Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

CHANGES IN THE SPECTRUM OF SOMATIC MUTATIONS IN THE KRAS GENE IN COLORECTAL CANCER TAKING INTO ACCOUNT THE AGE AND GENDER PROPERTIES OF PATIENTS

Vodolazhskiy D.I. 1 Kolesnikov E.N. 1 Dvadnenko K.V. 1 Kozhushko M.A. 1 Katsieva T.B. 1 Oleynikov D.D. 1 Gudueva E.N. 1 Enin Ya.S. 1
1 Rostov Research Institute of Oncology
A molecular genetic screening of mutations in the KRAS gene in 660 patients with colorectal cancer was performed by Real-Time PCR. The KRAS mutation rate was 40.4%, and transitions were twice more often than transversions (66.6% versus 33.3%). Mutations in the KRAS gene were significantly more frequent in women (44% of the cases) than in men (36%). Transitions in men were detected twice more often (72.7%) than transversions (27.2%); this regularity was typical of men under 60 years old and older. Women under 60 y.o. showed a significant increase in transition number (from 39% to 88%) in comparison with older patients, and accordingly decrease in transversions (from 60.9% to 12%). This allows supposing that specificity in distribution of transitions and transversions in the KRAS gene mutations is determined by both age and gender differences.
colorectal cancer
mutations
KRAS
transitions
transvertions

Использование персонализированного подхода в терапии онкологических заболеваний является одним из актуальных направлений современной медицины. Достижения в изучении молекулярного патогенеза колоректального рака (КРР) были эффективно применены в клинической практике при использовании моноклональных антител к рецептору эпидермального фактора роста EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) – цетуксимаба и панитумумаба. Успешное практическое применение знаний о молекулярном патогенезе КРР является результатом многолетних фундаментальных исследований сигнального пути EGFR/RAS/RAF/MAPK, регулирующего активность многих транскрипционных факторов и, соответственно, широкий спектр таких биологических процессов, как пролиферация, дифференцировка, подавление апоптоза, способность клетки к миграции и т.д. [2; 4]. Возникновение мутаций в гене KRAS (гомолог онкогена вируса саркомы Кирстен крыс), входящем в RAS-семейство протоонкогенов, является важнейшим генетическим изменением в механизмах патогенеза КРР. Ген KRAS является одним из наиболее часто мутирующих генов опухолей человека, а частота его мутаций при КРР составляет, по разным оценкам, от 30 до 50% [1]. Продуктом гена является расположенный ниже по сигнальному пути EGFR эффекторный белок, передающий сигнал далее на BRAF и активирующий каскад MAPK (mitogen-activated protein kinases). Мутации в гене KRAS приводят к конститутивной активации сигнального пути вследствие изменения GTP-азной активности KRAS [2; 6]. Показано, что при данной патологии наиболее часто в гене KRAS встречаются такие специфические точковые мутации (SNP – Single Nucleotide Polymorphism), как транзиции и трансверсии [8]. Изучение соотношения транзиций и трансверсий при возникновении соматических мутаций может быть информативным методом для изучения механизмов возникновения мутаций. При этом, по данным молекулярно-генетических исследований, примерно в 70% случаев SNP имеют природу транзиций [5]. Транзиции могут быть вызваны окислительным дезаминированием и таутомеризацией оснований. Несмотря на то что теоретически количество транзиций более чем в два раза может превышать количество возможных трансверсий, транзиции появляются в геномах чаще, возможно, из-за молекулярных механизмов, которые их генерируют [7].

Цель исследования: изучение спектра соматических мутаций (транзиций и трансверсий) в гене KRAS у пациентов с колоректальным раком с учетом возрастных и гендерных различий.

