Актуальной задачей современной профилактической медицины является использование достижений молекулярной биологии и генетики для оценки риска развития и предупреждения массовых социально значимых заболеваний [2].
К генам, контролирующим тип иммунного ответа, резистентность или чувствительность к инфекции, предрасположенность к разным формам течения инфекционных заболеваний и их осложнений, относят в первую очередь гены цитокинов [8]. Отдельные аллельные варианты генов могут быть ассоциированы с уровнем продукции соответствующего белкового продукта, что непосредственно оказывает влияние на характер течения и исход заболевания [9].
Омская область на протяжении ряда лет характеризовалась значительной распространенностью таких актуальных социально значимых заболеваний, как ВИЧ-инфекция, туберкулез, вирусный гепатит С, онкологические заболевания, в клиническом течении и исходе которых важную роль играют гены цитокинов [6, 10].
Цель исследования
Оценка распространенности аллельных вариантов и генотипов промоторных регионов генов иммунного ответа IL 2, IL4, IL10, TNF А у взрослого населения Омской области.
Материалы и методы
Контингент обследованных лиц включал 100 неродственных жителей г. Омска и Омской области европеоидного происхождения (75 мужчин и 25 женщин) в возрасте от 19 до 60 лет, средний возраст обследуемых составил 37,5 ± 2,3 лет. От всех участников было получено добровольное информированное согласие на участие в исследовании в соответствии с требованиями Локального этического комитета ГБОУ ВПО ОмГМУ от 30.01.2015 г. № 66.
Выделение ДНК из лейкоцитов цельной крови проводилось с помощью реагента «ДНК-экспресс-кровь» в соответствии с инструкцией производителя (НПФ «Литех, Россия).
Полиморфизмы генов исследованы методом SNP (single nucleotide polymorphism) с использованием комплекта реагентов для выявления мутаций (полиморфизмов) в геноме человека тест-системы «SNP – экспресс» (НПФ «Литех», Россия).
Исследовано четыре полиморфных варианта промоторных регионов генов цитокинов – интерлейкина 2 – IL-2 -330 T > G, интерлекина 4 — IL4 -590С>Т, интерлейкина 10 – IL 10 —592С> А, фактора некроза опухоли альфа TNF-А- 308G>A (табл. 1).
Таблица 1
Характеристика полиморфных вариантов изучаемых генов
|
Ген |
Кодируемый цитокин |
Полиморфный локус |
dbSNP_rs* |
генотип |
|
TNFА |
Фактор некроза опухоли альфа |
‐308G>A |
rs 1800629 |
GG, GA, AA |
|
IL 2 |
Интерлейкин 2 |
- 330T> G |
rs 2069762 |
TT, TG, GG |
|
IL 4 |
Интерлейкин 4 |
-590С>Т |
rs 2243250 |
CC, CT, TT |
|
IL 10 |
Интерлейкин 10 |
-592С> А |
rs 1800872 |
CC , CA, AA |
* Идентификационный номер SNP в международной базе NCBI dbSNP [12]
Генотипирование образцов геномной ДНК проводилось при помощи аллель-специфической полимеразной цепной реакции в режиме реального времени на амплификаторе «iQ5» (BioRad, США) на базе ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых инфекций Роспотребнадзора».
Частота отдельных генотипов определялась как отношение индивидов, несущих генотип, к общему числу обследованных в группе по формуле: f =n/N, где n – количество раз встречаемости генотипа, N – численность обследованных.
Частоты генотипов по исследованным локусам были проверены на соответствие равновесию Харди—Вайнберга при помощи точного теста Фишера (рHWЕ). Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием пакета программ Statistica 6.0 (StatSoft), MS Excel (Microsoft). Во всех процедурах статистического анализа критический уровень значимости р принимался равным или меньше 0,05.
