Сетевое издание
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

ДОКЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ НОВОГО ПРЕПАРАТА «СТАФИЛОЛЕЙКИН»

Афанасьева Т.М. 1 Мац А.Н. 2 Петровских В.П. 1 Николаева А.М. 1
1 Филиал ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России в г. Пермь «Пермское НПО «Биомед»
2 ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН
Проведены доклинические исследования специфического цитокинового препарата «Стафилолейкин», полученного по оригинальной технологии из отходов производства антистафилококкового иммуноглобулина человека. Специфическая активность препарата изучена в тесте переноса гиперчувствительности замедленного типа, регистрируемого с помощью реакции конгломерации мышиных лейкоцитов в присутствии стафилококкового белка А. Установлено, что «Стафилолейкин» индуцирует противостафилококковый клеточный иммунитет, не вызывает провоспалительной реакции и не обладает миелостимулирующим действием. При изучении острой и хронической токсичности препарата на морских свинках и белых мышах не было выявлено каких-либо признаков интоксикации у животных. Показана перспективность использования «Стафилолейкина» для лечения язвенных поражений роговицы на модели стафилококкового стромального гнойного кератита у кроликов. Доклинические испытания обосновывают возможность применения препарата «Стафилолейкин» в качестве лечебно-профилактического средства.
острая и хроническая токсичность
перенос гиперчувствительности замедленного типа к стафилококковому белку А
антигенспецифичные цитокины
1. Афанасьева Т.М. Технология получения препарата «Стафилолейкин» из осадка «Б» – отхода производства антистафилококкового донорского иммуноглобулина / Т.М. Афанасьева, В.П. Петровских, А.М. Николаева, А.В. Казьянин, А.Н. Мац // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. – 2012. – Т. 8, №1. – С. 27-32.
2. Бухвальд З. Местный специфический иммунный ответ на белок А Staphylococcus aureus в лимфоидной ткани миндалин человека / З. Бухвальд, Н.П. Перепечкина, В.Ф. Салов, А.Н. Мац // Журн. микробиол. – 1985. – № 5. – С. 78.
3. Мац А.Н. Концепция низкомолекулярных антигенспецифичных цитокинов и её новые практические приложения / А.Н. Мац, М.Н. Боков, М.Н. Кузьмина // Аллергология и иммунология. – 2008. – Т. 9, № 4. – С. 444 –447.
4. Мац А.Н. «Трансфер-фактор» – это N-концевая часть «протомера» растворимого Т-клеточного антигенсвязывающего белка // Аллергология и иммунология. – 2005. – Т. 6, № 2. – С. 140–143.
5. Мокроносова М. А. Staphylococcus aureus в патогенезе атопического дерматита : сб. тр. межд. симп. / Аллерговакцинация: новые стратегии и перспективы». 24–27 ноября 2002. – Сочи, 2002. – С.72-80.
6. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармацевтических веществ Минздрава РФ / под общей редакцией чл.-корр. РАМН, профессора Р.У. Хабриева. – М., 2005. – 832 с.
7. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (Иммунобиологические лекарственные препараты). Ч. 2. – М.: Гриф и К, 2012. – 536 с.
8. Borkowsky W. Deletion of antigen-specific activity from leukocyte dialysates containing transfer factor by antigen-coated polystyrene / W. Borkowsky, H.S. Lawrence // J. Immunol. – 1981. – Vol. 126, No. 2. – P. 486–489.
9. Brummer E, Foster LG, Bhardwaj N, Lawrence H – In: Immunoregulators in transfer factor. – N.Y., 1979. – P. 27–39.
10. Watkins R.R., David M.Z., Salata R.A. Current concepts on the virulence mechanisms of meticillin-resistant Staphylococcus aureus / R.R. Watkins, M.Z. David, R.A. Salata // J. Med. Microbiol. – 2012. – Vol. 61. – P. 1179-1193.
Staphylococcus aureus вызывает гнойно-воспалительные заболевания различной локализации от легких до генерализированных форм. В настоящее время существующие методы терапии данной инфекции зачастую себя не оправдывают. Это связано с появлением устойчивости возбудителя к антибиотикам и недостаточной эффективностью общепринятой иммунотерапии с использованием иммуноглобулиновых препаратов, которые имеют ограниченный потенциал, прежде всего, в силу низкой пенетрантности полномерных антител из сосудистого русла в ткани [10]. Кроме того, эффективный противостафилококковый иммунный ответ в большей степени основан на механизмах клеточного иммунитета, чем на функциях антител, поскольку для S. aureus характерно как вне -, так и внутриклеточное паразитирование [2, 9]. Отдельными наблюдениями было показано, что восстановление утраченного противостафилококкового клеточного иммунитета может быть достигнуто с помощью антигенспецифичных цитокинов [3, 4, 6, 8].

