Большая трудность патофизиологии связана с тем, чтобы проследить наиболее ранние этапы возникновения гемостатических нарушений тромбоцитов на человеке ввиду частого выпадения из поля зрения клиницистов лиц с первыми признаками АГ и возникающей на ее фоне дислипидемии. Это диктует потребность проведения экспериментальных исследований на лабораторных животных с моделированием у них АГ, а затем дислипидемии. В этой связи поставлена цель: оценить динамику патологических проявлений в плазме и тромбоцитах крыс в условиях экспериментального последовательного формирования артериальной гипертонии и дислипидемии.
Методика исследования
В исследование включено 68 крыс-самцов линии Вистар в возрасте 2,5-3 месяцев, полученных от здоровых самок первым-вторым пометом. Из них 33 животных получали комбикорм производства «Лабораторкорм» (Россия) в полном объеме, не подверглись воздействиям и составили группу контроля. Они были обследованы двукратно: в исходе и в возрасте 4-4,5 месяцев, т.е. одновременно с окончанием наблюдения за экспериментальными крысами. Ввиду отсутствия статистически значимых различий между результатами обоих обследований полученные данные представлены одной цифрой - их средней арифметической. У 35 крыс была сформирована артериальная гипертония путем назначения им на 2 недели кардиовазонефопатогенной полусинтетической диеты, обогащенной холестерином, нагруженной солями двузамещенного фосфорнокислого водного натрия и дефицитной по калию и магнию на фоне ежедневного внутримышечного введения суспензии гидрокортизона ацетата 1,5 мг на 100 г массы тела животного при замене воды для питья на 1%-ный раствор поваренной соли и холодовым воздействием на животных в конце данного 2-недельного воздействия - 4ºС в течение 4 ч [1]. Спустя 3 суток после формирования АГ эти крысы помещались в тесные клетки по 1 особи на 30 суток и начинали получать высококалорийную диету, состоящую из комбикорма (47%), сладкого сгущенного молока (44%), растительного масла (8%) и растительного крахмала (1%), что обеспечило следующий состав их рациона: жиры 29,6%, протеины 14,8%, углеводы 55,6% [3].
Экспериментальные крысы обследовались пятикратно - в исходе, в конце формирования АГ, спустя 3 суток после моделирования АГ (в начале дополнительного формирования дислипидемии), через 15 суток дополнительного формирования дислипидемии и в конце ее экспериментального создания.
Измерения артериального давления (АД) у животных выполнялись неинвазивно на приборе MLU/4c501 методом наложения хвостовой манжеты (MedLab, Китай). Уровень перекисного окисления липидов (ПОЛ) в плазме животных выявляли по количеству содержащихся в ней тиобарбитуровая кислота (ТБК)-активных продуктов набором «Агат-Мед» и по содержанию ацилгидроперекисей (АГП) с учетом уровня антиокислительной активности (АОА) жидкой части крови [2]. В тромбоцитах определялись концентрации малонового диальдегида (МДА) и АГП, а также активность каталазы и супероксиддисмутазы (СОД) [2]. В тромбоцитах энзиматически был оценен уровень холестерола (ХС) набором «Виталдиагностикум» (Россия) и выяснена концентрация общих фосфолипидов (ОФЛ) по содержанию фосфора с расчетом соотношения ХС/ОФЛ.
Активность тромбоцитарного гемостаза оценивали по ряду параметров. Подсчитывали количество тромбоцитов в крови в камере Горяева. Агрегационная активность тромбоцитов исследовалась визуальным микрометодом с использованием в качестве индукторов АДФ (0,5×10-4 М), коллагена (разведение 1:2 основной суспензии), тромбина (0,125 ед/мл), ристомицина (0,8 мг/мл), адреналина (5,0×10-6 М) и перекиси водорода (7,3×10-3 М) со стандартизированным количеством тромбоцитов в исследуемой плазме 200×109 тр. [8].
