Пермским НПО «Биомед» совместно с НИИВС им. Мечникова РАМН по оригинальной технологии получен из осадка Б - отхода производства антистафилококкового иммуноглобулина человека препарат «Стафилолейкин» на основе антигенспецифичных цитокинов, представляющих собой комплекс низкомолекулярных (5 - 8 кД) белков [1].
Целью настоящего исследования является лабораторно-экспериментальная оценка эффективности и безопасности препарата «Стафилолейкин».
Материалы и методы
Экспериментально-производственные серии «Стафилолейкина» получены на базе Пермского НПО "Биомед".
Экспериментальные исследования нового препарата в системе in vivo выполнены на 250 белых беспородных мышах массой 18-20 г, 240 морских свинках массой 240-260 г.
За основу дизайна доклинического исследования были взяты рекомендации действующих методических документов [6, 7]. Эксперименты проведены в соответствии с этическими нормами и рекомендациями по гуманизации работы с лабораторными животными, отраженными в «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей».
Специфическую активность «Стафилолейкина» исследовали в тесте in vivo по переносу гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), регистрируемому в реакции зависимой конгломерации лейкоцитов мышей со стафилококковым белком А (СБА). Активность «Стафилолейкина» выражали величиной дозы в мкг, или единицах активности, введение которой мышам в 100 раз снижает пороговую концентрацию СБА (Д100), вызывающую конгломерацию циркулирующих лейкоцитов, в сравнении с эффектом введения неспецифического иммуностимулятора - натрия нуклеината. За единицу активности по аналогии с коммерческим цитокиновым препаратом «Аффинолейкин» принимали дозу, равную 50 мкг.
Миелостимулирующую активность «Стафилолейкина» (способность вызывать активацию лейкопоэза), выражающуюся увеличением степени спонтанной конгломерации лейкоцитов (лейкергии), определяли на мышах одновременно с оценкой специфической активности путем дополнительного сопоставления протокольных данных о числе клеток, образующих максимальные лейкоцитарные агломераты в «толстых каплях» крови.
Одним из необходимых показателей безопасности препарата является оценка его провоспалительной активности. Исследования проводили на мышах одновременно с оценкой специфической активности. Осматривали место инъекции препарата, подкожную клетчатку передней стенки живота и паховых областей, сосуды и лимфоузлы, расположенные под фасцией, выстилающей подкожную клетчатку изнутри, с целью выявления признаков воспаления: отек тканей, гиперемия и увеличение регионарных лимфоузлов.
Для изучения острой токсичности препарат вводили морским свинкам однократно подкожно по 0,5 мл с содержанием 14 человеческих доз (1 доза соответствует 1 единице активности) или 565 доз для морской свинки. Белым беспородным мышам «Стафилолейкин» вводили внутривенно (в хвостовую вену) 2,14 человеческих дозы - 565 доз для мыши. При изучении хронической токсичности препарат вводили в течение 20 дней внутримышечно морским свинкам по 1,4 человеческой дозы ежедневно (суммарно 1129 доз в пересчете на вес животного) и белым мышам по 0,214 человеческой дозы ежедневно (суммарно 1126 доз в пересчете на вес животного). В контрольной группе вводили в том же количестве изотонический раствор натрия хлорида. Наблюдение за животными при изучении острой токсичности вели в течение 14 суток, при хронической - в течение 34 суток. Ежедневно регистрировали следующие показатели: гибель животных, их вес, наличие или отсутствие клинических симптомов интоксикации.
Через 24 часа, 7 суток и 14 суток после введения препарата в опытах острой и хронической токсичности по 10 морских свинок (5 самцов и 5 самок) и 10 белых беспородных мышей (5 самцов и 5 самок) из опытной и контрольной групп подвергали эвтаназии. Патоморфологическое изучение включало макроскопическое и гистологическое исследование внутренних органов. Для проведения гистологических исследований фиксировали следующие органы: головной мозг, сердце, печень, селезенка, почки, надпочечники, тимус, лимфатические узлы (паховый, брыжеечный).