Результаты и обсуждение
В ходе исследования была определена распространенность аллелей и генотипов генов цитокинов (табл. 2)
Таблица 2
Характеристика распределения генотипов анализируемых генов иммунного ответа в исследуемой популяционной группе
|
Полимор-физм |
Аллели |
Генотипы |
Гетерозиготность |
рHWЕ |
|||
|
наблюда-емая |
ожидаемая |
||||||
|
вариант |
частота аллеля |
вариант |
частота генотипа |
||||
|
TNFА ‐308G>A |
G
A |
0,685
0,135 |
GG GA AA |
0,730 0,270 0,00 |
0,270 |
0,236 |
0,139 |
|
IL 2 - 330 G > Т |
G
T |
0,755
0,245 |
GG GT TT |
0,630 0,250 0,120 |
0,250 |
0,369 |
0,001* |
|
IL 4 -590T>С |
C
T |
0,845
0,155 |
CC CT TT |
0,700 0,290 0,010 |
0,290 |
0,262 |
0,349 |
|
IL10 - 592С> А |
C
A |
0,780
0,220 |
CC CA AA |
0,600 0,360 0,040 |
0,360 |
0,343 |
0,667 |
*отклонения от равновесия Харди—Вайнберга
Фактор некроза опухоли альфа TNF-А – белок, синтезируемый активированными макрофагами, участвует в противовирусном, противоопухолевом и трансплантационном иммунитете. Полиморфизм гена TNF-А ‐308G>A включает в себя замену гуанина (G) на аденин (А) и связан с увеличением уровней экспрессии TNF-А. В патогенезе ВИЧ-инфекции TNF-А играет отрицательную роль, так как способствует дальнейшему инфицированию иммунокомпетентных клеток, а также вирусной репликации. Фактор некроза опухоли альфа индуцирует гибель неинфицированных Т-лимфоцитов CD4+ и CD8+ по механизму апоптоза, что обеспечивает прогрессирование иммунодефицита [3]. TNF-А- 308 GА полиморфизм связан с повышенным риском гепатоцеллюлярной карциномы (как неблагоприятного исхода хронического вирусного гепатита В и С), которая занимает в мире третье место среди причин смерти от онкологических заболеваний [12].
Частота аллеля А гена TNFА у обследованных лиц Омской области составила 0,135 (табл. 2).
Полиморфизмы гена IL2, связанного с продукцией интерлейкина 2, используют в качестве маркера неблагоприятных исходов инфекционных и онкологических заболеваний. Интерлейкин 2 – белок, кодируемый геном IL2, который играет центральную роль в регуляции клеточного иммунитета. IL-2 участвует в усилении пролиферации активированных В-клеток в присутствии IL-4, является фактором роста для всех популяций Тh-лимфоцитов, которые принимают активное участие в противоопухолевом, противовирусном и антибактериальных ответах [4]. Установлена связь между полиморфизмом гена IL2- 330 G > Т и клиническим исходом заболевания вирусными гепатитами В и С. Генотип IL2-330 ТТ ассоциирован с повышенным риском хронизации вирусных гепатитов В и С, более тяжелым течением и частым развитием цирроза, тогда как генотип IL2-330 GG ассоциирован с наиболее благоприятными исходами заболевания [16]. Наличие одного или двух G 330 аллелей IL2 в 1,4 раза повышало риск развития рака молочной железы в китайской популяции [14], тогда как в популяции европеоидов достоверно повышена частота Т 330 аллеля IL-2, ассоциированная с раком молочной железы, тела и шейки матки с метастазированием в регионарные лимфатические узлы [1].
У обследованных лиц в Омской области частота аллеля G составила 0,245.
Интерлейкин 4, кодируемый геном IL-4, является одним из основных цитокинов, секретируемых Th2 клетками, подавляет продукцию цитокинов воспаления (TNFА, IL-1, IL-8, IL-2, INFγ). При варианте -590 T уровень продукции интерлейкина 4 повышен, что, в частности, приводит к угнетению клеточного иммунитета и повышению уровня IgE.