Материалы и методы исследования. В исследовании принимали участие 660 пациентов Юга России (304 мужчины и 356 женщин), проходивших лечение в ФГБУ «РНИОИ» с верифицированным диагнозом «аденокарцинома толстой и прямой кишки». Диапазон возраста пациентов находился в пределах от 28 до 89 лет. В работе был использован архивный материал тканей опухолей, полученный во время диагностических биопсий и оперативных вмешательств в период с 2009 по 2015 г. Из фиксированных в 10%-ном забуференном формалине и залитых в парафин опухолевых тканей получали срезы толщиной 3 мкм. Для последующего молекулярно-генетического исследования использовали срезы, содержащие не менее 20% опухолевых клеток. Экстракция ДНК включала стандартную процедуру депарафинирования в орто-ксилоле, лизис в 2% SDS-буфере в присутствии протеиназы K в течение 12 часов при 58 °C c последующей инкубацией при температуре 90° в течение 1 часа. Дальнейшие этапы экстракции ДНК проводили стандартным фенол-хлороформным методом [3]. Концентрацию выделенных из тканей опухолей препаратов ДНК измеряли на флюориметре Qubit 2.0® с использованием набора Quant-iT™ dsDNA High-Sensitivity (HS) Assay Kit (Invitrogen, USA). Для проведения Real-Time PCR концентрацию ДНК нормализовывали до 2 нг/мкл. При помощи набора реагентов «Real-Time-PCR-KRAS-7M» (Биолинк, Россия) проводили определение 7 миссенс-мутаций в 12 и 13 кодонах 2 экзона гена KRAS: G12C, G12S, G12R, G12V, G12D, G12A, G13D с использованием термоциклера Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, USA). Статистический анализ выполняли с использованием прикладных пакетов программ Microsoft Excel 2013 и STATISTICA 7.0. Оценку различий проводили с использованием непараметрического χ2-критерия, для уровня статистической значимости р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение. При исследовании мутационного статуса гена KRAS в объединенной группе мужчин и женщин с КРР детектируемые мутации были обнаружены в 40,4% случаев (n=267) (табл. 1). Анализ спектра мутаций в гене KRAS показал, что доля транзиций составила 66,6% (n=178), что достоверно (для p=0,00001) в 2 раза превысило долю трансверсий (n=89; 33,3%). При сравнении частот встречаемости транзиций и трансверсий у пациентов (объединенная группа пациентов мужского и женского пола) с мутациями в гене KRAS в возрасте до 60 (n=128) и старше 60 (n=139) лет обнаружено, что доля транзиций в группе до 60 лет составила 52,3%, а в группе после 60 лет достоверно (р=0,0002) увеличилась почти на 30% и составила 79,8%. При этом доля трансверсий в этой группе у пациентов старше 60 лет уменьшается более чем в 2 раза – с 47,6 до 20,1% (при р=0,0154). Полученные данные свидетельствуют о том, что в структуре мутаций в гене KRAS с возрастом происходит существенное увеличение удельного веса транзиций и уменьшение удельного веса трансверсий. Так, у пациентов возрастной группы моложе 60 лет удельный вес транзиций и трансверсий сопоставим (52,3 и 47,6% соответственно); а в возрастной группе старше 60 лет удельный вес транзиций по отношению к трансверсиям увеличивается в 4 раза. При этом наблюдается тенденция к увеличению общей частоты мутаций в опухолях с увеличением возраста пациентов: с 37% у пациентов возрастной группы до 60 лет до 44% у пациентов старше 60 лет (p=0,25).

Таблица 1

Возраст

Общее число пациентов

N=660

(100%)

Дикий тип

N=393 (59,5%)

Мутантный тип

N= 267 (40,4%)

Транзиции

G12S

G12D

G13D

N=178

(66,6%)

Трансверсии

G12A

G12R

G12V

G12C

N=89 (33,3%)

Значение критерия χ2

Значение p, статистическая значимость

 

≤ 60 лет

345 (52.2%)

217 (63%)

128 (37%)

67 (52,3%)

61 (47,6%)

22,70

0,00001

значимо

> 60 лет

315 (47.7%)

176 (56%)

139 (44%)

111 (79,8%)

28 (20,1%)

Мужчины

≤ 60 лет

145 (47,6%)

99 (68,2%)

46 (31,7%)

35 (76,08%)

11 (23,9%)

0,45

0,5024

не значимо

> 60 лет

159 (52,3%)

95 (59,7%)

64 (40,2%)

45 (70,3%)

19 (29,6%)

Женщины

≤ 60 лет

200 (56,1%)

118 (59%)

82 (41%)

32 (39,02%)

50 (60,9%)

40,05

0,00001

значимо

> 60 лет

156 (43,8%)

81 (52%)

75 (48%)

66 (88%)

9 (12%)

Сравнительная характеристика мутационного статуса гена KRAS у пациентов с КРР в зависимости от возраста и пола

