Изучением вопросов старения и антистарения занято все прогрессивное человечество. Наступающее с возрастом истощение иммунной системы играет ключевую роль в снижении показателей здоровья и продолжительности жизни [3.4].
Иммунная и кроветворная система тесно взаимосвязаны, поскольку происходят от общих поливалентных стволовых клеток. Обе системы выполняют защитную роль от инфекционных агентов, предупреждают развитие в организме опухолей [1]. Однако с возрастом резервные возможности основного гемопоэза у животных и у человека могут сужаться и приводить к снижению способности реагировать на различные стрессорные воздействия [1].
В связи с этим настоящая работа была посвящена выявлению функциональных изменений кроветворной и иммунной систем, а также высшей нервной деятельности у старых крыс и разработке новых патогенетических путей коррекции выявленных нарушений.
Материал и методы
Эксперименты выполнены на 40 белых крысах-самцах массой 220-340 г., содержавшихся в стандартных условиях вивария на обычном пищевом рационе. Проведены 2 серии экспериментов: 1 серия - старые интактные крысы; 2 серия - старые крысы, получавшие МХФ-15 в/м из расчета 50 мг/кг массы тела. Исследуемый препарат вводили на физиологическом растворе подкожно в объеме 0,5 мл в течение недели. МХФ-15 синтезирован в АО «Институт химии имени А.Б. Бектурова». Контрольная группа (интактные крысы) получала эквивалентный обьем физиологического раствора. В каждой серии было по 20 крыс. Исследования проводили через одну и две недели от начала эксперимента. Забор крови у животных проводили под хлороформовым наркозом. Показатели иммунного статуса определяли с помощью методик по определению в крови: общего количества лейкоцитов, лейкоформулы (по общепринятой методике); спонтанного и индуцированного НСТ теста, спонтанного и индуцированного фагоцитоза [2]; неконъюгированных моноклональных антител к CD3-, CD4-, CD8- лимфоцитам крыс в медицинском центре «Иммунодиагностика».
Медико-биологические эксперименты и доклинические исследования на животных проводились согласно «Правилам проведения доклинических исследований, медико-биологических экспериментов и клинических испытаний в Республике Казахстан», утвержденным приказом Министра здравоохранения Республики Казахстан от 25 июля 2007 года № 442 в соответствии с Госстандартом Республики Казахстан «Надлежащая лабораторная практика. Основные положения», утвержденным приказом Министра индустрии и торговли РК. Получено решение локальной этической комиссии КазНМУ.
Процедуры статистического анализа выполнялись с помощью ППП SPSS-16, STATISTIKA - 7. Для проверки совпадения распределения исследуемых количественных показателей с нормальным в группах был использован критерий согласия Колмогорова -Смирнова. Ввиду того, что закон распределения исследуемых числовых показателей отличался от нормального, значимость различий проверена при помощи критерия Вилкоксона (в случае зависимых групп) и U-критерия Манна - Уитни (в случае независимых совокупностей). Различия считались значимыми при p ≤ 0,05.
Результаты и обсуждение
Через 1 сутки после завершения лечения МХФ-15 установлено снижение на 45,3 % (р=0,001, z=3,213) сегментоядерных нейтрофилов против контроля, а к 7 суткам увеличение абсолютного и относительного содержания лимфоцитов на 15,6 % (р=0,082) и 13,1 % (р=0,001, z=3,213) соответственно, повышению ИИР на 62,1 % по сравнению с предыдущим сроком исследования и на 12,3 % по сравнению с интактными особями. Факторная модель, построенная на основе корреляционной матрицы, показала, что под влиянием МХФ-15 наибольшим изменениям подвергались следующие переменные, объединенные в фактор 1: абсолютное содержание лимфоцитов (векторная нагрузка +0,929), моноциты (векторная нагрузка +0,807) и эозинофилы (векторная нагрузка -0,796). Через 7 суток переменные, вошедшие в фактор 1, показали, что влияние МХФ-15 больше ассоциировано с нейтрофильной реакцией крови, с векторной нагрузкой для сегментоядерных +0,900, для палочкоядерных - +0,824. Во втором факторе больший вклад внесли такие показатели крови, как лимфоциты (векторная нагрузка +0,830), с которыми ассоциировано увеличение общих лейкоцитов (+0,955).
МХФ-15 оказал модулирующее влияние на показатели лимфоцитарного иммунитета. Через 1 сутки после окончания недельной коррекции у крыс, леченных МХФ-15, в 1,6 раз (р=0,001, z=3,250) возрастало среднее значение лимфоцитов с хелперной активностью, отмечалось увеличение цитотоксической активности лимфоцитов на 33,3 % (р=0,003, z=2,948) по сравнению с интактными старыми особями. Через неделю МХФ-15 вызывал повышение Т-хелперов на 37,5 % (р=0,016, z=2,419) и иммунорегуляторного индекса на 25 % (р=0,002, z=3,024).