Морфологию внутрисосудистой активности тромбоцитов определяли с использованием фазово-контрастного микроскопа [8]. Результаты обработаны t-критерием Стьюдента.
Результаты исследования
У экспериментальных крыс после формирования АГ отмечено стабильное повышение уровней систолического и диастолического АД. Это сохранялось у крыс и на фоне развития дислипидемии до конца наблюдения (табл.).
У крыс с АГ отмечено повышение в плазме количества АГП и ТБК-активных продуктов. При развитии у этих животных дислипидемии концентрации АГП и ТБК-продуктов в плазме дополнительно увеличивались, существенно превышая цифры контроля. Выявленное усиление ПОЛ при последовательном моделировании у крыс АГ и дислипидемии оказалось возможно вследствие постепенного ослабления у них АОА плазмы суммарно на 43,8% (табл.).
При формировании АГ в тромбоцитах крыс количество холестерина несколько повышалось, тогда как содержание в их мембранах ОФЛ оставалась на данном этапе пока стабильно при следующем повышении одного и снижении второго в ходе развития дислипидемии, приводя в конечном счете к увеличению градиента ХС/ОФЛ на 25,9%.
В ходе формирования АГ в тромбоцитах крыс активировалась ПОЛ за счет ослабления активности их антиоксидантной защиты. Данные изменения достоверно усиливались в ходе последующего развития дислипидемии, обеспечивая суммарный рост АГП и МДА в тромбоцитах на 36,8% и 54,3% соответственно. Выявленные изменения активности ПОЛ в тромбоцитах у модельных животных при формировании у них АГ и дислипидемии оказались возможны в результате суммарной депрессии их каталазы и супероксиддисмутазы на 27,2% и 13,0% соответственно (табл.).
При формировании АГ, а затем дислипидемии в крови у крыс количество тромбоцитов оставалось неизменным. Создание модели двойной патологии вызывало у наблюдаемых животных сокращение времени развития АТ со всеми индукторами (табл.). Так, к концу реализации модели время АТ в ответ на действие коллагена сократилось на 33,8%, АТ с АДФ на 41,6% с ристомицином на 36,8%, с Н2О2 на 35,4%, с тромбином на 32,1%, с адреналином на 24,6%.
Уже при развитии АГ у крыс достигнуто снижение количества дискоцитов в крови на 6,2%, что углубилось на фоне дальнейшего формирования дислипидемии на 7,4%. Это сочеталось за весь срок наблюдения с постепенным повышением суммы активированных тромбоцитов на 75,7% за счет плавного нарастания всех их разновидностей (диско-эхиноцитов, сфероцитов, сферо-эхиноцитов и биполярных форм). Число свободно циркулирующих в крови малых, а также средних и больших тромбоцитарных агрегатов в ходе моделирования двойной патологии постепенно нарастало в 2,8 раза и в 10,3 раза соответственно (табл.).
Обсуждение
В ходе последовательного развития у крыс АГ, а затем дислипидемии отмечено весьма свойственное для человека [10] ослабление антиоксидантного потенциала плазмы, что приводит к постепенному повышению в ней количества АГП и ТБК-активных соединений и ухудшению метаболизма в тканях. Кроме того, активация процессов ПОЛ в плазме неизбежно вызывала альтерацию поверхностных структур форменных элементов крови [6], в том числе наиболее гемостатически значимой их популяции - тромбоцитов, что весьма негативно сказывалось на их функциях.
Формирующиеся в эксперименте изменения в соотношении между фракциями липидов мембран тромбоцитов и активация в них ПОЛ у модельных крыс весьма рано нарушали рецепторные и пострецепторные механизмы их функционирования. Возникающий липидный дисбаланс в мембранах приводил также к отрицательной динамике в регуляции в тромбоцитах ионного и антиоксидантного статуса, которая обеспечивала негативные изменения их метаболизма и структурно-функциональных свойств в сосудах, что начинает проявляться уже в весьма ранние сроки при формировании АГ [10].
