Гормоны щитовидной железы оказывают множество эффектов на рост, развитие организма и обменные процессы. В исследованиях in vitro показано, что трийодтиронин (Т3) и тетрайодтиронин (Т4) стимулируют экспрессию Pgp [3]. На кроликах породы шиншилла выявлено, что тироксин дозозависимо повышает функциональную активность данного белка-транспортера на уровне целостного организма [2].
Целью настоящего исследования стала оценка функциональной активности Pgp при хирургическом экспериментальном гипотиреозе.
Материалы и методы исследования
Работа выполнена на 13 половозрелых кроликах-самках породы шиншилла, массой 3500-4300 г, находящихся в фазе диэструса, полученных из питомника ООО «Касимов-Миакро» и имеющих необходимые ветеринарные свидетельства. Экспериментальные исследования проводили в соответствии с правилами лабораторной практики (Приложение к приказу Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 года 708н).
1-ю группу животных составили кролики, у которых оценивали функционирование Pgp после «ложной операции» (n=5); 2-ю группу - кролики, у которых определяли функциональную активность Pgp на фоне хирургического экспериментального гипотиреоза (n=8). «Ложная» операция заключалась во вскрытии кожных покровов и подкожной жировой клетчатки в проекции щитовидной железы с последующим послойным ушиванием раны. Хирургический экспериментальный гипотиреоз моделировали посредством субтотальной резекции щитовидной железы с оставлением паращитовидных желез. Оперативные вмешательства выполняли в условиях операционной после наркотизации животных введением рометара (ксилазина гидрохлорида) в дозе 4,0-6,0 мг/кг массы внутримышечно (в/м) с последующим (через 20 минут) в/м введением золетила-50 в дозе 5-10 мг/кг массы [1].
За 7 дней до операции, на 7-е, 14-е (животные 1-й и 2-й групп), 21-е и 28-е сутки после операции (животные 2-й группы) определяли функциональную активность Pgp по анализу фармакокинетики фексофенадина - маркерного субстрата данного белка-транспортера после его однократного перорального введения в дозе 30 мг/кг массы («Телфаст», SanofiAventis, Франция) [2] с последующим забором крови из краевой вены уха через 1; 2; 3; 4; 5; 6; 12 и 24 часа в гепаринизированные пробирки в объеме 5 мл.
Фексофенадин не подвергается метаболизму, и его фармакокинетика зависит исключительно от функционирования Pgp. Поэтому высокие концентрации фексофенадина в плазме крови кроликов и его медленное выведение свидетельствуют о низкой функциональной активности Pgp, и наоборот. Плазменные концентрации фексофенадина определяли методом ВЭЖХ на хроматографе Beckman Coulter (США) с УФ-детектированием по оригинальной методике [2]. В ходе исследования оценивали следующие фармакокинетические параметры фексофенадина: Сmax - максимальная концентрация (нг/мл); AUC0-t - площадь под кривой «концентрация - время» от нуля до времени последнего забора крови (нг*ч/мл); Сl - общий клиренс (мл/мин); Сmax / AUC0-t - коэффициент абсорбции.
У животных 2-й группы в указанные сроки также определяли уровни тиреоидных гормонов (ТТГ, общий Т3, общий Т4) в сыворотке крови радиоиммунным методом с использованием стандартных тест-систем производства IMMUNOTECH (Чехия) и дальнейшей оценкой результатов на анализаторе «Иммунотест» (Россия) в ЦНИЛ РязГМУ.
Полученные результаты обрабатывали с помощью программ StatSoft Statistica 7.0 и «Биостат». Характер распределения данных оценивали по критерию Шапиро-Уилка. Для сравнения показателей, имеющих нормальное распределение, использовали тест ANOVA повторных измерений, а при распределении признаков, отличном от нормального, - критерий Фридмана. Различия между сериями определяли по критерию Ньюмена-Кейсла. Для анализа корреляции между гормональным статусом кроликов и фармакокинетическими параметрами фексофенадина использовали коэффициент корреляции Спирмена. Данные в таблицах представлены в виде среднего арифметического и стандартного отклонения среднего арифметического (M±SD) в случае их нормального распределения, и медианы, нижнего и верхнего квартилей (Med, lq, uq) - в случае отличного от нормального распределения.