Т-аллель 590 IL-4 регулирует экспрессию корецепторов ССR5 и СХСR4, используемых вирусом иммунодефицита человека для проникновения в клетку человека, снижает уровень ССR5 и повышает уровень СХСR4 на поверхности CD 4+ клеток, редуцирует репликацию штаммов R5 и усиливает репликацию штаммов X4. Мутантный аллель IL-4-590T, который чаще встречается у ВИЧ-негативных лиц, имеет протективный эффект при передаче инфекции при гетеросексуальном контакте и замедляет прогрессирование ВИЧ-инфекции [17]. Распространенность мутантного аллеля T гена IL-4-590 в исследуемой группе составила 0,155.
Интерлейкин 10 играет основную роль в регуляции воспалительного и иммунного ответов, являясь продуктом Th2 клеток. IL-10 ингибирует синтез ряда цитокинов, продуцируемых Th1, таких как IFNγ, IL-2, TNFА. Мутантный аллель А гена IL-10 -592 ассоциирован с уменьшением продукции IL-10, c усилением репликации ВИЧ и значительным ускорением прогрессирования ВИЧ-инфекции [5]. Аллель А IL-10- 592С> А может быть фактором риска туберкулеза у европейцев [15, 18]. В исследуемой популяции европеоидов Омской области частота встречаемости С аллеля IL-10 составила 0,780, А аллеля – 0,220.
Анализ гендерного распределения частот встречаемости мутантных аллелей генов цитокинов в данном исследовании показал наличие статистически значимых различий полиморфизма гена TNFА. Полиморфный вариант rs 1800629 гена TNFА среди мужчин встречался чаще, чем среди женщин: 16,0±5,6 % и 6,0±3,6% соответственно (р=0,04; рис. 1).
Рис. 1. Распространенность мутантных аллелей изучаемых генов у мужчин и женщин, участвовавших в исследовании (на 100 обследованных)
SNP полиморфизмы одних и тех же генов у разных этнических групп могут быть как протективными, так и ассоциированными с заболеваниями, что важно учитывать при региональном изучении распространенности аллельных вариантов, их ассоциированности с риском заболеваний [7].
Рис. 2. Распределение частот генов иммунного ответа в мировой популяции (международная база данных Ensembl, http://www.ensembl.org/, 2015 г.)
На рисунке 2 представлены частоты встречаемости генотипов генов иммунного ответа в мировой популяции по данным международной базы данных Ensemb (проект «1000 Genomes» [11]).
При сопоставлении частотного распределения SNP генов изучаемых цитокинов у жителей Омской области и среднемировых соотношений аллелей в популяциях мира выявлены статистически значимые различия частот полиморфных вариантов rs 1800629 гена TNFА (0,135 и 0,09; р=0,01), rs 2243250 гена IL-4 (0,155 и 0,470; р=0,000), rs 1800872 гена IL-10 (0,220 и 0,435; р=0,000).
Выводы
В данном исследовании нами была определена распространенность полиморфизмов генов иммунного ответа – про- и противовоспалительных цитокинов, которая составила для полиморфного варианта rs 1800629 гена TNF-А — 0,135, для rs 2069762 гена IL- 2 — 0,245, для rs 2243250 гена IL-4 – 0,155, rs1800872 гена IL-10 – 0,220. Полученные данные представляют интерес для дальнейшего изучения ассоциации полиморфизмов генов цитокинов с различными вариантами клинического течения и исходов актуальных социально значимых мультифакториальных заболеваний.
Работа выполнена при поддержке внутривузовского гранта (ВГ-21-2014) ГБОУ ВПО Омский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Рецензенты:
Чеснокова М.Г., д.м.н., профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО ОмГМУ Минздрава России, г. Омск;
Аксютина Л.П., д.м.н., врач-методист КУЗОО «Специализированная детская туберкулезная клиническая больница», г. Омск.