспериментальных исследований на лабораторных животных с моделированием у них АГ, а затем дислипидемии. В этой связи поставлена цель: оценить динамику патологических проявлений в плазме и тромбоцитах крыс в условиях экспериментального последовательного формирования артериальной гипертонии и дислипидемии.

Методика исследования

В исследование включено 68 крыс-самцов линии Вистар в возрасте 2,5-3 месяцев, полученных от здоровых самок первым-вторым пометом. Из них 33 животных получали комбикорм производства «Лабораторкорм» (Россия) в полном объеме, не подверглись воздействиям и составили группу контроля. Они были обследованы двукратно: в исходе и в возрасте 4-4,5 месяцев, т.е. одновременно с окончанием наблюдения за экспериментальными крысами. Ввиду отсутствия статистически значимых различий между результатами обоих обследований полученные данные представлены одной цифрой - их средней арифметической. У 35 крыс была сформирована артериальная гипертония путем назначения им на 2 недели кардиовазонефопатогенной полусинтетической диеты, обогащенной холестерином, нагруженной солями двузамещенного фосфорнокислого водного натрия и дефицитной по калию и магнию на фоне ежедневного внутримышечного введения суспензии гидрокортизона ацетата 1,5 мг на 100 г массы тела животного при замене воды для питья на 1%-ный раствор поваренной соли и холодовым воздействием на животных в конце данного 2-недельного воздействия - 4ºС в течение 4 ч [1]. Спустя 3 суток после формирования АГ эти крысы помещались в тесные клетки по 1 особи на 30 суток и начинали получать высококалорийную диету, состоящую из комбикорма (47%), сладкого сгущенного молока (44%), растительного масла (8%) и растительного крахмала (1%), что обеспечило следующий состав их рациона: жиры 29,6%, протеины 14,8%, углеводы 55,6% [3].

Экспериментальные крысы обследовались пятикратно - в исходе, в конце формирования АГ, спустя 3 суток после моделирования АГ (в начале дополнительного формирования дислипидемии), через 15 суток дополнительного формирования дислипидемии и в конце ее экспериментального создания.

Измерения артериального давления (АД) у животных выполнялись неинвазивно на приборе MLU/4c501 методом наложения хвостовой манжеты (MedLab, Китай). Уровень перекисного окисления липидов (ПОЛ) в плазме животных выявляли по количеству содержащихся в ней тиобарбитуровая кислота (ТБК)-активных продуктов набором «Агат-Мед» и по содержанию ацилгидроперекисей (АГП) с учетом уровня антиокислительной активности (АОА) жидкой части крови [2]. В тромбоцитах определялись концентрации малонового диальдегида (МДА) и АГП, а также активность каталазы и супероксиддисмутазы (СОД) [2]. В тромбоцитах энзиматически был оценен уровень холестерола (ХС) набором «Виталдиагностикум» (Россия) и выяснена концентрация общих фосфолипидов (ОФЛ) по содержанию фосфора с расчетом соотношения ХС/ОФЛ.

Активность тромбоцитарного гемостаза оценивали по ряду параметров. Подсчитывали количество тромбоцитов в крови в камере Горяева. Агрегационная активность тромбоцитов исследовалась визуальным микрометодом с использованием в качестве индукторов АДФ (0,5×10-4 М), коллагена (разведение 1:2 основной суспензии), тромбина (0,125 ед/мл), ристомицина (0,8 мг/мл), адреналина (5,0×10-6 М) и перекиси водорода (7,3×10-3 М) со стандартизированным количеством тромбоцитов в исследуемой плазме 200×109 тр. [8].

Морфологию внутрисосудистой активности тромбоцитов определяли с использованием фазово-контрастного микроскопа [8]. Результаты обработаны t-критерием Стьюдента.

Результаты исследования

У экспериментальных крыс после формирования АГ отмечено стабильное повышение уровней систолического и диастолического АД. Это сохранялось у крыс и на фоне развития дислипидемии до конца наблюдения (табл.).

У крыс с АГ отмечено повышение в плазме количества АГП и ТБК-активных продуктов. При развитии у этих животных дислипидемии концентрации АГП и ТБК-продуктов в плазме дополнительно увеличивались, существенно превышая цифры контроля. Выявленное усиление ПОЛ при последовательном моделировании у крыс АГ и дислипидемии оказалось возможно вследствие постепенного ослабления у них АОА плазмы суммарно на 43,8% (табл.).

