Использование персонализированного подхода в терапии онкологических заболеваний является одним из актуальных направлений современной медицины. Достижения в изучении молекулярного патогенеза колоректального рака (КРР) были эффективно применены в клинической практике при использовании моноклональных антител к рецептору эпидермального фактора роста EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) – цетуксимаба и панитумумаба. Успешное практическое применение знаний о молекулярном патогенезе КРР является результатом многолетних фундаментальных исследований сигнального пути EGFR/RAS/RAF/MAPK, регулирующего активность многих транскрипционных факторов и, соответственно, широкий спектр таких биологических процессов, как пролиферация, дифференцировка, подавление апоптоза, способность клетки к миграции и т.д. [2; 4]. Возникновение мутаций в гене KRAS (гомолог онкогена вируса саркомы Кирстен крыс), входящем в RAS-семейство протоонкогенов, является важнейшим генетическим изменением в механизмах патогенеза КРР. Ген KRAS является одним из наиболее часто мутирующих генов опухолей человека, а частота его мутаций при КРР составляет, по разным оценкам, от 30 до 50% [1]. Продуктом гена является расположенный ниже по сигнальному пути EGFR эффекторный белок, передающий сигнал далее на BRAF и активирующий каскад MAPK (mitogen-activated protein kinases). Мутации в гене KRAS приводят к конститутивной активации сигнального пути вследствие изменения GTP-азной активности KRAS [2; 6]. Показано, что при данной патологии наиболее часто в гене KRAS встречаются такие специфические точковые мутации (SNP – Single Nucleotide Polymorphism), как транзиции и трансверсии [8]. Изучение соотношения транзиций и трансверсий при возникновении соматических мутаций может быть информативным методом для изучения механизмов возникновения мутаций. При этом, по данным молекулярно-генетических исследований, примерно в 70% случаев SNP имеют природу транзиций [5]. Транзиции могут быть вызваны окислительным дезаминированием и таутомеризацией оснований. Несмотря на то что теоретически количество транзиций более чем в два раза может превышать количество возможных трансверсий, транзиции появляются в геномах чаще, возможно, из-за молекулярных механизмов, которые их генерируют [7].
Цель исследования: изучение спектра соматических мутаций (транзиций и трансверсий) в гене KRAS у пациентов с колоректальным раком с учетом возрастных и гендерных различий.
Материалы и методы исследования. В исследовании принимали участие 660 пациентов Юга России (304 мужчины и 356 женщин), проходивших лечение в ФГБУ «РНИОИ» с верифицированным диагнозом «аденокарцинома толстой и прямой кишки». Диапазон возраста пациентов находился в пределах от 28 до 89 лет. В работе был использован архивный материал тканей опухолей, полученный во время диагностических биопсий и оперативных вмешательств в период с 2009 по 2015 г. Из фиксированных в 10%-ном забуференном формалине и залитых в парафин опухолевых тканей получали срезы толщиной 3 мкм. Для последующего молекулярно-генетического исследования использовали срезы, содержащие не менее 20% опухолевых клеток. Экстракция ДНК включала стандартную процедуру депарафинирования в орто-ксилоле, лизис в 2% SDS-буфере в присутствии протеиназы K в течение 12 часов при 58 °C c последующей инкубацией при температуре 90° в течение 1 часа. Дальнейшие этапы экстракции ДНК проводили стандартным фенол-хлороформным методом [3]. Концентрацию выделенных из тканей опухолей препаратов ДНК измеряли на флюориметре Qubit 2.0® с использованием набора Quant-iT™ dsDNA High-Sensitivity (HS) Assay Kit (Invitrogen, USA). Для проведения Real-Time PCR концентрацию ДНК нормализовывали до 2 нг/мкл. При помощи набора реагентов «Real-Time-PCR-KRAS-7M» (Биолинк, Россия) проводили определение 