Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

COMPARATIVE RESEARCH OF BIOLOICAL ACTIVITY OF BENZO[D]THIAZOLE DERIVATIVES IN VIVO AND IN SILICO

Lipatnikov K.V. 1 Sobin F.V. 1 Pulina N.A. 1 Yushkova T.A. 1 Krasnova A.I. 1 Dozmorova N.V. 1
1 Perm State Pharmaceutical Academy
The computer prediction of biological activity of new benzo[d]thiazole derivatives using software PASS Online was carried out. Promising compounds were selected for synthesis. The structure of obtained compounds was confirmed by IR, 1H NMR spectroscopy. Anti-inflammatory activity of the compounds was studied by the method of carrageenan edema. The analgesic effect was determined by thermal stimulus «hot plate». Study of hypoglycemic action was conducted using a model of alloxan diabetes. Antimicrobial activity was studied against test-microorganism cultures St. aureus ATCC 6538-P and E. coli ATCC 25922. Containing benzo[d]thiazole derivatives of 4-(het)aryl-2-hydroxy-4-oxobut-2-enoic acid with pharmacological effects at or above reference drugs with low toxicity were revealed. Some relationship «biological activity in silico - biological activity in vivo» was established.
benzo[d]thiazole derivatives
biological activity
computer prediction
Получение высокоэффективных и малотоксичных биологически активных органических соединений остается одним из приоритетных направлений развития фармацевтической науки в настоящее время. С учетом проводимой государственной политики импортозамещения к 2020 г. предполагается до 50% увеличить присутствие на фармацевтическом рынке отечественных инновационных лекарственных препаратов с оптимальным профилем безопасности. Одним из наиболее интенсивно развивающихся направлений деятельности ученых из различных стран является использование метода in silico для поиска и целенаправленного синтеза новых биологически активных соединений с заданными видами фармакологического действия.

Обширные исследования в области синтеза и определения биологической активности 4-(гет)арил-2-гидрокси-4-оксобут-2-еновых кислот остаются актуальными за счет наличия в исходной матрице кислоты нескольких реакционных центров, позволяющих вводить в структуру различные биологически активные фрагменты. В ряду данных производных ранее были получены запатентованные соединения, содержащие в своей структуре бензо[d]тиазол, обладающие противомикробной, противовоспалительной и гипогликемической активностью [2-4]. Известно, что данный фармакофор содержится в таких лекарственных препаратах, как рилузол, прамипексол, тиарамид, этоксозоламид. Кроме того, установлено, что производные, содержащие этот гетероцикл, обладают противовоспалительным, антимикробным, противовирусным, антигельминтным, противоопухолевым, противосудорожным и другими видами биологического действия [6,8-10]. Таким образом, представляет интерес проведение анализа результатов испытаний in silico и in vivo, а также выявление некоторых закономерностей «структура - биологическая активность» в ряду производных 4-(гет)арил-2-гидрокси-4-оксобут-2-еновых кислот, содержащих фрагмент бензо[d]тиазола.

Целью работы является сравнительное исследование данных, полученных в программе PASS Online, с результатами фармакологического скрининга новых производных бензо[d]тиазола.

Материалы и методы исследования

На предварительном этапе компьютерный прогноз биологической активности был осуществлен для 89 запланированных к синтезу химических соединений, содержащих в структуре фрагмент бензо[d]тиазола. Критериями оценки степени активности в системе PASS Online служили вероятность проявления активности Pa, а также отношение вероятности проявления активности к вероятности ее отсутствия Pa/Pi [1]. Лишь соединения, предположительно обладающие одним из доступных к изучению видов активности (противовоспалительная, анальгетическая, гипогликемическая, противомикробная), были включены в работу. Таким образом, к синтезу было предложено 34 соединения, установлена их тонкая структура, определены физико-химические, а также спектральные характеристики методами ИК-, ЯМР1Н-спектроскопии. Для проведения фармакологического скрининга полученным соединениям присвоены условные шифры от I до XXXIV.

Острая токсичность наиболее активных соединений изучали на белых нелинейных мышах обоего пола массой 18-22 г с определением LD50 по методу Першина Г.Н. Каждое соединение испытывали на 6 животных. Соединения вводили перорально в виде взвеси в 2% крахмальном растворе однократно, после чего животные находились под наблюдением в течение 14 дней. Контрольным животным вводили эквиобъемное количество 2% крахмального раствора [5].

Противовоспалительная активность синтезированных соединений изучалась на модели острого воспалительного отека, вызванного субплантарным введением 0,1 мл 1% водного раствора каррагенина в заднюю лапу крыс. Вещества вводили перорально в дозе 50 мг/кг в виде взвеси в 2 % крахмальном растворе. О противовоспалительном действии судили по степени торможения отека (в %) в сравнении с контролем (2% крахмальная слизь). Препаратом сравнения являлся диклофенак, вводившийся в дозе 10 мг/кг [5].