При формировании АГ в тромбоцитах крыс количество холестерина несколько повышалось, тогда как содержание в их мембранах ОФЛ оставалась на данном этапе пока стабильно при следующем повышении одного и снижении второго в ходе развития дислипидемии, приводя в конечном счете к увеличению градиента ХС/ОФЛ на 25,9%.

В ходе формирования АГ в тромбоцитах крыс активировалась ПОЛ за счет ослабления активности их антиоксидантной защиты. Данные изменения достоверно усиливались в ходе последующего развития дислипидемии, обеспечивая суммарный рост АГП и МДА в тромбоцитах на 36,8% и 54,3% соответственно. Выявленные изменения активности ПОЛ в тромбоцитах у модельных животных при формировании у них АГ и дислипидемии оказались возможны в результате суммарной депрессии их каталазы и супероксиддисмутазы на 27,2% и 13,0% соответственно (табл.).

При формировании АГ, а затем дислипидемии в крови у крыс количество тромбоцитов оставалось неизменным. Создание модели двойной патологии вызывало у наблюдаемых животных сокращение времени развития АТ со всеми индукторами (табл.). Так, к концу реализации модели время АТ в ответ на действие коллагена сократилось на 33,8%, АТ с АДФ на 41,6% с ристомицином на 36,8%, с Н2О2 на 35,4%, с тромбином на 32,1%, с адреналином на 24,6%.

Уже при развитии АГ у крыс достигнуто снижение количества дискоцитов в крови на 6,2%, что углубилось на фоне дальнейшего формирования дислипидемии на 7,4%. Это сочеталось за весь срок наблюдения с постепенным повышением суммы активированных тромбоцитов на 75,7% за счет плавного нарастания всех их разновидностей (диско-эхиноцитов, сфероцитов, сферо-эхиноцитов и биполярных форм). Число свободно циркулирующих в крови малых, а также средних и больших тромбоцитарных агрегатов в ходе моделирования двойной патологии постепенно нарастало в 2,8 раза и в 10,3 раза соответственно (табл.).

Обсуждение

В ходе последовательного развития у крыс АГ, а затем дислипидемии отмечено весьма свойственное для человека [10] ослабление антиоксидантного потенциала плазмы, что приводит к постепенному повышению в ней количества АГП и ТБК-активных соединений и ухудшению метаболизма в тканях. Кроме того, активация процессов ПОЛ в плазме неизбежно вызывала альтерацию поверхностных структур форменных элементов крови [6], в том числе наиболее гемостатически значимой их популяции - тромбоцитов, что весьма негативно сказывалось на их функциях.

Формирующиеся в эксперименте изменения в соотношении между фракциями липидов мембран тромбоцитов и активация в них ПОЛ у модельных крыс весьма рано нарушали рецепторные и пострецепторные механизмы их функционирования. Возникающий липидный дисбаланс в мембранах приводил также к отрицательной динамике в регуляции в тромбоцитах ионного и антиоксидантного статуса, которая обеспечивала негативные изменения их метаболизма и структурно-функциональных свойств в сосудах, что начинает проявляться уже в весьма ранние сроки при формировании АГ [10].

Увеличение у экспериментальных крыс чувствительности тромбоцитов к индукторам агрегации обеспечивалось через активацию ряда механизмов. Так, на поверхности их тромбоцитов постепенно повышалась плотность гликопротеидов Iа - IIа и VI, участвующих в адгезии кровяных пластинок, о чем можно было судить по интенсификации АТ в ответ на коллаген [10]. Усиление адгезии кровяных пластинок у экспериментальных крыс связано также с избыточной экспрессией рецепторов к фактору Виллебранда на их поверхности. Данный механизм усиления адгезивной активности тромбоцитов у этих крыс удалось зарегистрировать по интенсификации АТ с ристомицином, влияющим на тромбоциты, идентично субэндотелиальным структурам сосудов. Учитывая, что для наступления ристомициновой АТ необходим фактор Виллебранда, фиксирующийся одной стороной молекулы к ристомицину (как к коллагену), а второй - к кровяным пластинкам через их рецептор - Iв, у экспериментальных крыс можно было констатировать усиление образования «оси адгезии»: ристомицин (коллаген) - фактора Виллебранда -GPIв. При этом именно значительное повышение количества мест связывания фактора Виллебранда на мембранах кровяных пластинок у модельных крыс является важным механизмом наступления у них чрезмерной адгезивной способности тромбоцитов [9].