Результаты исследования и их обсуждение
Выполнение ложной операции не оказало влияния на фармакокинетические параметры маркерного субстрата Pgp - фексофенадина - на 7-е и 14-е сутки после оперативного вмешательства, что свидетельствует о сохранении функциональной активности белка-транспортера на исходном уровне (табл. 1).
Таблица 1
Основные фармакокинетические параметры фексофенадина после выполнения «ложной операции» (n=5)
|
Изучаемые параметры |
Исходные значения |
7-е сутки после «ложной операции» |
14-е сутки после «ложной операции» |
|
Сmax, нг/мл |
172,0 (95,7; 356,9) |
139,3 (138,1; 173,4) |
253,0 (164,7; 256,2) |
|
AUC0-t, (нг/мл)×ч |
746,4 (360,7; 1302,4) |
1141,4 (627,7; 1224,9) |
1750,7 (1634,6; 1793,3) |
|
Cl, л/ч |
396,7±408,9 |
294,8±211,4 |
102,4±61,6 |
|
Cmax/AUC0-t, 1/ч |
0,21±0,11 |
0,20±0,10 |
0,08±0,05 |
* - p<0,05 - достоверные различия по сравнению с показателями интактных животных (исходные значения).
Субтотальная резекция щитовидной железы приводила к развитию экспериментального гипотиреоза, о чем свидетельствуют изменения гормонального статуса кроликов (табл. 2). Концентрация ТТГ достоверно (p<0,05) повышалась на 7-е сутки эксперимента на 21,1%, на 14-е сутки - на 14,7%, на 21-е сутки - на 16,8%, на 28-е сутки - на 12,0%. Уровень Т3 снижался на 7-е и 14-е сутки послеоперационного периода на 45,4% (p<0,05) и 28,0% (p<0,05) соответственно, а в остальные сроки достоверно от исходных показателей не отличался. Содержание Т4 достоверно (p<0,05) уменьшалось на 7-е сутки на 45,6%, на 14-е сутки - на 26,1%, на 21-е сутки - на 21,7%, а на 28-е сутки - на 20,8%. Нормализация Т3 к 21-му дню исследования свидетельствует о регенерации щитовидной железы и восстановлении уровня, в первую очередь, наиболее активного гормона.
В таблице 2 представлены изменения фармакокинетики фексофенадина на фоне хирургического гипотиреоза. На 7-е сутки эксперимента Сmax фексофенадина увеличивалась на 121,7% (p<0,05), AUC0-t - на 231,3% (p<0,05), Cl уменьшался на 66,9% (p<0,05) по сравнению с исходными значениями. На 14-е сутки экспериментальной патологии Сmax фексофенадина увеличивалась на 99,4% (p<0,05), AUC0-t - на 218,9% (p<0,05), Cl уменьшался на 66,5% (p<0,05). На 21-е сутки исследования Сmax фексофенадина превышала исходные показатели на 137,8% (p<0,05), AUC0-t - на 308,6% (p<0,05), Cl был снижен на 75,0% (p<0,05). На 28-е сутки патологии Сmax фексофенадина оставалась повышенной на 189,5% (p<0,05), AUC0-t - на 247,6% (p<0,05) по сравнению со значениями интактных кроликов, Cl снижался на 66,7% (p<0,05). На протяжении всего исследования отношение Cmax/AUC0-t - показатель, характеризующий всасывание фексофенадина в кишечнике -достоверно по сравнению с показателями интактных животных не изменялось (p>0,05).