У женщин мутантный тип гена KRAS обнаружен в 157 случаях, что составило 44% от всех принимавших участие в исследовании пациентов женского пола (n=356), и данный показатель на 8% превышал аналогичный показатель для пациентов мужского пола. Эти различия носили статистически достоверный характер (χ2=4,27, для p=0,0389). У женщин в возрастной группе до 60 лет (n=200) мутантный тип гена KRAS выявлен в 41% случаев (82 пациента). Этот показатель почти на 10% превышал аналогичный показатель для пациентов мужского пола (p=0,2994). В данной возрастной группе спектр проявления мутаций в гене KRAS имел особенности по сравнению с аналогичной возрастной группой пациентов-мужчин. Так, на долю транзиций пришлось только 39,02% (32 пациента), что почти в 2 раза меньше, чем у мужчин (76,08%; р=0,0031), а на долю трансверсий - 60,9% (50 пациентов), что в 2,5 раза больше, чем у мужчин (р=0,03). В возрастной группе женщин старше 60 лет (156 человек) мутации в гене KRAS детектированы в 48% случаях (75 человек), что почти на 8% больше (р=0,3579) аналогичного показателя для мужчин (40,2%) и на 7% меньше (р=0,3792) аналогичного показателя для пациентов женского пола моложе 60 лет. В целом это свидетельствует о тенденции к увеличению частоты встречаемости мутантного типа гена KRAS среди пациентов женского пола с увеличением возраста. Из них на долю транзиций пришлось 88% всех мутаций (66 пациентов), а на долю трансверсий - в 7,3 раза меньше (достоверно при р=0,00001) - 12% (9 пациентов). При сравнении с пациентами-мужчинами из возрастной группы старше 60 лет отмечено, что число транзиций у женщин было достоверно (при р=0,0219) в 1,25 раза больше, а трансверсий в 2,4 раза меньше (при р=0,3175). Также при сравнении спектра мутаций в гене KRAS у женщин в разных возрастных группах показано, что транзиции в возрастной группе старше 60 лет (88%) встречаются почти в 2 раза чаще, чем у женщин моложе 60 лет (39,02%). Данные различия статистически достоверны для р=0,00001. Соответственно, трансверсии в группе пациенток старше 60 лет (12%) встречаются в 5 раз реже по сравнению с пациентками моложе 60 лет (60,9%). Данные различия также статистически достоверны для р=0,0089 (рис. 1).


Рис. 1. Изменение спектра мутаций в гене KRAS (транзиции/трансверсии) у мужчин и женщин в возрастных группах до 60 лет и старше (данные в %).

Информация о мутационном статусе гена KRAS является единственным диагностическим критерием для применения целого класса таргетных препаратов у пациентов с метастатическим КРР как в комбинации со стандартной химиотерапией, так и в качестве монотерапии второй линии. Не вызывает сомнений, что понимание генетических механизмов, лежащих в основе повреждения и аберрантной работы генов, в том числе и роли отдельных типов мутаций KRAS, позволит использовать анализ специфических генетических нарушений для принятия правильных клинических решений в рутинной практике ведения пациентов с КРР.

Выводы

Таким образом, собственные данные, полученные при исследовании пациентов с КРР на Юге России, позволили выявить следующие особенности спектра мутаций в гене KRAS.

1. Мутантный тип гена KRAS в исследованной популяции пациентов Юга России встречается достоверно чаще у женщин, чем у мужчин (p=0,0389).

2. У женщин моложе 60 лет транзиции встречаются достоверно (р=0,0031) реже, а трансверсии достоверно (р=0,03) чаще по сравнению с мужчинами аналогичного возраста.

3. У мужчин в возрастной группе старше 60 лет транзиции встречаются достоверно реже (р=0,0219), а трансверсии достоверно (р=0,3175) чаще по сравнению с пациентами-женщинами аналогичной возрастной группы.

3. У мужчин в возрастных группах до 60 и старше 60 лет транзиции встречаются достоверно чаще, чем трансверсии (р=0,003 и 0,0037).

4. Транзиции у женщин с мутантным типом гена KRAS в старшей возрастной группе (>60 лет) по сравнению с женщинами моложе 60 лет встречаются более чем в 2 раза чаще (р=0,00001), а трансверсии – более чем в 5 раз реже (р=0,0089).

Учитывая существенные отличия в частотах проявления транзиций и трансверсий в гене KRAS у пациентов женского пола разных возрастных групп (моложе и старше 60 лет) и отсутствие подобного рода резких изменений в различных возрастных группах пациентов мужского пола, необходимо сделать вывод о существенной роли гормонального статуса в генезе транзиций и трансверсий как минимум в данном генетическом локусе.

Рецензенты:

Шихлярова А.И., д.б.н., профессор, руководитель Испытательного лабораторного центра ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России, г. Ростов-на-Дону;

Франциянц Е.М., д.б.н., профессор, руководитель гормональной лаборатории ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России, г. Ростов-на-Дону.