Нарастание чувствительности тромбоцитов к коллагену следует связывать с повышением на поверхности кровяных пластинок количества рецепторов к нему. Это неизбежно сопровождается активацией фосфолипазы С, стимуляцией синтеза диацилглицерола и протеинкиназы С с последующим выраженным фосфолирированием протеинов сократительной системы. В этих условиях инозитолтрифосфат все активнее стимулирует поступление Са2+ из депо кровяных пластинок, способствуя стремительному сокращению актомиозина [8].

Индуктор АДФ, относящийся к слабым индукторам агрегации тромбоцитов, все более активно в ходе реализации модели стимулировавший кровяные пластинки, имел возможность взаимодействовать с нарастающим количеством собственных рецепторов на их мембранах у экспериментальных крыс. Это вызывало на поверхности тромбоцитов постепенно усиливающуюся экспрессию фибриногеновых рецепторов с активацией фосфолипазы А2, обеспечивающей выщепление арахидоновой кислоты из мембранных фосфолипидов [7, 8].

Выявленное увеличение ВАТ у экспериментальных крыс косвенно указывало на повышение в их крови по мере последовательного формирования АГ и дислипидемии уровня индукторов агрегации (тромбина, АДФ, адреналина) при росте базальной чувствительности к ним тромбоцитов. В этих условиях у экспериментальных крыс в крови начинает развиваться достоверное снижение количества интактных дискоидной формы тромбоцитов, что подтверждает увеличение активности их рецепторов. Нарастание в их крови на фоне создания модели числа диско-эхиноцитов и других активных форм тромбоцитов совпадает с повышением агрегационной активности тромбоцитов и связано в первую очередь с усилением по мере развития патологии экспрессии на их мембране фибриногеновых рецепторов (GP IIв - IIIа).

Заключение

Создание у крыс сначала АГ, а затем дислипидемии постепенно ослабляет антиоксидантную защиту плазмы крови и тромбоцитов, усиливая в них ПОЛ. Развивающиеся нарушения у экспериментальных животных постепенно усиливают внутрисосудистую активность тромбоцитов и их агрегационную способность, делая их сравнимой с таковыми у лиц с АГ и дислипидемией. Созданная модель позволила выяснить выраженность нарушений в плазме и тромбоцитах при дебюте последовательного развития АГ и дислипидемии, что весьма характерно для значительной части населения промышленно развитых стран.

Динамика артериального давления, биохимических и гематологических показателей у экспериментальных крыс

Регистрируемые параметры

Экспериментальное формирование АГ, M±m, n=35

Экспериментальное формирование дислипидемии на фоне АГ, M±m, n=35

Контроль,

M±m, n=33

исходное состояние

окончание формирования

АГ

исходное состояние

промежуточный этап

Окончание формирования дислипидемии на фоне АГ

Систолическое АД, мм рт. ст.

110,4±0,23

152,6±0,41

р<0,01

152,0±0,39

р<0,01

149,9±0,51

р<0,01

152,4±0,51

р<0,01

110,5±0,33

Диастолическое АД, мм рт. ст.

74,2±0,32

94,8±0,33

р<0,01

95,1±0,28

р<0,01

94,6±0,39

р<0,01

95,2±0,42

р<0,01

73,6±0,40

ОХС, ммоль/л

2,18±0,007

2,20±0,009

 

2,21±0,01

2,50±0,010

р<0,01

2,82±0,011

р<0,01

2,19±0,008

ХС ЛПВН, ммоль/л

1,14±0,009

1,13±0,011

 

1,16±0,012

 

1,00±0,010

р<0,05

0,89±0,016

р<0,01

1,17±0,005

ХС ЛПНП, ммоль/л

0,56±0,008

0,58±0,007

0,57±0,005

 

0,88±0,009

р<0,01

1,12±0,011

р<0,01

0,55±0,002

ХС ЛПОНП, ммоль/л

0,48±0,006

0,49±0,009

0,48±0,005

0,62±0,008

р<0,01

0,81±0,006

р<0,01

0,47±0,005

ТГ, ммоль/л

1,06±0,009

1,08±0,009

 

1,07±0,004

1,38±0,009

р<0,01

1,79±0,010

р<0,01

1,05±0,004

ОЛ, ммоль/л

3,02±0,012

3,05±0,008

 

3,06±0,009

4,28±0,010

р<0,01

5,20±0,12

р<0,01

3,04±0,007

АГП в плазме, Д233/1мл

1,35±0,007

1,74±0,006

р<0,01

1,78±0,005

р<0,01

2,36±0,009

р<0,01

2,85±0,012

р<0,01

1,38±0,004

ТБК-активные продукты в плазме, мкмоль/л

2,15±0,009

2,91±0,007

р<0,01

2,94±0,008

р<0,01

 

3,41±0,016

р<0,01

 

4,20±0,014

р<0,01

2,12±0,008

Антиоксидантный потенциал плазмы, %

28,9±0,15

24,7±0,09

р<0,05

24,8±0,13

р<0,05

 

22,3±0,10

р<0,01

 

20,1±0,09

р<0,01

 

29,0±0,10

ХС тромбоцитов, мкмоль/109тр.