Анальгетическую активность определяли на беспородных мышах обоего пола массой 16-22 г по методике термического раздражения «горячая пластинка». Исследуемые вещества вводили перорально в дозе 50 мг/кг в виде взвеси в 2% крахмальной слизи за 30 мин до помещения животных на горячую пластинку. Показателем болевой чувствительности служила длительность пребывания мышей на горячей пластинке до наступления первых признаков оборонительной реакции - облизывание или отдергивание задних лапок. Каждое соединение испытывали на 6 животных. В качестве препарата сравнения использовали метамизол натрия и диклофенак в дозе 50 мг/кг [5].

Изучение гипогликемического действия проводили на модели аллоксанового диабета. Опыты осуществлялись на белых нелинейных крысах обоего пола. Животных лишали пищи за 16 часов до опыта и на время его проведения. Экспериментальную гипергликемию моделировали внутрибрюшинным введением аллоксана тригидрата («Alfa Aesar®») в дозе 170 мг/кг. Концентрацию глюкозы в крови животных определяли глюкозооксидазным методом до введения исследуемых соединений, а также через 120 мин. после него. Степень гипогликемической активности соединений сравнивали с активностью метформина в дозе 50 мг/кг [5].

Противомикробную активность синтезированных соединений устанавливали методом двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде по отношению к тест-культурам микроорганизмов St. aureus АТСС 6538-Р и E. coli АТСС 25922. Микробная нагрузка составила 2,5 × 105 микробных тел/мл. Учет результатов проводили через 18-20 часов термостатирования при температуре 37ºС. Для всех исследуемых соединений определяли минимальные ингибирующие концентрации (МИК) в мкг/мл. В качестве растворителя соединений использовали ДМФА, препаратами сравнения служили хлоргексидин и диоксидин [5].

Результаты исследования и их обсуждение

В результате изучения острой токсичности производных бензо[d]тиазола установлено, что LD50 соединений IV, VII и XII составляет 5800, 3800, 4300 мг/кг соответственно и, согласно классификации опасности химической продукции, эти вещества можно отнести к 5 классу опасности [7].

Противовоспалительная активность была изучена у шести производных бензо[d]тиазола. Результаты in silico и in vivo приведены в таблице 1. Выявлено, что синтезированные соединения в экспериментальном опыте проявляют противовоспалительное действие различной степени выраженности. Обнаружены соединения I, IV и XVIII, обладающие активностью на уровне препарата сравнения диклофенака, что подтвердило результаты, полученные в программе PASS Online, но была предсказана лишь низкая вероятность нахождения данного фармакологического эффекта. При этом для соединения XX соотношение Pa/Pi было меньше 10. Однако, биологическое действие соединения на первом часу наблюдения сопоставимо с препаратом сравнения.

Таблица 1

Противовоспалительная активность производных бензо[d]тиазола

Шифр соединения

Экспериментальное значение (торможение каррагенинового отека, %)

Прогноз PASS

1 час

3 часа

5 часов

I

53,5±2,9

38,2±2,0

38,5±2,8

+

IV

38,8±3,2

62,4±3,8

55,7±3,1

+

XVII

9,49 ± 10,64

21,53 ± 13,01

27,3 ± 11,44

+

XVIII

21,4±1,8

56,98 ± 6,35

68,96 ± 13,53

+

XIX

23,29 ± 4,92

51,6 ± 5,75

32,7 ± 7,84

+

XX

64,3±2,3

41,4±3,1

30,5±2,3

-

диклофенак

40,7±4,5

66,2±4,7

60,6±4,3

+++

+++ - Pa/Pi≥100; ++ - 10 ≤ Pa/Pi< 100; + - 1 < Pa/Pi< 10.

Наличие анальгетической активности было исследовано у шести соединений. Полученные данные представлены в таблице 2. Компьютерным прогнозом установлено, что анальгетическое действие могут оказать только три изученных соединения. Тем не менее, выявлены экспериментальные данные о том, что все синтезированные производные бензо[d]тиазола обладают обезболивающим действием. Обнаружены соединения, сопоставимые по силе действия с препаратами сравнения.

Таблица 2

Анальгетическая активность производных бензо[d]тиазола

Шифр соединения

Увеличение латентного периода оборонительного рефлекса через 30 мин / %

Увеличение латентного периода оборонительного рефлекса через 60 мин / %

Прогноз PASS

I

126,6

166,6

-

II

161,1

92,2

+

III

111,9

128,8

-

IV

101,1

202,2

-

V

106,7

140,0

+

VII

28,6

137,5

+

метамизол натрия

145,5

180,0

+++

диклофенак

133,3

153,3

+++

+++ - Pa/Pi≥100; ++ - 10 ≤ Pa/Pi< 100; + - 1 < Pa/Pi< 10.

