Несмотря на достигнутые успехи в лечении пациентов с сахарным диабетом (СД), диабетическая нефропатия по-прежнему остаётся одной из основных причин заболеваемости и смертности пациентов с сахарным диабетом [1], как и десятилетие назад [5], принося национальной системе здравоохранения значительные социально-экономические потери [4]. Являясь самостоятельной лидирующей причиной терминальной стадии хронической болезни почек в большинстве стран мира, диабетическая нефропатия (ДН), трактуемая с 2007 г. как диабетическая болезнь почек [3], с течением времени развивается по меньшей мере у трети пациентов с СД [13] и в своём классическом течении проходит прогрессию от стадии нормоальбуминурии через микроальбуминурию до макроальбуминурии / протеинурии и снижения скорости клубочковой фильтрации (СКФ) [34]. Важным с точки зрения понимания патофизиологических механизмов возникновения и прогрессирования ДН и разработки профилактических и лечебных подходов является использование адекватных моделей ДН у экспериментальных животных, максимально точно воспроизводящих стадии естественного течения этого микрососудистого осложнения СД у людей.
Типы моделей сахарного диабета у экспериментальных животных
Поскольку для возникновения ДН необходимо наличие гипергликемии (о чём свидетельствует отсутствие подобных почечных изменений у пациентов без СД), в основе воспроизведения ДН как при СД 1 типа, так и при СД 2 типа у экспериментальных животных лежит индукция гипергликемического состояния.
Существует множество моделей спонтанного развития у грызунов СД 1 типа (биобридинговые, LETL, WBN/Kob крысы, NOD-мыши и др.) и 2 типа (крысы и мыши с дефектом синтеза лептина или лептинового рецептора и др.), полученные в результате передаваемых по наследству генетических мутаций или отобранные из аутбредных животных без диабета (например, крысы Goto-Kakizaki, мыши Tsumara Suzuki и др.) [7, 10]. СД может быть вызван хирургическим путём (посредством частичной или тотальной панкреатэктомии, классическим примером которой является эксперимент О. Минковского и Й. Меринга на собаках [8], фармакологическими препаратами (вызывающими деструкцию секретирующих инсулин бета-клеток поджелудочной железы [30]), посредством использования методов генной инженерии (технологии «нокаута» и трансгенной гиперэкспрессии специфических генов [7]), назначением специальных диетических рационов [6, 35], а также различными вариантами их сочетания.
Тем не менее, несмотря на довольно обширный выбор моделей СД у животных, во многих экспериментальных лабораториях для моделирования осложнений заболевания, в т.ч. ДН, используется введение диабетогенного цитотоксина стрептозотоцина (СТЗ) [43].
Механизм диабетогенного действия стрептозотоцина
Стрептозотоцин является токсическим соединением из группы производных нитрозомочевины, связанным в С2 положении с D-глюкозой [29], избирательно проникающим в панкреатические бета-клетки посредством переносчика GLUT-2 [28]. Панкреатотоксичность СТЗ в значительной мере связывают с алкилирующей активностью его метильной группы, приводящей к фрагментации ДНК бета-клеток, в ответ на которую активируется участвующий в репарации повреждённой ДНК фермент поли (АДФ-рибоза) полимераза (PARP). Развивающийся в связи с этим дефицит запасов кофактора NAD+, а затем и энергетических субстратов в виде АТФ, неминуемо приводит, в конечном счёте, к некрозу бета-клеток [44]. Данный процесс усугубляется активацией свободнорадикального окисления, связанного с генерацией пероксинитрита из избыточно образующегося оксида азота, донатором которого является нитрозогруппа СТЗ [39].
Диабетогенный эффект СТЗ наблюдается у многих видов животных, включая мышей, собак, кошек, обезьян, морских свинок и др. Наиболее резистентными к действию СТЗ оказались кролики и свиньи, а максимальная сенсибилизация выявлена у крыс, при этом оптимальная диабетогенная доза СТЗ для крысы уменьшается по мере увеличение массы животного. [18, 22, 33] Также отмечено, что особи мужского пола при сопоставимой дозе развивают более выраженную гипергликемию [32].
Технология приготовления цитратного буфера и раствора стрептозотоцина
Порошок стрептозотоцина, который до использования должен храниться в защищённом от света пластиковом флаконе с осушителем при температуре -20° С, растворяют в натриевом цитратном буфере с pH 4,5. Для приготовления раствора цитратного буфера с требуемым pH 4,5 необходимо: 1) смешать 47 мл 0,1 М раствора лимонной кислоты (содержит 21,01 г/л моногидрата лимонной кислоты) и 53 мл 0,1 М раствора тринатриевой соли лимонной кислоты (содержит 29,41 г/л дигидрата тринатриевой соли); 2) довести содержимое раствора до 950-970 мл дистиллированной водой, перемешать мешалкой; 3) аккуратно довести объём раствора до 1000 мл, параллельно измеряя рН-метром pH получившегося раствора. 4) Если рН раствора выше 4,5, добавить несколько капель 0,1 М раствора лимонной кислоты (2,1 гр цитрата довести до объёма 10 мл), или добавить несколько капель водного раствора цитрата натрия, если pH ниже 4,5 [9]. Рекомендовано использовать свежеприготовленный или оттаянный после замораживания при -20° С буфер, порошок СТЗ должен быть растворён в светонепроницаемой стеклянной ёмкости и введён экспериментальному животному внутривенно или внутрибрюшинно в максимально ближайшие сроки.