0,65±0,005

0,67±0,004

 

0,67±0,006

 

0,71±0,008

р<0,05

0,75±0,009

р<0,01

0,66±0,004

ОФЛ тромбоцитов,

мкмоль/109тр.

0,48±0,003

0,48±0,005

0,48±0,005

 

0,46±0,008

р<0,05

 

0,44±0,010

р<0,05

0,49±0,006

ХС/ОФЛ тромбоцитов

1,35±0,004

1,39±0,007

р<0,05

1,39±0,005

р<0,05

1,54±0,007

р<0,01

1,70±0,008

р<0,01

1,35±0,007

АГП тромбоцитов,

Д233/109тр.

1,82±0,007

2,02±0,008

р<0,05

2,03±0,009

р<0,05

2,32±0,005

р<0,01

2,49±0,009

р<0,01

1,83±0,006

МДА тромбоцитов,

нмоль/109тр.

0,70±0,008

0,83±0,009

р<0,01

0,82±0,009

р<0,01

0,95±0,013

р<0,01

 

1,08±0,015

р<0,01

0,69±0,007

Каталаза тромбоцитов, МЕ/109тр.

8910,0±10,03

8100,0±12,11

р<0,01

8050,0±15,24

р<0,05

7520,0±13,02

р<0,01

7002,0±17,22

р<0,01

8890,0±16,18

СОД тромбоцитов,

МЕ/ 109тр.

1650,0±5,28

1560,0±6,03

р<0,05

1570,0±6,36

р<0,05

1500,0±6,61

р<0,01

1460,0±6,92

р<0,01

1650,0±4,65

АТ с АДФ, с

45,6±0,06

40,5±0,06

р<0,05

40,8±0,08

р<0,05

36,5±0,09

р<0,01

32,2±0,07

р<0,01

45,0±0,10

 

АТ с коллагеном, с

36,8±0,10

33,0±0,12

р<0,05

33,1±0,09

р<0,05

30,1±0,14

р<0,01

27,5±0,12

р<0,01

36,5±0,09

 

АТ с тромбином, с

57,6±0,07

52,1±0,10

р<0,05

52,3±0,08

р<0,05

47,3±0,14

р<0,01

43,6±0,13

р<0,01

57,7±0,06

 

АТ с ристомицином, с

47,9±0,05

43,6±0,08

р<0,05

43,2±0,09

р<0,05

39,4±0,09

р<0,01

35,0±0,10

р<0,01

47,5±0,07

 

АТ с Н2О2, с

50,1±0,04

46,2±0,07

р<0,05

46,4±0,08

р<0,05

40,2±0,10

р<0,01

37,0±0,12

р<0,01

49,9±0,08

 

АТ с адреналином, с

99,2±0,12

91,2±0,14

р<0,05

91,4±0,10

р<0,05

85,6±0,13

р<0,01

79,6±0,15

р<0,01

98,8±0,05

 

Дискоциты, %

 

86,0±0,10

81,2±0,12

р<0,05

81,0±0,16

р<0,05

78,2±0,19

р<0,05

75,4±0,23

р<0,01

85,6±0,12

 

Сумма активных форм, %

14,0±0,08

18,8±0,09

р<0,05

19,0±0,12

р<0,05

21,8±0,15

р<0,01

24,6±0,13

р<0,01

14,4±0,12

 

Число малых агрегатов

3,0±0,08

5,6±0,09

р<0,01

5,7±0,05

р<0,01

6,9±0,06

р<0,01

8,5±0,09

р<0,01

3,1±0,09

 

Число средних и больших агрегатов

0,18±0,005

0,49±0,007

р<0,01

0,51±0,09

р<0,01

1,22±0,011

р<0,01

1,86±0,010

р<0,01

0,16±0,004

 

 

Условные обозначения: р - найденная достоверность различий показателей с группой контроля.

Рецензенты:

Громнацкий Н.И., д.м.н., профессор, профессор кафедры терапии №2 Курского государственного медицинского университета, г. Курск;

Жукова Л.А., д.м.н., профессор, зав. кафедрой эндокринологии и диабетологии Курского государственного медицинского университ