Имеются различные толкования о том, какую смысловую нагрузку несет увеличение или уменьшение Тreg у старых животных. Одни авторы считают, что с возрастом процент Т-клеток уменьшается, в частности цитотоксических Т-клеток, тогда как Т-хелперы увеличиваются [5]. Другие авторы придерживаются мнения о том, что Т-клеточная физиология стареющего организма обусловлена снижением их хелперно-супрессорной активности за счет изменения сигнальных путей стареющих Т-клеток [6.7]. По-видимому, объяснением тому служит «многофункциональность» CD8+ Т-клеток. С одной стороны CD8+ Т-клетки обладают рядом антимикробных эффекторных механизмов, которые являются менее заметными или отсутствуют в CD4 Th1 и Th17 Т-клетках [8]. CD8+ Т-клетки высвобождают цитокины или цитотоксические молекулы, которые вызывают апоптоз клеток-мишеней. С другой стороны, CD8+Т-клетки оказывают тормозные эффекты для CD4+Т-лимфоцитов.
Исследования кислородзависимых показателей микробицидности нейтрофилов в НСТ-тесте показали, что через 1 сутки после завершения лечения МХФ-15 индуцированная активность нейтрофилов повышалась в 1,6 раза (р=0,0003, z=3,628) по сравнению с нелеченными старыми особями. Спонтанный и индуцированный фагоцитоз в 1,2 (р=0,017, z=2,381) и 1,9 раз (р=0,0002, z=-3,780) статистически значимо превышал показатели нелеченных животных (рис.1).
Рис.1. Сравнительная характеристика показателей метаболической и поглотительной активности нейтрофилов у старых крыс, леченных МХФ-15, в сравнении с интактными старыми (через 1 сутки)
Примечание: Mean - среднее; Mean±0.95 Conf. Interval - среднее±95 % ДИ
Через 7 суток под влиянием МХФ-15 отмечалось статистически значимое увеличение спонтанного и индуцированного вариантов НСТ-теста и фагоцитоза на 47,1 % (р=0,001, z=3,213), 96,4 % (р=0,0002, z=3,742), 49,2 % (р=0,002, z=3,099) и 100,4 % (р=0,0002, z=3,780) соответственно.
Исследование в тесте «открытое поле» поведенческих реакций старых крыс, в течение недели получавших МХФ-15, в оба срока исследования показало увеличение суммарной вертикальной двигательной активности (р≤0,005), сокращение в 1,7 акта «движение на месте» (р=0,033, z=2,132) по сравнению с интактными особями.
Статистически значимое сокращение латентного периода вхождения в темный отсек при выработке норкового рефлекса у старых крыс, леченных МХФ-15, по сравнению с нелеченными старыми особями составило 46,3 % (р=0,002, z=-3,021). Проверка РПИ показала, что под влиянием МХФ-15 у крыс последовал мотивированный «отказ» от вхождения в наказуемый темный отсек камеры, что указывало на то, что у старых крыс не сформировался рефлекс на безусловный раздражитель (р=0,013, z=2,488).
В тесте РАИ под влиянием МХФ-15 опытные крысы совершили 9 правильных реакций избегания, что в 2 раза статистически значимо (р=0,0004, z=3,554) превышало показатели нелеченных старых крыс. Однако во втором опытном сеансе МХФ-15 не оказывал заметного влияния на процессы консолидации временных связей РАИ.
Выработка навигационных навыков в водном лабиринте у старых крыс, леченных МХФ-15, показала, что поиск безопасной платформы у этих крыс занял 84 с. против 118,5 с контрольных старых. Во время проверки опытные крысы сократили время поиска платформы до 30 с, что было статистически значимо как по отношению к предыдущему сроку (р=0,0004, z=3,516), так и к показателям нелеченных старых особей (р=0,011, z=-2,532).
Заключение
Таким образом, под влиянием МХФ-15 в периферической крови старых крыс уже на первые сутки исследования существенно корригированы абсолютное содержание лимфоцитов, моноцитов и эозинофилов. Через 7 суток последовало восстановление нейтрофильной реакции крови. Между тем в оба срока исследования установлено повышение метаболической и поглотительной активности нейтрофилов. Под влиянием МХФ-15 в оба срока исследования существенно нарастает хелперная активность лимфоцитов. МХФ-15 существенно повышает вертикальную активность старых крыс в тесте «открытое поле». Под влиянием МХФ-15 существенно корригируется формирование безусловной реакции избегания яркого света, тогда как на консолидацию и воспроизведение временных связей РПИ, так же как и РАИ МХФ-15, не оказывает влияния. Под влиянием МХФ-15 у старых крыс существенно улучшаются пространственно-ориентировочные навыки.
Рецензенты:
Пичхадзе Г.М., д.м.н., профессор, зав. кафедрой фармакологии КазНМУ им. С.Д. Асфендиярова, г. Алматы;
Шарипов К.О., д.б.н., профессор, зав. кафедрой биологической химии КазНМУ им. С.Д. Асфендиярова, г. Алматы.