Химическая промышленность играет исключительно важную роль в обеспечении жизненных потребностей общества. Одним из важных веществ, получаемых на производстве, является дихлорэтан (ДХЭ), сфера применения которого с каждым годом расширяется. Метаболизм ДХЭ протекает весьма интенсивно и происходит в печени, корковом и мозговом слое почек, легких, селезенке, желудочно-кишечном тракте, коже, при этом образуются более токсичные продукты. Способ введения ДХЭ, как показали многочисленные наблюдения, не оказывает существенного влияния на распределение его метаболитов [3, 4]. При сохраняющейся высокой летальности от острых интоксикаций ДХЭ основную массу составляют патологические состояния, наблюдаемые при длительном поступлении токсиканта в организм. При длительном контакте ДХЭ оказывает комплексное токсическое воздействие на организм, вызывая поражение печени, почек, нервной, костной, сердечно-сосудистой, гастроинтестинальной систем, оказывает канцерогенное, мутагенное и тератогенное действие [9].
Важным патогенетическим звеном токсического действия дихлорэтана на организм являются активация процессов свободно-радикального окисления и изменение мембранных структур, что ведет к нарушению липид-липидных и липид-белковых взаимодействий [12]. Известна значимость окислительного стресса как важного фактора развития воспалительных процессов, но остается недостаточно изученной взаимосвязь активности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и угнетения антиоксидантной защиты с активацией синтеза цитокинов, обладающих провоспалительным потенциалом при хронической интоксикации ДХЭ. Продукты свободно-радикального окисления оказывают повреждающее действие на мембраны гепатоцитов, нарушая течение процессов детоксикации, влияют на выработку цитокинов. В ранее выполненных нами исследованиях установлена активация окислительного стресса в слизистой тонкого кишечника при хронической интоксикации ДХЭ, которая способствует транслокации эндотоксина из кишечника в системный кровоток [11]. Под влиянием эндотоксина возникает интенсивная продукция макрофагами ИЛ-1, ФНО-α, супероксидного анион-радикала [16]. Усилению выработки цитокинов способствуют нарушение метаболизма, функциональной активности и состояние мембран гепатоцитов.
В этой связи целью исследования явилось изучение взаимосвязи показателей цитокинового статуса и биохимических маркеров оксидантного стресса как звеньев системной воспалительной реакции при хронической интоксикации ДХЭ.
Материалы и методы исследования
Эксперименты выполнены на 30 здоровых половозрелых неинбредных белых крысах-самцах массой 180-220 г, разделенных на 4 группы: 1-я - контрольная (n=6), 2-я, 3-я и 4-я - животные с моделированной интоксикацией дихлорэтаном (n=8 в каждой группе) соответственно на 15-е, 30-е и 60-е сутки исследования. Эксперименты проводились в соответствии с требованиями приказов №1179 МЗ СССР от 10.10.83 г., № 267 МЗ РФ от 19.06.03 г. «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных», «Правила по обращению, содержанию, обезболиванию и умерщвлению экспериментальных животных». Хроническая интоксикация дихлорэтаном достигалась ежедневным энтеральным введением токсиканта в растворе оливкового масла в дозе 5 мг/кг (0,01 LD 50) в течение 60 суток. Контрольные животные получали внутрижелудочно равный объем оливкового масла. Объектом исследования служили эритроциты, сыворотка и плазма крови. Тестирование осуществляли на 15-е, 30-е и 60-е сутки.
Состояние ПОЛ оценивали по концентрации диеновых конъюгатов и малонового диальдегида (МДА). Содержание диеновых конъюгатов (ДК) определяли методом прямой спектрофотометрии. Принцип метода заключается в выделении нативных жирных кислот путем экстракции смесью равных объемов гептана и изопропанола с последующим измерением оптической плотности проб при длине волны 232 нм, что отражает содержание диеновых конъюгатов [2]. Для определения малонового диальдегида использовали метод M. Mihara (1980), заключающийся в образовании окрашенного комплекса при взаимодействии продуктов ПОЛ с тиобарбитуровой кислотой, с помощью стандартного набора фирмы Агат-Мед (Россия). Одновременно с процессами ПОЛ регистрировали активность ферментов каталазы [8], супероксиддисмутазы [10], глюкозо-6- фосфатдегидрогеназы [15]. Систему водорастворимых антиоксидантов оценивали, определяя содержание церулоплазмина в плазме крови, учитывая его способность окислять p-фенилендиамин с образованием окрашенного комплекса и определяя содержание восстановленного глутатиона в эритроцитах, учитывая его способность реагировать с избытком аллоксана с образованием соединения, имеющего максимум поглощения при длине волны 305 нм, применяя методики, изложенные в руководстве по биохимическим методам исследования.
