Обширные исследования в области синтеза и определения биологической активности 4-(гет)арил-2-гидрокси-4-оксобут-2-еновых кислот остаются актуальными за счет наличия в исходной матрице кислоты нескольких реакционных центров, позволяющих вводить в структуру различные биологически активные фрагменты. В ряду данных производных ранее были получены запатентованные соединения, содержащие в своей структуре бензо[d]тиазол, обладающие противомикробной, противовоспалительной и гипогликемической активностью [2-4]. Известно, что данный фармакофор содержится в таких лекарственных препаратах, как рилузол, прамипексол, тиарамид, этоксозоламид. Кроме того, установлено, что производные, содержащие этот гетероцикл, обладают противовоспалительным, антимикробным, противовирусным, антигельминтным, противоопухолевым, противосудорожным и другими видами биологического действия [6,8-10]. Таким образом, представляет интерес проведение анализа результатов испытаний in silico и in vivo, а также выявление некоторых закономерностей «структура - биологическая активность» в ряду производных 4-(гет)арил-2-гидрокси-4-оксобут-2-еновых кислот, содержащих фрагмент бензо[d]тиазола.
Целью работы является сравнительное исследование данных, полученных в программе PASS Online, с результатами фармакологического скрининга новых производных бензо[d]тиазола.
Материалы и методы исследования
На предварительном этапе компьютерный прогноз биологической активности был осуществлен для 89 запланированных к синтезу химических соединений, содержащих в структуре фрагмент бензо[d]тиазола. Критериями оценки степени активности в системе PASS Online служили вероятность проявления активности Pa, а также отношение вероятности проявления активности к вероятности ее отсутствия Pa/Pi [1]. Лишь соединения, предположительно обладающие одним из доступных к изучению видов активности (противовоспалительная, анальгетическая, гипогликемическая, противомикробная), были включены в работу. Таким образом, к синтезу было предложено 34 соединения, установлена их тонкая структура, определены физико-химические, а также спектральные характеристики методами ИК-, ЯМР1Н-спектроскопии. Для проведения фармакологического скрининга полученным соединениям присвоены условные шифры от I до XXXIV.
Острая токсичность наиболее активных соединений изучали на белых нелинейных мышах обоего пола массой 18-22 г с определением LD50 по методу Першина Г.Н. Каждое соединение испытывали на 6 животных. Соединения вводили перорально в виде взвеси в 2% крахмальном растворе однократно, после чего животные находились под наблюдением в течение 14 дней. Контрольным животным вводили эквиобъемное количество 2% крахмального раствора [5].
Противовоспалительная активность синтезированных соединений изучалась на модели острого воспалительного отека, вызванного субплантарным введением 0,1 мл 1% водного раствора каррагенина в заднюю лапу крыс. Вещества вводили перорально в дозе 50 мг/кг в виде взвеси в 2 % крахмальном растворе. О противовоспалительном действии судили по степени торможения отека (в %) в сравнении с контролем (2% крахмальная слизь). Препаратом сравнения являлся диклофенак, вводившийся в дозе 10 мг/кг [5].
Анальгетическую активность определяли на беспородных мышах обоего пола массой 16-22 г по методике термического раздражения «горячая пластинка». Исследуемые вещества вводили перорально в дозе 50 мг/кг в виде взвеси в 2% крахмальной слизи за 30 мин до помещения животных на горячую пластинку. Показателем болевой чувствительности служила длительность пребывания мышей на горячей пластинке до наступления первых признаков оборонительной реакции - облизывание или отдергивание задних лапок. Каждое соединение испытывали на 6 животных. В качестве препарата сравнения использовали метамизол натрия и диклофенак в дозе 50 мг/кг [5].
Изучение гипогликемического действия проводили на модели аллоксанового диабета. Опыты осуществлялись на белых нелинейных крысах обоего пола. Животных лишали пищи за 16 часов до опыта и на время его проведения. Экспериментальную гипергликемию моделировали внутрибрюшинным введением аллоксана тригидрата («Alfa Aesar®») в дозе 170 мг/кг. Концентрацию глюкозы в крови животных определяли глюкозооксидазным методом до введения исследуемых соединений, а также через 120 мин. после него. Степень гипогликемической активности соединений сравнивали с активностью метформина в дозе 50 мг/кг [5].