Увеличение у экспериментальных крыс чувствительности тромбоцитов к индукторам агрегации обеспечивалось через активацию ряда механизмов. Так, на поверхности их тромбоцитов постепенно повышалась плотность гликопротеидов Iа - IIа и VI, участвующих в адгезии кровяных пластинок, о чем можно было судить по интенсификации АТ в ответ на коллаген [10]. Усиление адгезии кровяных пластинок у экспериментальных крыс связано также с избыточной экспрессией рецепторов к фактору Виллебранда на их поверхности. Данный механизм усиления адгезивной активности тромбоцитов у этих крыс удалось зарегистрировать по интенсификации АТ с ристомицином, влияющим на тромбоциты, идентично субэндотелиальным структурам сосудов. Учитывая, что для наступления ристомициновой АТ необходим фактор Виллебранда, фиксирующийся одной стороной молекулы к ристомицину (как к коллагену), а второй - к кровяным пластинкам через их рецептор - Iв, у экспериментальных крыс можно было констатировать усиление образования «оси адгезии»: ристомицин (коллаген) - фактора Виллебранда -GPIв. При этом именно значительное повышение количества мест связывания фактора Виллебранда на мембранах кровяных пластинок у модельных крыс является важным механизмом наступления у них чрезмерной адгезивной способности тромбоцитов [9].
Нарастание чувствительности тромбоцитов к коллагену следует связывать с повышением на поверхности кровяных пластинок количества рецепторов к нему. Это неизбежно сопровождается активацией фосфолипазы С, стимуляцией синтеза диацилглицерола и протеинкиназы С с последующим выраженным фосфолирированием протеинов сократительной системы. В этих условиях инозитолтрифосфат все активнее стимулирует поступление Са2+ из депо кровяных пластинок, способствуя стремительному сокращению актомиозина [8].
Индуктор АДФ, относящийся к слабым индукторам агрегации тромбоцитов, все более активно в ходе реализации модели стимулировавший кровяные пластинки, имел возможность взаимодействовать с нарастающим количеством собственных рецепторов на их мембранах у экспериментальных крыс. Это вызывало на поверхности тромбоцитов постепенно усиливающуюся экспрессию фибриногеновых рецепторов с активацией фосфолипазы А2, обеспечивающей выщепление арахидоновой кислоты из мембранных фосфолипидов [7, 8].
Выявленное увеличение ВАТ у экспериментальных крыс косвенно указывало на повышение в их крови по мере последовательного формирования АГ и дислипидемии уровня индукторов агрегации (тромбина, АДФ, адреналина) при росте базальной чувствительности к ним тромбоцитов. В этих условиях у экспериментальных крыс в крови начинает развиваться достоверное снижение количества интактных дискоидной формы тромбоцитов, что подтверждает увеличение активности их рецепторов. Нарастание в их крови на фоне создания модели числа диско-эхиноцитов и других активных форм тромбоцитов совпадает с повышением агрегационной активности тромбоцитов и связано в первую очередь с усилением по мере развития патологии экспрессии на их мембране фибриногеновых рецепторов (GP IIв - IIIа).
Заключение
Создание у крыс сначала АГ, а затем дислипидемии постепенно ослабляет антиоксидантную защиту плазмы крови и тромбоцитов, усиливая в них ПОЛ. Развивающиеся нарушения у экспериментальных животных постепенно усиливают внутрисосудистую активность тромбоцитов и их агрегационную способность, делая их сравнимой с таковыми у лиц с АГ и дислипидемией. Созданная модель позволила выяснить выраженность нарушений в плазме и тромбоцитах при дебюте последовательного развития АГ и дислипидемии, что весьма характерно для значительной части населения промышленно развитых стран.