Пермским НПО «Биомед» совместно с НИИВС им. Мечникова РАМН по  оригинальной технологии получен из осадка Б - отхода производства антистафилококкового иммуноглобулина человека препарат «Стафилолейкин» на основе антигенспецифичных цитокинов, представляющих собой  комплекс низкомолекулярных (5 - 8 кД) белков [1].

Целью настоящего исследования является лабораторно-экспериментальная оценка эффективности и безопасности препарата «Стафилолейкин».

Материалы и методы

Экспериментально-производственные серии «Стафилолейкина» получены на базе Пермского НПО "Биомед".

Экспериментальные исследования нового препарата  в системе in vivo выполнены на 250 белых беспородных мышах массой 18-20 г, 240 морских свинках массой 240-260 г.

За основу дизайна доклинического исследования были взяты рекомендации действующих методических документов [6, 7]. Эксперименты проведены в соответствии с этическими нормами и рекомендациями по гуманизации работы с лабораторными животными, отраженными в «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей».

Специфическую активность «Стафилолейкина» исследовали в тесте in vivo по переносу гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), регистрируемому в реакции зависимой конгломерации лейкоцитов мышей со стафилококковым белком А (СБА). Активность «Стафилолейкина» выражали величиной дозы в мкг, или единицах активности, введение которой мышам в 100 раз снижает пороговую концентрацию СБА (Д100), вызывающую конгломерацию циркулирующих лейкоцитов, в сравнении с эффектом введения неспецифического иммуностимулятора - натрия нуклеината. За единицу активности по аналогии с коммерческим цитокиновым препаратом «Аффинолейкин» принимали дозу, равную 50 мкг.

Миелостимулирующую активность «Стафилолейкина» (способность вызывать активацию лейкопоэза), выражающуюся увеличением степени спонтанной конгломерации лейкоцитов (лейкергии), определяли на мышах одновременно с оценкой специфической активности путем дополнительного сопоставления протокольных данных о числе клеток, образующих максимальные лейкоцитарные агломераты в «толстых каплях» крови.

Одним из необходимых показателей безопасности препарата является оценка его провоспалительной активности. Исследования проводили на мышах одновременно с оценкой специфической активности. Осматривали место инъекции препарата, подкожную клетчатку передней стенки живота и паховых областей, сосуды и лимфоузлы, расположенные под фасцией, выстилающей подкожную клетчатку изнутри, с целью выявления признаков воспаления: отек тканей, гиперемия и увеличение регионарных лимфоузлов.

Для изучения острой токсичности препарат вводили морским свинкам однократно подкожно по 0,5 мл с содержанием 14 человеческих доз (1 доза соответствует 1 единице активности) или 565 доз для морской свинки. Белым беспородным мышам «Стафилолейкин» вводили внутривенно (в хвостовую вену) 2,14 человеческих дозы - 565 доз для мыши. При изучении хронической токсичности препарат вводили в течение 20 дней внутримышечно морским свинкам по 1,4 человеческой дозы ежедневно (суммарно 1129 доз в пересчете на вес животного) и белым мышам по 0,214 человеческой дозы ежедневно (суммарно 1126 доз в пересчете на вес животного). В контрольной группе вводили в том же количестве изотонический раствор натрия хлорида. Наблюдение за животными при изучении острой токсичности вели в течение 14 суток, при хронической - в течение 34 суток. Ежедневно регистрировали следующие показатели: гибель животных, их вес, наличие или отсутствие клинических симптомов интоксикации.

Через 24 часа, 7 суток и 14 суток после введения препарата в опытах острой и хронической токсичности по 10 морских свинок (5 самцов и 5 самок) и 10 белых беспородных мышей (5 самцов и 5 самок) из опытной и контрольной групп подвергали эвтаназии. Патоморфологическое изучение включало макроскопическое и гистологическое исследование внутренних органов. Для проведения гистологических исследований фиксировали следующие органы: головной мозг, сердце, печень, селезенка, почки, надпочечники, тимус, лимфатические узлы (паховый, брыжеечный).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием методов описательной статистики. Для оценки значимости межгрупповых различий использовали парный и непарный t-критерий Стьюдента, различия или показатели связи считались значимыми при р<0,05, а также медианы и 95 %-е доверительные интервалы. В работе использовали пакеты статистических программ MS Excel, «DIASTA» (МГУ, Россия).