Компоненты цитокинового статуса оценивали по концентрации в сыворотке крови провоспалительных и противовоспалительных цитокинов: ФНО-α, ИЛ-1β, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-1РА, определение которых проводили методом, основанным на твердофазном «сендвич»-варианте иммуноферментативного анализа с использованием наборов реагентов фирмы «Вектор-бест» (Россия).
Обработку полученных результатов проводили с применением методов вариационной статистики. После проверки нормальности распределения изучаемых параметров в сравниваемых группах определяли средние величины (М), ошибку средних величин (m) при соответствии распределения признака закону нормального с расчетом сравнения групп показателей по t-критерию Стьюдента. Минимальный уровень статистически значимости различий верифицировали при р<0,05. Взаимосвязь признаков оценивали с помощью корреляционного анализа по Спирмену. Математическую обработку выполняли на компьютере с применением стандартных пакетов программы Statistica 6.0 и программного обеспечения Microsoft Excel.
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты наших исследований представлены в таблице 1, из которой видно, что ДХЭ, введенный по указанной схеме, повышает активность свободно-радикального окисления, что подтверждается увеличением концентрации в эритроцитах продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов - в 1,94 раза (р<0,05) к 60-м суткам и МДА в 2,01 раза (р<0,05) и в 1,49 раз (р<0,05) от нормальных показателей к 30-м и 60-м суткам соответственно. Важную роль в регуляции процессов ПОЛ играют антиоксидантные ферменты, такие как супероксиддисмутаза (СОД) и каталаза. СОД катализирует реакцию взаимодействия двух супероксидных радикалов, играющих важную роль в инициации свободно-радикального окисления, с образованием перекиси водорода и молекулярного кислорода. Проведенные исследования установили повышение активности СОД в эритроцитах на 33,86% (р<0,05) к 30-м суткам и на 97,9 % (р<0,05) к 60-м суткам, что свидетельствует о мобилизации защитно-приспособительных механизмов, связанных с избыточной продукцией супероксидного анион-радикала. Избыточная активность СОД ведет к повышенному образованию перекиси водорода. В свою очередь перекись водорода может быть использована фагоцитами для синтеза гипохлорита, либо диффундировать в клетки и разрушаться там каталазой и глутатионпероксидазой, либо в присутствии железа разрушаться с образованием гидроксильного радикала. Активность каталазы к 30-м суткам эксперимента увеличивается на 56,7% (р<0,05), однако к 60-м суткам на фоне возросшей активности СОД активность каталазы увеличивается незначительно, что может быть связано с повышенной концентрацией водородных ионов, приводящих к возникновению протонированной формы фермента, обладающего измененной каталитической активностью.
Таблица 1
Показатели перекисного окисления липидов и состояние антиоксидантной защиты в крови крыс при хронической интоксикации дихлорэтаном (M±m)
|
Показатель |
Животные 1-й группы (n=8) |
Животные 3-й группы (n=8) |
Животные 4-й группы (n=8) |
|
ДК, (λ=232нм) усл. ед. на 1мл крови |
1,78±0,17 |
3,47±0,24* |
3,45±0,27* |
|
МДА, мкмоль на литр плазмы |
3,1±0,18 |
6,23±0,6* |
4,62±0,35*^ |
|
Каталаза, ммоль в мин на 1 мг гемоглобина |
92,87±5,96 |
145,48±7,05* |
114,3±6,95*^ |
|
СОД, усл. ед. на 1 мг гемоглобина |
1,89±0,13 |
2,53±0,2* |
3,74±0,23*^ |
|
Г6ФДГ, нмоль в мин на 1мг гемоглобина |
14,25±0,22 |
12,11±0,46* |
12,2±0,44* |
|
Глутатион восстановленный, мкмоль на мл крови |
2,6±0,16 |
1,9±0,17* |
1,74±0,16* |
|
Церулоплазмин, мг% |
16,2±0,45 |
29,58±3,9* |
41,37±1,79*^ |
Примечание: * - достоверно (p<0,05) по сравнению с первой (контрольной) группой;
^ - достоверно (р<0,05) 4-й группы по сравнению со 3-й группой