Противомикробную активность синтезированных соединений устанавливали методом двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде по отношению к тест-культурам микроорганизмов St. aureus АТСС 6538-Р и E. coli АТСС 25922. Микробная нагрузка составила 2,5 × 105 микробных тел/мл. Учет результатов проводили через 18-20 часов термостатирования при температуре 37ºС. Для всех исследуемых соединений определяли минимальные ингибирующие концентрации (МИК) в мкг/мл. В качестве растворителя соединений использовали ДМФА, препаратами сравнения служили хлоргексидин и диоксидин [5].
Результаты исследования и их обсуждение
В результате изучения острой токсичности производных бензо[d]тиазола установлено, что LD50 соединений IV, VII и XII составляет 5800, 3800, 4300 мг/кг соответственно и, согласно классификации опасности химической продукции, эти вещества можно отнести к 5 классу опасности [7].
Противовоспалительная активность была изучена у шести производных бензо[d]тиазола. Результаты in silico и in vivo приведены в таблице 1. Выявлено, что синтезированные соединения в экспериментальном опыте проявляют противовоспалительное действие различной степени выраженности. Обнаружены соединения I, IV и XVIII, обладающие активностью на уровне препарата сравнения диклофенака, что подтвердило результаты, полученные в программе PASS Online, но была предсказана лишь низкая вероятность нахождения данного фармакологического эффекта. При этом для соединения XX соотношение Pa/Pi было меньше 10. Однако, биологическое действие соединения на первом часу наблюдения сопоставимо с препаратом сравнения.
Таблица 1
Противовоспалительная активность производных бензо[d]тиазола
Шифр соединения |
Экспериментальное значение (торможение каррагенинового отека, %) |
Прогноз PASS |
||
1 час |
3 часа |
5 часов |
||
I |
53,5±2,9 |
38,2±2,0 |
38,5±2,8 |
+ |
IV |
38,8±3,2 |
62,4±3,8 |
55,7±3,1 |
+ |
XVII |
9,49 ± 10,64 |
21,53 ± 13,01 |
27,3 ± 11,44 |
+ |
XVIII |
21,4±1,8 |
56,98 ± 6,35 |
68,96 ± 13,53 |
+ |
XIX |
23,29 ± 4,92 |
51,6 ± 5,75 |
32,7 ± 7,84 |
+ |
XX |
64,3±2,3 |
41,4±3,1 |
30,5±2,3 |
- |
диклофенак |
40,7±4,5 |
66,2±4,7 |
60,6±4,3 |
+++ |
+++ - Pa/Pi≥100; ++ - 10 ≤ Pa/Pi< 100; + - 1 < Pa/Pi< 10.
Наличие анальгетической активности было исследовано у шести соединений. Полученные данные представлены в таблице 2. Компьютерным прогнозом установлено, что анальгетическое действие могут оказать только три изученных соединения. Тем не менее, выявлены экспериментальные данные о том, что все синтезированные производные бензо[d]тиазола обладают обезболивающим действием. Обнаружены соединения, сопоставимые по силе действия с препаратами сравнения.
Таблица 2
Анальгетическая активность производных бензо[d]тиазола
Шифр соединения |
Увеличение латентного периода оборонительного рефлекса через 30 мин / % |
Увеличение латентного периода оборонительного рефлекса через 60 мин / % |
Прогноз PASS |
I |
126,6 |
166,6 |
- |
II |
161,1 |
92,2 |
+ |
III |
111,9 |
128,8 |
- |
IV |
101,1 |
202,2 |
- |
V |
106,7 |
140,0 |
+ |
VII |
28,6 |
137,5 |
+ |
метамизол натрия |
145,5 |
180,0 |
+++ |
диклофенак |
133,3 |
153,3 |
+++ |
+++ - Pa/Pi≥100; ++ - 10 ≤ Pa/Pi< 100; + - 1 < Pa/Pi< 10.
Определение гипогликемической активности экспериментально осуществляли у 17 соединений. Результаты приведены в таблице 3. Нами обнаружено, что хелат XX оказывает выраженное гипогликемическое действие, а бромированные производные V-VII сопоставимы по силе действия с эффектом метформина. При этом in silico вероятность данной активности показана у всех изученных соединений, что может свидетельствовать о перспективности поиска данного вида биологического действия в ряду производных бензо[d]тиазола.