Динамика артериального давления, биохимических и гематологических показателей у экспериментальных крыс
|
Регистрируемые параметры |
Экспериментальное формирование АГ, M±m, n=35 |
Экспериментальное формирование дислипидемии на фоне АГ, M±m, n=35 |
Контроль, M±m, n=33 |
|||
|
исходное состояние |
окончание формирования АГ |
исходное состояние |
промежуточный этап |
Окончание формирования дислипидемии на фоне АГ |
||
|
Систолическое АД, мм рт. ст. |
110,4±0,23 |
152,6±0,41 р<0,01 |
152,0±0,39 р<0,01 |
149,9±0,51 р<0,01 |
152,4±0,51 р<0,01 |
110,5±0,33 |
|
Диастолическое АД, мм рт. ст. |
74,2±0,32 |
94,8±0,33 р<0,01 |
95,1±0,28 р<0,01 |
94,6±0,39 р<0,01 |
95,2±0,42 р<0,01 |
73,6±0,40 |
|
ОХС, ммоль/л |
2,18±0,007 |
2,20±0,009
|
2,21±0,01 |
2,50±0,010 р<0,01 |
2,82±0,011 р<0,01 |
2,19±0,008 |
|
ХС ЛПВН, ммоль/л |
1,14±0,009 |
1,13±0,011
|
1,16±0,012
|
1,00±0,010 р<0,05 |
0,89±0,016 р<0,01 |
1,17±0,005 |
|
ХС ЛПНП, ммоль/л |
0,56±0,008 |
0,58±0,007 |
0,57±0,005
|
0,88±0,009 р<0,01 |
1,12±0,011 р<0,01 |
0,55±0,002 |
|
ХС ЛПОНП, ммоль/л |
0,48±0,006 |
0,49±0,009 |
0,48±0,005 |
0,62±0,008 р<0,01 |
0,81±0,006 р<0,01 |
0,47±0,005 |
|
ТГ, ммоль/л |
1,06±0,009 |
1,08±0,009
|
1,07±0,004 |
1,38±0,009 р<0,01 |
1,79±0,010 р<0,01 |
1,05±0,004 |
|
ОЛ, ммоль/л |
3,02±0,012 |
3,05±0,008
|
3,06±0,009 |
4,28±0,010 р<0,01 |
5,20±0,12 р<0,01 |
3,04±0,007 |
|
АГП в плазме, Д233/1мл |
1,35±0,007 |
1,74±0,006 р<0,01 |
1,78±0,005 р<0,01 |
2,36±0,009 р<0,01 |
2,85±0,012 р<0,01 |
1,38±0,004 |
|
ТБК-активные продукты в плазме, мкмоль/л |
2,15±0,009 |
2,91±0,007 р<0,01 |
2,94±0,008 р<0,01
|
3,41±0,016 р<0,01
|
4,20±0,014 р<0,01 |
2,12±0,008 |
|
Антиоксидантный потенциал плазмы, % |
28,9±0,15 |
24,7±0,09 р<0,05 |
24,8±0,13 р<0,05
|
22,3±0,10 р<0,01
|
20,1±0,09 р<0,01
|
29,0±0,10 |
|
ХС тромбоцитов, мкмоль/109тр. |
0,65±0,005 |
0,67±0,004
|
0,67±0,006
|
0,71±0,008 р<0,05 |
0,75±0,009 р<0,01 |
0,66±0,004 |
|
ОФЛ тромбоцитов, мкмоль/109тр. |
0,48±0,003 |
0,48±0,005 |
0,48±0,005
|
0,46±0,008 р<0,05
|
0,44±0,010 р<0,05 |
0,49±0,006 |
|
ХС/ОФЛ тромбоцитов |
1,35±0,004 |
1,39±0,007 р<0,05 |
1,39±0,005 р<0,05 |
1,54±0,007 р<0,01 |
1,70±0,008 р<0,01 |
1,35±0,007 |
|