В проведенном исследовании установлено снижение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) на 15,0% (р<0,05) и 14,4% (р<0,05), а также содержание восстановленного глутатиона на 27,0% (р<0,05) и 33,1% (р<0,05) соответственно на 30-е и 60-е сутки эксперимента. Глутатион участвует как в индуцированной глутатионпероксидазной реакции, так и в поддержании восстановленного состояния сульфгидрильных групп белковых молекул, редокс-статуса клетки в целом. Соотношение окисленных и восстановленных форм глутатионовой системы зависит от скорости реакции пентозного цикла, ключевым ферментом которого является Г6ФДГ. Выявленные изменения со стороны глутатионопосредованной детоксикации значительно снижают резистентность клеток к цитоповреждающему действию продуктов ПОЛ, свободных радикалов. В системе неферментативного звена антиоксидантной защиты биологических молекул важная роль принадлежит церулоплазмину (ЦП), представляющему собой медьсодержащий гликопротеид α2-глобулиновой фракции сыворотки крови, синтезируемый главным образом в печени. В результате проведенных исследований установлено повышение содержания церулоплазмина на 82,6% (р<0,05) и на 155,4% (р<0,05) соответственно к 30-м и 60-м суткам . Известно, что уровень ЦП возрастает при воспалительных процессах, что отражает его роль в организме в качестве белка острой фазы, в значительной мере его противовоспалительное действие обусловлено антиоксидантными свойствами. ЦП обладает способностью к дисмутации супероксидных радикалов, а также окисляет Fe+2 до Fe+3 кислородов в плазме крови без образования свободных радикалов. Таким образом, в ходе проведенных исследований при хронической интоксикации ДХЭ выявлена активация свободно-радикального окисления на фоне дисбаланса антиоксидантной системы.
Изучение цитокинового профиля, как следует из данных таблицы 2, показало, что хроническая интоксикация ДХЭ сопровождается изменением баланса между провоспалительными и противовоспалительными цитокинами. Установлено, что на 15-е сутки хронической интоксикации ДХЭ содержание ИЛ-1β значительно не изменялось, что можно связать с активацией адаптационно-компенсаторных процессов и увеличением уровня кортизола, снижающего биологическую активность ИЛ-1β [6, 7]. Однако на 30-е сутки на фоне возрастания содержания липополисахарида в крови [11] уровень ИЛ-1β увеличился на 16,7% (р>0,05). Следует отметить незначительное изменение в содержании данного цитокина в эти сроки и снижение его концентрации к 60-м суткам эксперимента на 15,2% (р>0,05) относительно контроля. Возможным объяснением полученных нами результатов является увеличение синтеза специфических рецепторов-ловушек - IL-1Ra, которые связывают белок ИЛ-1β и препятствуют проявлению его биологической активности. Содержание противовоспалительного цитокина IL-1Ra в сыворотке крови крыс достоверно увеличивается к 60-м суткам интоксикации ДХЭ на 23% (p<0,05).
Таблица 2
Концентрация сывороточных цитокинов у крыс при хронической интоксикации дихлорэтаном (M±m)
|
Показатель |
Животные 1-й группы (n=8) |
Животные 2-й группы(n=8) |
Животные 3-й группы(n=8) |
Животные 4-й группы(n=8) |
|
ФНО-α, пг/мл |
2,55± 0,28 |
2,71±0,44 |
4,48±0,51* |
3,35±0,4 |
|
ИЛ-1β, пг/мл |
6,76±0,64 |
7,89±0,95 |
8,35±0,97 |
5,73±0,76 |
|
ИЛ-4, пг/мл |
10,94±0,99 |
9,2 ±0,85 |
7,33±0,7* |
6,08±0,63* |
|
ИЛ-6, пг/мл |
3,85±0,18 |
4,35±0,29 |
2,88±0,17* |
5,54±0,34* |
|
ИЛ-1РА, пг/мл |
667,5±39,3 |
680,6±54,1 |
755,6±50,2 |
929,1±65,2* |
Примечание: * - достоверно (p<0,05) по сравнению с первой (контрольной) группой
В нашей работе показано, что ДХЭ, введенный по указанной схеме, вызывает разнонаправленные изменения концентрации ИЛ-6 в сыворотке периферической крови у крыс. На 15-е сутки повышение концентрации ИЛ-6 на 13,0% (р>0,05) , по всей видимости, связано с воспалительным ответом печени и легких, в которых активировался белок stat 3 - один из 6 белков - активаторов транскрипции [14]. К 30-м суткам наблюдается снижение синтеза ИЛ-6 на 25,2% (р<0,05) , что можно связать с токсическим действием ДХЭ на макрофаги, Т-клетки и лимфоидные дендритные клетки, что согласуется с данными, полученными другими авторами [5]. На 60-е сутки хронической интоксикации ДХЭ концентрация ИЛ-6 возрастает на 43,9% (р<0,05) относительно контроля; усиленная продукция данного цитокина, по всей видимости, связана с максимальным повышением уровня липополисахарида в крови в эти сроки и повреждением эндотелиальных клеток [11]. Известно, что ИЛ-6 индуцирует синтез белков острой фазы гепатоцитами, а также стимулирует секрецию адренокортикотропного гормона. В данном, а также в ранее проведенном исследовании установлено повышение концентрации церулоплазмина и уровня адренокортикотропного гормона (АКТГ) в плазме крови крыс на 60-е сутки эксперимента. Наряду с провоспалительными эффектами для ИЛ-6 характерны и противовоспалительные эффекты, опосредованные синтезом и секрецией антагонистов провоспалительных цитокинов Ил-1Ra и sФНОp55, которые ингибируют продукцию ИЛ-1 β и ФНО-a [13].