Статистическую обработку результатов проводили с использованием методов описательной статистики. Для оценки значимости межгрупповых различий использовали парный и непарный t-критерий Стьюдента, различия или показатели связи считались значимыми при р<0,05, а также медианы и 95 %-е доверительные интервалы. В работе использовали пакеты статистических программ MS Excel, «DIASTA» (МГУ, Россия).
Результаты
В сравнительных исследованиях установлено, что «Стафилолейкин» индуцирует более выраженный клеточный иммунитет, чем коммерческий полиспецифичный «Аффинолейкин» (таб. 1).
Таблица 1
Результаты определения Д100 «Стафилолейкина» и «Аффинолейкина» в реакции конгломерации мышиных лейкоцитов с СБА, по сравнению с нуклеинатом натрия
|
Д100 «Стафилолейкин» мкг/мышь |
Д100 «Аффинолейкин» мкг/мышь |
|
6 (4 ÷ 32)* |
12 (2 ÷ 16)* |
*Медиана и 95 % доверительный интервал по Ван дер Вардену.
В ходе исследования специфической активности также было установлено, что «Стафилолейкин» не вызывает провоспалительной реакции и не обладает миелостимулирующим действием.
Одним из важнейших этапов лабораторно-экспериментальных исследований нового препарата является изучение острой и хронической токсичности. Было установлено, что введение «Стафилолейкина» не вызвало падения массы тела животных и не тормозило её физиологическое увеличение с возрастом. Ни одно животное не погибло, и не было замечено каких-либо симптомов интоксикации. Более того, ежедневное введение препарата Стафилолейкин в течение 20 дней не только не привело к замедлению физиологического нарастания веса животных, но и в группе самок вызвало тенденцию к ускорению привеса в последнюю неделю наблюдения. При вскрытии через сутки после введения препарата внутренние органы мышей и морских свинок визуально были обычного цвета (что свидетельствовало о нормальном кровенаполнении) и эластичной консистенции. Поверхность печени, почек и селезёнки была гладкой. При осмотре брюшной полости и брыжейки не было замечено петехиальных кровоизлияний. Гистологическое исследование лёгких морских свинок, использованных в опытах острой токсичности, выявило незначительное полнокровие и очаговые утолщения межальвеолярных перегородок со слабо выраженной полинуклеарной инфильтрацией. В селезёнке отмечено умеренное полнокровие красной пульпы и увеличение числа мегакариоцитов. В тимусе, сердце, печени и почках, а также в месте введения препарата каких-либо патологических изменений не обнаружено.
При вскрытии в поздние сроки органы животных выглядели нормально. Отмеченные ранее изменения на срезах лёгких и селезёнки морских свинок не наблюдались. В тимусе, сердце, печени, почках и в месте введения препарата каких-либо патологических изменений также не выявлено.
В опытах моделирования стафилококкового гнойного кератита на кроликах после развития одинаково выраженного в опытной и контрольных группах воспаления с образованием инфильтрата в строме роговицы в опытной группе в коньюктивальный мешок ежедневно инстиллировали «Стафилолейкин», а в контрольной - изотонический раствор натрия хлорида. Было установлено, что «Стафилолейкин» на неделю, по сравнению с контролем, ускорял заживление стафилококкового гнойного кератита при значимом различии балльных оценок.
Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что «Стафилолейкин» индуцирует противостафилококковый клеточный иммунитет, не проявляет ни острой, ни хронической токсичности, не вызывает провоспалительной и миелостимулирующей реакции, способствует излечению стафилококкового гнойного кератита у кроликов. Результаты доклинических исследований можно рассматривать как предпосылку для клинических испытаний нового препарата при иммунотерапии хронической, устойчивой к антибиотикам, очаговой и септической стафилококковой инфекции.
Рецензенты:
Фельдблюм И.В., д.м.н., профессор, заведующая кафедрой эпидемиологии с курсом гигиены и эпидемиологии ФДПО, ГБОУ ВПО «Пермский государственный медицинский университет им. академика Е.А. Вагнера», г. Пермь;
Маслов Ю.Н., д.м.н., профессор кафедры микробиологии и вирусологии, ГБОУ ВПО «Пермский государственный медицинский университет им. академика Е.А. Вагнера», г. Пермь.