Таблица 2
Основные фармакокинетические параметры фексофенадина и гормональный статус кроликов на фоне хирургического экспериментального гипотиреоза (n=8)
|
Изучаемые параметры |
Исходные значения |
Сутки после субтотальной резекции щитовидной железы |
|||
|
7-е сутки |
14-е сутки |
21-е сутки |
28-е сутки |
||
|
Сmax, нг/мл |
119,6 (94,2; 175,3) |
265,1 (153,7; 404,5)* |
238,5 (187,7; 412,5)* |
284,4 (200,1; 467,0)* |
346,3 (175,2; 486, 2)* |
|
AUC0-t, (нг/мл)×ч |
829,9 (459,1; 1270,2) |
2749,7 (1707,3; 4020,3)* |
2647,3 (1426,0; 3297,4)* |
3391,2 (2127,5; 4763,3)* |
2884,6 (1535,9; 5347,6)* |
|
Cl, л/ч |
72,0 (36,8; 128,8) |
23,8 (12,9; 40,7)* |
24,1 (14,4; 52,8)* |
18,0 (11,7; 36,4)* |
24,0 (8,9; 42,9)* |
|
Cmax/AUC0-t, 1/ч |
0,14 (0,12; 0,22) |
0,09 (0,09; 0,12) |
0,12 (0,07; 0,20) |
0,09 (0,08; 0,12) |
0,12 (0,08; 0,14) |
|
ТТГ, мМЕ/л |
0,95±0,145 |
1,15±0,09* |
1,09±0,064* |
1,11±0,045* |
1,08±0,04* |
|
Общий Т3, нмоль/л. |
9,52±1,174 |
5,20±1,574* |
6,85±1,818* |
8,48±1,219 |
8,18±1,440 |
|
Общий Т4, нмоль/л |
13,99±2,497 |
7,61±3,039* |
10,34±2,352* |
10,96±1,735* |
11,08±1,612* |
* - p<0,05 - достоверные различия по сравнению с показателями интактных животных (исходные значения).
При проведении корреляционного анализа были выявлены достоверные зависимости между концентрацией ТТГ и Сmax (R=0,39, p=0,012), ТТГ и AUC0-t (R=0,525, p=0,0005), ТТГ и Cl (R=-0,46, p=0,003), уровнем Т4 и Cmax/AUC0-t, (R=0,38, p=0,016).
Динамика параметров фармакокинетики фексофенадина - маркерного субстрата Pgp - указывает на более высокое содержание препарата в плазме крови у животных на фоне хирургического экспериментального гипотиреоза, что, в свою очередь, характеризует уменьшение функциональной активности белка-транспортера на организменном уровне. При проведении «ложной операции» функциональная активность Pgp оставалась на исходном уровне, что является подтверждением того, что изменение функционирования белка-транспортера связано именно с резекцией щитовидной железы.
Молекулярные механизмы изменения функционирования Рgp в настоящее время активно изучаются. Ведущую роль в данном процессе играет уровень экспрессии гена MDR1, кодирующего данный белок-транспортер.
Его повышенная экспрессия в нормальных и трансформированных клетках инициируется сигналами от большого количества стимулов, которые сходятся на общей области промотора гена MDR1, называемой «MDR1 enhanceosome» [4].
Тиреоидные гормоны могут повышать экспрессию Pgp, непосредственно взаимодействуя с промотором гена MDR1 или опосредованно, через прегнан-Х-рецептор [3]. Большинство эффектов гормонов щитовидной железы реализуется в результате их взаимодействия со специфическими ядерными рецепторами, которые всегда связаны с участками ДНК - «тиреоидчувствительными элементами» (thyroid response elements). В отсутствие гормонов соответствующие рецепторы ингибируют экспрессию генов, в присутствии тиреиодных гормонов блок снимается [6].
Выявленная в исследовании корреляционная зависимость между содержанием ТТГ - Сmax, AUC0-t и Cl при отсутствии достоверных связей с концентрациями Т3 и Т4 свидетельствует о том, что функционирование Pgp при хирургическом гипотиреозе зависит не столько от уровня тиреоидных гормонов, сколько от факта их дефицита, показателем которого является в первую очередь концентрация ТТГ.
Выводы
Таким образом, в настоящем исследовании установлено, что при хирургическом экспериментальном гипотиреозе у кроликов происходит снижение функциональной активности гликопротеина-Р на уровне целостного организма, определяемой по фармакокинетике его маркерного субстрата - фексофенадина.
Рецензенты:
Ших Е.В., д.м.н., профессор, директор Института профессионального образования ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России, г. Москва;
Покровский М.В., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой фармакологии ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» Министерства образования и науки Российской Федерации, г. Белгород.