Таблица 3
Гипогликемическая активность производных бензо[d]тиазола
Шифр соединения |
% торможения гипергликемии через 120 мин |
Прогноз PASS |
I |
42,5±2,3 |
+ |
II |
11,7±2,8 |
+ |
III |
22,4±1,6 |
+ |
IV |
29,7±3,7 |
+ |
V |
49,3±1,3 |
+ |
VI |
48,8±2,0 |
+ |
VII |
57,6±2,6 |
+ |
VIII |
26,7±5,8 |
+ |
IX |
43,8±7,4 |
+ |
X |
41,5±2,3 |
+ |
XI |
37,7±4,4 |
+ |
XII |
48,3±3,8 |
+ |
XIII |
13,4±2,8 |
+ |
XIV |
25,3±1,7 |
+ |
XV |
20,4±3,6 |
+ |
XVI |
8,8±2,3 |
+ |
XX |
41,5±2,3 |
+ |
метформин |
54,5±2,9 |
+++ |
+++ - Pa/Pi≥100; ++ - 10 ≤ Pa/Pi< 100; + - 1 < Pa/Pi< 10.
В выборку для изучения антибактериального действия попало 31 производное. Установлено, что по программе PASS Online большинство соединений оказывают низкий антимикробный эффект. Однако в ходе эксперимента было выявлено, что производное IV, содержащее электроноакцепторный заместитель в арильном фрагменте, превышает по активности диоксидин в 31 и 16 раз соответственно для St. aureus и E. coli. При переходе к незамещенным, метил- и метоксизамещенным производным I, II, III происходит снижение противомикробного действия до уровня диоксидина. У бензо[d]тиазолиламидов V, VI наблюдается уменьшение противомикробной активности по сравнению с соединениями I, II, IV. В то же время, у амидов VII, VIII выявлена активность выше диоксидина. При этом установлено, что для всех соединений с соотношением Pa/Pi меньше 10 отмечается крайне низкая антибактериальная активность, что подтверждает эффективность использования программы PASS Online для предсказания данного вида активности.
Таблица 4
Противомикробная активность производных бензо[d]тиазола
Шифр соединения |
МИК, мкг/мл |
Прогноз PASS |
St. aureus / E/ coli |
||
I |
62,0/62,0 |
+ |
II |
62,0/500 |
+ |
III |
31,0/31,0 |
+ |
IV |
2,9/4,2 |
+ |
V |
125/125 |
++ |
VI |
250/250 |
++ |
VII |
31,0/31,0 |
++ |
VIII |
7,8/31,0 |
++ |
IX |
500/500 |
- |
X |
1000/1000 |
- |
XI |
1000/1000 |
- |
XII |
1000/1000 |
- |
XIII |
500/1000 |
- |
XIV |
1000/1000 |
- |
XV |
1000/1000 |
- |
XVI |
1000/1000 |
- |
XX |
500/1000 |
- |
XXI |
500/1000 |
- |
XXIII |
500/1000 |
- |
XXIII |
125/125 |
+ |
XXIV |
250/250 |
+ |
XXV |
250/250 |
+ |
XXVI |
125/1000 |
+ |
XXVII |
500/500 |
+ |
XXVIII |
500/500 |
+ |
XXIX |
500/1000 |
+ |
XXX |
250/250 |
+ |
XXXI |
1000/1000 |
+ |
XXXII |
1000/1000 |
+ |
XXXIII |
500/1000 |
+ |
XXXIV |
1000/1000 |
+ |
диоксидин |
62,0/62,0 |
++ |
хлоргексидин |
125/125 |
++ |
+++ - Pa/Pi≥100; ++ - 10 ≤ Pa/Pi< 100; + - 1 < Pa/Pi< 10.
Выводы
1. Исследована биологическая активность тридцати четырех производных бензо[d]тиазола в сравнении in vivo и in silico.
2. Выявлены экспериментально вещества I и IV, обладающие противовоспалительной, анальгетической и противомикробной активностью на уровне или выше препаратов сравнения.
3. В результате опытных исследований обнаружено соединение VII с гипогликемическим эффектом на уровне препарата сравнения. Вещество VIII проявляет противомикробную активность in vivo выше эффекта препаратов сравнения.
Рецензенты:
Молохова Е.И., д.ф.н., профессор, профессор кафедры промышленной технологии с курсом биотехнологии Пермской государственной фармацевтической академии, г. Пермь;
Яковлев И.Б., д.ф.н., профессор, заведующий кафедрой фармакологии Пермской государственной фармацевтической академии, г. Пермь.