7 миссенс-мутаций в 12 и 13 кодонах 2 экзона гена KRAS: G12C, G12S, G12R, G12V, G12D, G12A, G13D с использованием термоциклера Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, USA). Статистический анализ выполняли с использованием прикладных пакетов программ Microsoft Excel 2013 и STATISTICA 7.0. Оценку различий проводили с использованием непараметрического χ2-критерия, для уровня статистической значимости р<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение. При исследовании мутационного статуса гена KRAS в объединенной группе мужчин и женщин с КРР детектируемые мутации были обнаружены в 40,4% случаев (n=267) (табл. 1). Анализ спектра мутаций в гене KRAS показал, что доля транзиций составила 66,6% (n=178), что достоверно (для p=0,00001) в 2 раза превысило долю трансверсий (n=89; 33,3%). При сравнении частот встречаемости транзиций и трансверсий у пациентов (объединенная группа пациентов мужского и женского пола) с мутациями в гене KRAS в возрасте до 60 (n=128) и старше 60 (n=139) лет обнаружено, что доля транзиций в группе до 60 лет составила 52,3%, а в группе после 60 лет достоверно (р=0,0002) увеличилась почти на 30% и составила 79,8%. При этом доля трансверсий в этой группе у пациентов старше 60 лет уменьшается более чем в 2 раза – с 47,6 до 20,1% (при р=0,0154). Полученные данные свидетельствуют о том, что в структуре мутаций в гене KRAS с возрастом происходит существенное увеличение удельного веса транзиций и уменьшение удельного веса трансверсий. Так, у пациентов возрастной группы моложе 60 лет удельный вес транзиций и трансверсий сопоставим (52,3 и 47,6% соответственно); а в возрастной группе старше 60 лет удельный вес транзиций по отношению к трансверсиям увеличивается в 4 раза. При этом наблюдается тенденция к увеличению общей частоты мутаций в опухолях с увеличением возраста пациентов: с 37% у пациентов возрастной группы до 60 лет до 44% у пациентов старше 60 лет (p=0,25).
Таблица 1
|
Возраст |
Общее число пациентов N=660 (100%) |
Дикий тип N=393 (59,5%) |
Мутантный тип N= 267 (40,4%) |
Транзиции G12S G12D G13D N=178 (66,6%) |
Трансверсии G12A G12R G12V G12C N=89 (33,3%) |
Значение критерия χ2 |
Значение p, статистическая значимость |
|
≤ 60 лет |
345 (52.2%) |
217 (63%) |
128 (37%) |
67 (52,3%) |
61 (47,6%) |
22,70 |
0,00001 значимо |
|
> 60 лет |
315 (47.7%) |
176 (56%) |
139 (44%) |
111 (79,8%) |
28 (20,1%) |
||
|
Мужчины |
|||||||
|
≤ 60 лет |
145 (47,6%) |
99 (68,2%) |
46 (31,7%) |
35 (76,08%) |
11 (23,9%) |
0,45 |
0,5024 не значимо |
|
> 60 лет |
159 (52,3%) |
95 (59,7%) |
64 (40,2%) |
45 (70,3%) |
19 (29,6%) |
||
|
Женщины |
|||||||
|
≤ 60 лет |
200 (56,1%) |
118 (59%) |
82 (41%) |
32 (39,02%) |
50 (60,9%) |
40,05 |
0,00001 значимо |
|
> 60 лет |
156 (43,8%) |
81 (52%) |
75 (48%) |
66 (88%) |
9 (12%) |
||
Сравнительная характеристика мутационного статуса гена KRAS у пациентов с КРР в зависимости от возраста и пола
У женщин мутантный тип гена KRAS обнаружен в 157 случаях, что составило 44% от всех принимавших участие в исследовании пациентов женского пола (n=356), и данный показатель на 8% превышал аналогичный показатель для пациентов мужского пола. Эти различия носили статистически достоверный характер (χ2=4,27, для p=0,0389). У женщин в возрастной группе до 60 лет (n=200) мутантный тип гена KRAS выявлен в 41% случаев (82 пациента). Этот показатель почти на 10% превышал аналогичный показатель для пациентов мужского пола (p=0,2994). В данной возрастной группе спектр проявления мутаций в гене KRAS имел особенности по сравнению с аналогичной возрастной группой пациентов-мужчин. Так, на долю транзиций пришлось только 39,02% (32 пациента), что почти в 2 раза меньше, чем у мужчин (76,08%; р=0,0031), а на долю трансверсий - 60,9% (50 пациентов), что в 2,5 раза больше, чем у мужчин (р=0,03). В