Результаты

В сравнительных исследованиях установлено, что «Стафилолейкин» индуцирует более выраженный клеточный иммунитет, чем коммерческий полиспецифичный «Аффинолейкин» (таб. 1).

Таблица 1

Результаты определения Д100 «Стафилолейкина» и «Аффинолейкина» в реакции конгломерации мышиных лейкоцитов с СБА, по сравнению с нуклеинатом натрия

Д100  «Стафилолейкин» мкг/мышь

Д100  «Аффинолейкин» мкг/мышь

6 (4 ÷ 32)*

12 (2  ÷ 16)*

*Медиана и 95 % доверительный интервал по Ван дер Вардену.

В ходе исследования специфической активности также было установлено, что «Стафилолейкин» не вызывает провоспалительной реакции и не обладает миелостимулирующим действием.

Одним из важнейших этапов лабораторно-экспериментальных исследований нового препарата является изучение острой и хронической токсичности. Было установлено, что введение «Стафилолейкина» не вызвало падения массы тела животных и не тормозило её физиологическое увеличение с возрастом. Ни одно животное не погибло, и не было замечено каких-либо симптомов интоксикации. Более того, ежедневное введение препарата Стафилолейкин в течение 20 дней не только не привело к замедлению физиологического нарастания веса животных, но и в группе самок вызвало тенденцию к ускорению привеса в последнюю неделю наблюдения. При вскрытии через сутки после введения препарата внутренние органы мышей и морских свинок визуально были обычного цвета (что свидетельствовало о нормальном кровенаполнении) и эластичной консистенции. Поверхность печени, почек и селезёнки была гладкой. При осмотре брюшной полости и брыжейки не было замечено петехиальных кровоизлияний. Гистологическое исследование лёгких морских свинок, использованных в опытах острой токсичности, выявило незначительное полнокровие и очаговые утолщения межальвеолярных перегородок со слабо выраженной полинуклеарной инфильтрацией. В селезёнке отмечено умеренное полнокровие красной пульпы и увеличение числа мегакариоцитов. В тимусе, сердце, печени и почках, а также в месте введения препарата каких-либо патологических изменений не обнаружено.

При вскрытии в поздние сроки органы животных выглядели нормально. Отмеченные ранее изменения на срезах лёгких и селезёнки морских свинок не наблюдались. В тимусе, сердце, печени, почках и в месте введения препарата каких-либо патологических изменений также не выявлено.

В опытах моделирования стафилококкового гнойного кератита на кроликах после развития одинаково выраженного в опытной и контрольных группах воспаления с образованием инфильтрата в строме роговицы в опытной группе в коньюктивальный мешок ежедневно инстиллировали «Стафилолейкин», а в контрольной - изотонический раствор натрия хлорида. Было установлено, что «Стафилолейкин» на неделю, по сравнению с контролем, ускорял заживление стафилококкового гнойного кератита при значимом различии балльных оценок.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что «Стафилолейкин» индуцирует противостафилококковый клеточный иммунитет, не проявляет ни острой, ни хронической токсичности, не вызывает провоспалительной и миелостимулирующей реакции, способствует излечению стафилококкового гнойного кератита у кроликов. Результаты доклинических исследований можно рассматривать как предпосылку для клинических испытаний нового препарата при иммунотерапии хронической, устойчивой к антибиотикам, очаговой и септической стафилококковой инфекции.

Рецензенты:

Фельдблюм И.В., д.м.н.,  профессор, заведующая кафедрой эпидемиологии с курсом гигиены и эпидемиологии ФДПО, ГБОУ ВПО «Пермский государственный медицинский университет им. академика Е.А. Вагнера», г. Пермь;

Маслов Ю.Н., д.м.н., профессор кафедры микробиологии и вирусологии, ГБОУ ВПО «Пермский государственный медицинский университет им. академика Е.А. Вагнера», г. Пермь.


Библиографическая ссылка

Афанасьева Т.М., Мац А.Н., Петровских В.П., Николаева А.М. ДОКЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ НОВОГО ПРЕПАРАТА «СТАФИЛОЛЕЙКИН» // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 5. ;
URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=21513 (дата обращения: 21.09.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074