В нашем исследовании значительное накопление провоспалительного цитокина ФНО-а в сыворотке периферической крови наблюдалось к 30-м суткам хронической интоксикации ДХЭ. Главным индуктором синтеза ФНО-a считается липополисахарид. В ранее проведенных исследованиях нами установлено повышение уровня ЛПС в крови у крыс при хронической интоксикации ДХЭ к 30-м суткам [11]. К 60-м суткам эксперимента концентрация ФНО-a, несмотря на высокий уровень ЛПС в крови, снизилась относительно 30-х суток, но оставалась выше контроля на 31,4% (р<0,05). ИЛ-6 ингибирует продукцию ИЛ-1β и ФНО-а, которые являются индукторами синтеза ИЛ-6 [13]. Возможно, высокий уровень ИЛ-6 к 60-м суткам хронической интоксикации ДХЭ можно рассматривать как компенсаторно-приспособительный механизм, направленный на уменьшение продукции ФНО-a. Уменьшение в крови под влиянием ДХЭ противовоспалительного цитокина ИЛ-4, наиболее выраженное к 60-е суткам эксперимента, свидетельствует о снижении его синтеза Т-лимфоцитами вследствие их поражения ДХЭ, что согласуется с работами других авторов [1, 5]. Известно, что ИЛ-4 ограничивает синтез макрофагами ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, ФНО-a, образование высокоактивных метаболитов кислорода, азота. Вышеизложенное свидетельствует о дисбалансе цитокиновой системы и преобладании провоспалительного потенциала.
Учитывая, что основной задачей настоящего исследования было выявление взаимосвязи между изучаемыми процессами, нами проведен корреляционный анализ полученных данных. В результате обнаружен ряд зависимостей, подтверждающих системный характер изменений, происходящих у крыс при хронической интоксикации ДХЭ к 60-м суткам эксперимента. К наиболее значимым можно отнести следующие взаимосвязи: прямые зависимости между концентрацией ИЛ-6 и содержанием церулоплазмина (r=+0,75, Р=0,032) и активностью СОД (r=+0,673, Р=0,067), между концентрацией ФНО-a и содержанием МДА (r=+0,856, Р=0,007) и обратные корреляционные связи между концентрацией ИЛ-4 и содержанием ДК (r=-0,799 Р=0,017) и активностью СОД (r=-0,641, Р=0,087). Указанные корреляции свидетельствуют о взаимосвязи между активацией процессов ПОЛ и развитием системного воспаления в механизмах развития интоксикации при длительном ведении ДХЭ.
Заключение
Таким образом, обобщая полученные результаты, следует отметить, что у крыс при хронической интоксикации ДХЭ активируются процессы ПОЛ на фоне дисбаланса в антиоксидантной системе и в содержании цитокинов в крови с преобладанием провоспалительного потенциала. Наличие корреляционных зависимостей между показателями, отражающими активность процессов ПОЛ и воспалительного процесса, позволяет сделать заключение о взаимосвязи между ними в патогенезе хронической интоксикации ДХЭ.
Рецензенты:
Миннебаев М.М., д.м.н., профессор кафедры патофизиологии ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет», г. Казань;
Фролов Б.А., д.м.н., профессор, зав. кафедрой патофизиологии ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия», г. Оренбург.