возрастной группе женщин старше 60 лет (156 человек) мутации в гене KRAS детектированы в 48% случаях (75 человек), что почти на 8% больше (р=0,3579) аналогичного показателя для мужчин (40,2%) и на 7% меньше (р=0,3792) аналогичного показателя для пациентов женского пола моложе 60 лет. В целом это свидетельствует о тенденции к увеличению частоты встречаемости мутантного типа гена KRAS среди пациентов женского пола с увеличением возраста. Из них на долю транзиций пришлось 88% всех мутаций (66 пациентов), а на долю трансверсий - в 7,3 раза меньше (достоверно при р=0,00001) - 12% (9 пациентов). При сравнении с пациентами-мужчинами из возрастной группы старше 60 лет отмечено, что число транзиций у женщин было достоверно (при р=0,0219) в 1,25 раза больше, а трансверсий в 2,4 раза меньше (при р=0,3175). Также при сравнении спектра мутаций в гене KRAS у женщин в разных возрастных группах показано, что транзиции в возрастной группе старше 60 лет (88%) встречаются почти в 2 раза чаще, чем у женщин моложе 60 лет (39,02%). Данные различия статистически достоверны для р=0,00001. Соответственно, трансверсии в группе пациенток старше 60 лет (12%) встречаются в 5 раз реже по сравнению с пациентками моложе 60 лет (60,9%). Данные различия также статистически достоверны для р=0,0089 (рис. 1).
Рис. 1. Изменение спектра мутаций в гене KRAS (транзиции/трансверсии) у мужчин и женщин в возрастных группах до 60 лет и старше (данные в %).
Информация о мутационном статусе гена KRAS является единственным диагностическим критерием для применения целого класса таргетных препаратов у пациентов с метастатическим КРР как в комбинации со стандартной химиотерапией, так и в качестве монотерапии второй линии. Не вызывает сомнений, что понимание генетических механизмов, лежащих в основе повреждения и аберрантной работы генов, в том числе и роли отдельных типов мутаций KRAS, позволит использовать анализ специфических генетических нарушений для принятия правильных клинических решений в рутинной практике ведения пациентов с КРР.
Выводы
Таким образом, собственные данные, полученные при исследовании пациентов с КРР на Юге России, позволили выявить следующие особенности спектра мутаций в гене KRAS.
1. Мутантный тип гена KRAS в исследованной популяции пациентов Юга России встречается достоверно чаще у женщин, чем у мужчин (p=0,0389).
2. У женщин моложе 60 лет транзиции встречаются достоверно (р=0,0031) реже, а трансверсии достоверно (р=0,03) чаще по сравнению с мужчинами аналогичного возраста.
3. У мужчин в возрастной группе старше 60 лет транзиции встречаются достоверно реже (р=0,0219), а трансверсии достоверно (р=0,3175) чаще по сравнению с пациентами-женщинами аналогичной возрастной группы.
3. У мужчин в возрастных группах до 60 и старше 60 лет транзиции встречаются достоверно чаще, чем трансверсии (р=0,003 и 0,0037).
4. Транзиции у женщин с мутантным типом гена KRAS в старшей возрастной группе (>60 лет) по сравнению с женщинами моложе 60 лет встречаются более чем в 2 раза чаще (р=0,00001), а трансверсии – более чем в 5 раз реже (р=0,0089).
Учитывая существенные отличия в частотах проявления транзиций и трансверсий в гене KRAS у пациентов женского пола разных возрастных групп (моложе и старше 60 лет) и отсутствие подобного рода резких изменений в различных возрастных группах пациентов мужского пола, необходимо сделать вывод о существенной роли гормонального статуса в генезе транзиций и трансверсий как минимум в данном генетическом локусе.
Рецензенты:
Шихлярова А.И., д.б.н., профессор, руководитель Испытательного лабораторного центра ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России, г. Ростов-на-Дону;
Франциянц Е.М., д.б.н., профессор, руководитель гормональной лаборатории ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России, г. Ростов-на-Дону.