АГП тромбоцитов, Д233/109тр. |
1,82±0,007 |
2,02±0,008 р<0,05 |
2,03±0,009 р<0,05 |
2,32±0,005 р<0,01 |
2,49±0,009 р<0,01 |
1,83±0,006 |
|
МДА тромбоцитов, нмоль/109тр. |
0,70±0,008 |
0,83±0,009 р<0,01 |
0,82±0,009 р<0,01 |
0,95±0,013 р<0,01
|
1,08±0,015 р<0,01 |
0,69±0,007 |
|
Каталаза тромбоцитов, МЕ/109тр. |
8910,0±10,03 |
8100,0±12,11 р<0,01 |
8050,0±15,24 р<0,05 |
7520,0±13,02 р<0,01 |
7002,0±17,22 р<0,01 |
8890,0±16,18 |
|
СОД тромбоцитов, МЕ/ 109тр. |
1650,0±5,28 |
1560,0±6,03 р<0,05 |
1570,0±6,36 р<0,05 |
1500,0±6,61 р<0,01 |
1460,0±6,92 р<0,01 |
1650,0±4,65 |
|
АТ с АДФ, с |
45,6±0,06 |
40,5±0,06 р<0,05 |
40,8±0,08 р<0,05 |
36,5±0,09 р<0,01 |
32,2±0,07 р<0,01 |
45,0±0,10
|
|
АТ с коллагеном, с |
36,8±0,10 |
33,0±0,12 р<0,05 |
33,1±0,09 р<0,05 |
30,1±0,14 р<0,01 |
27,5±0,12 р<0,01 |
36,5±0,09
|
|
АТ с тромбином, с |
57,6±0,07 |
52,1±0,10 р<0,05 |
52,3±0,08 р<0,05 |
47,3±0,14 р<0,01 |
43,6±0,13 р<0,01 |
57,7±0,06
|
|
АТ с ристомицином, с |
47,9±0,05 |
43,6±0,08 р<0,05 |
43,2±0,09 р<0,05 |
39,4±0,09 р<0,01 |
35,0±0,10 р<0,01 |
47,5±0,07
|
|
АТ с Н2О2, с |
50,1±0,04 |
46,2±0,07 р<0,05 |
46,4±0,08 р<0,05 |
40,2±0,10 р<0,01 |
37,0±0,12 р<0,01 |
49,9±0,08
|
|
АТ с адреналином, с |
99,2±0,12 |
91,2±0,14 р<0,05 |
91,4±0,10 р<0,05 |
85,6±0,13 р<0,01 |
79,6±0,15 р<0,01 |
98,8±0,05
|
|
Дискоциты, %
|
86,0±0,10 |
81,2±0,12 р<0,05 |
81,0±0,16 р<0,05 |
78,2±0,19 р<0,05 |
75,4±0,23 р<0,01 |
85,6±0,12
|
|
Сумма активных форм, % |
14,0±0,08 |
18,8±0,09 р<0,05 |
19,0±0,12 р<0,05 |
21,8±0,15 р<0,01 |
24,6±0,13 р<0,01 |
14,4±0,12
|
|
Число малых агрегатов |
3,0±0,08 |
5,6±0,09 р<0,01 |
5,7±0,05 р<0,01 |
6,9±0,06 р<0,01 |
8,5±0,09 р<0,01 |
3,1±0,09
|
|
Число средних и больших агрегатов |
0,18±0,005 |
0,49±0,007 р<0,01 |
0,51±0,09 р<0,01 |
1,22±0,011 р<0,01 |
1,86±0,010 р<0,01 |
0,16±0,004
|
Условные обозначения: р - найденная достоверность различий показателей с группой контроля.
Рецензенты:
Громнацкий Н.И., д.м.н., профессор, профессор кафедры терапии №2 Курского государственного медицинского университета, г. Курск;
Жукова Л.А., д.м.н., профессор, зав. кафедрой эндокринологии и диабетологии Курского государственного медицинского университ