Определение гипогликемической активности экспериментально осуществляли у 17 соединений. Результаты приведены в таблице 3. Нами обнаружено, что хелат XX оказывает выраженное гипогликемическое действие, а бромированные производные V-VII сопоставимы по силе действия с эффектом метформина. При этом in silico вероятность данной активности показана у всех изученных соединений, что может свидетельствовать о перспективности поиска данного вида биологического действия в ряду производных бензо[d]тиазола.

Таблица 3

Гипогликемическая активность производных бензо[d]тиазола

Шифр соединения

% торможения гипергликемии через 120 мин

Прогноз PASS

I

42,5±2,3

+

II

11,7±2,8

+

III

22,4±1,6

+

IV

29,7±3,7

+

V

49,3±1,3

+

VI

48,8±2,0

+

VII

57,6±2,6

+

VIII

26,7±5,8

+

IX

43,8±7,4

+

X

41,5±2,3

+

XI

37,7±4,4

+

XII

48,3±3,8

+

XIII

13,4±2,8

+

XIV

25,3±1,7

+

XV

20,4±3,6

+

XVI

8,8±2,3

+

XX

41,5±2,3

+

метформин

54,5±2,9

+++

+++ - Pa/Pi≥100; ++ - 10 ≤ Pa/Pi< 100; + - 1 < Pa/Pi< 10.

В выборку для изучения антибактериального действия попало 31 производное. Установлено, что по программе PASS Online большинство соединений оказывают низкий антимикробный эффект. Однако в ходе эксперимента было выявлено, что производное IV, содержащее электроноакцепторный заместитель в арильном фрагменте, превышает по активности диоксидин в 31 и 16 раз соответственно для St. aureus и E. coli. При переходе к незамещенным, метил- и метоксизамещенным производным I, II, III происходит снижение противомикробного действия до уровня диоксидина. У бензо[d]тиазолиламидов V, VI наблюдается уменьшение противомикробной активности по сравнению с соединениями I, II, IV. В то же время, у амидов VII, VIII выявлена активность выше диоксидина. При этом установлено, что для всех соединений с соотношением Pa/Pi меньше 10 отмечается крайне низкая антибактериальная активность, что подтверждает эффективность использования программы PASS Online для предсказания данного вида активности.

Таблица 4

Противомикробная активность производных бензо[d]тиазола

Шифр соединения

МИК, мкг/мл

Прогноз PASS

St. aureus / E/ coli

I

62,0/62,0

+

II

62,0/500

+

III

31,0/31,0

+

IV

2,9/4,2

+

V

125/125

++

VI

250/250

++

VII

31,0/31,0

++

VIII

7,8/31,0

++

IX

500/500

-

X

1000/1000

-

XI

1000/1000

-

XII

1000/1000

-

XIII

500/1000

-

XIV

1000/1000

-

XV

1000/1000

-

XVI

1000/1000

-

XX

500/1000

-

XXI

500/1000

-

XXIII

500/1000

-

XXIII

125/125

+

XXIV

250/250

+

XXV

250/250

+

XXVI

125/1000

+

XXVII

500/500

+

XXVIII

500/500

+

XXIX

500/1000

+

XXX

250/250

+

XXXI

1000/1000

+

XXXII

1000/1000

+

XXXIII

500/1000

+

XXXIV

1000/1000

+

диоксидин

62,0/62,0

++

хлоргексидин

125/125

++

+++ - Pa/Pi≥100; ++ - 10 ≤ Pa/Pi< 100; + - 1 < Pa/Pi< 10.

Выводы

1. Исследована биологическая активность тридцати четырех производных бензо[d]тиазола в сравнении in vivo и in silico.

2. Выявлены экспериментально вещества I и IV, обладающие противовоспалительной, анальгетической и противомикробной активностью на уровне или выше препаратов сравнения.

3. В результате опытных исследований обнаружено соединение VII с гипогликемическим эффектом на уровне препарата сравнения. Вещество VIII проявляет противомикробную активность in vivo выше эффекта препаратов сравнения.

Рецензенты:

Молохова Е.И., д.ф.н., профессор, профессор кафедры промышленной технологии с курсом биотехнологии Пермской государственной фармацевтической академии, г. Пермь;

Яковлев И.Б., д.ф.н., профессор, заведующий кафедрой фармакологии Пермской государственной фармацевтической академии, г. Пермь.