Негенетические модели диабетической нефропатии, воспроизводимые с помощью стрептозотоцина
На текущий момент лишь в некоторых генетических моделях ДН у грызунов описаны изменения, более-менее соответствующие всем критериям идеальной модели этого осложнения [41, 46], приведённым на официальном сайте Американского консорциума по моделям диабетических осложнений у животных (AMDCC) [16]. Тем не менее, значительные ограничения в использовании этих моделей, связанные с их высокой стоимостью, трудностями в воспроизведении, сложностями ухода, высокой степенью инбридинга и, зачастую, моногенным характером наследования СД [36], диктуют необходимость разработки, апробации и совершенствования негенетических моделей ДН у экспериментальных животных.
По данным проведённого обзора литературы, негенетические модели ДН наиболее часто воспроизводят с использованием СТЗ, вводимого аутбредным крысам. В зависимости от применяемой в эксперименте дозы цитотоксина и путей введения (внутрибрюшинно, внутривенно) у грызунов возможно моделирование различных по степени выраженности состояний углеводного обмена – от лёгких, преддиабетических изменений, до СД с абсолютной инсулиновой недостаточностью [25, 27]. При этом в большинстве используемых стрептозотоциновых моделей как СД 2 типа с умеренной гипергликемией, так и СД 1 типа с выраженной гипергликемией у крыс описывают лабораторные и морфологические признаки, характерные для ранних стадий классического течения ДН у людей [20], с не более чем 30-кратным повышением уровня альбуминурии. Однако, важность изучения патогенеза ДН и возможностей её коррекции и профилактики именно на ранних, морфофункционально обратимых стадиях, только увеличивает ценность достаточно легко воспроизводимых и относительно незатратных негенетических моделей ДН у крыс.
Моделирование диабетической нефропатии при стрептозотоциновом сахарном диабете 1 типа у крыс
Модели ДН у аутбредных крыс со стрептозотоциновым СД наиболее часто воспроизводят на самцах крыс стоков Wistar и Sprague-Dawley, при этом для моделирования СД 1 типа половозрелым крысам в возрасте 8-10 нед. (масса 200-250 г) внутривенно вводится СТЗ, растворённый в цитратной буфере (в дозировке 60 мг/кг и 55 мг/кг, соответственно). [14, 40]. Считается, что интраперитонеальный путь ведения требует большей дозы СТЗ. СТЗ вводится после 12-16 ч голода, поскольку введение препарата накормленным особям приводит к уменьшению диабетогенного эффекта СТЗ и может вызвать большой разброс экспериментальных данных из-за снижения восприимчивости животных к СТЗ на фоне постпрандиального повышения гликемии [23]. Принимая во внимание данные о возникновении выраженной отсроченной гипогликемии (вследствие временной «утечки» инсулина из разрушенных бета-клеток), возникающей через 4-8 ч после инъекции СТЗ [30], в течение 24-48 ч экспериментальные животные получают перорально 5 % раствор глюкозы. СД подтверждается при выявлении натощакового уровня гликемии выше 15 ммоль/л спустя 48 ч после инъекции СТЗ [40].
Через 8 нед. после возникновения СД наблюдается 3-4-кратное увеличение альбуминурии с одновременным снижением СКФ в 1,5 раза от первоначального, сопровождающееся появлением тубулоинтерстициального фиброза и 1,5-кратным увеличением толщины гломерулярной базальной мембраны (по данным электронной микроскопии) [26]. Длительность эксперимента в данном случае ограничивается развитием метаболических нарушений вследствие выраженной гипергликемии (более 30 ммоль/л) и инсулинопении.
С целью коррекции кетоацидоза рекомендовано назначение инсулинотерапии. Предпочтительнее применять непрерывное его введение с помощью пластыря или помпы, позволяющее добиться среднесуточного уровня глюкозы крови, близкого к нормогликемии [42]. Возможно ежедневное подкожное введение инсулина длительного действия в дозе 1-4 ед., приводящее к снижению гипергликемии до умеренных цифр (11,1-22,2 ммоль/л), что позволяет увеличить продолжительность исследования до 5-8 мес. [15, 24, 40,42]. При этом важно учитывать описанное в литературе снижение стойкого диабетогенного эффекта СТЗ, введённого в дозе 40-50 мг/кг, приводящее к спонтанной нормализации инсулин-секреторной функции при назначении инсулинотерапии в первую неделю после индукции СД [17].
Для ускорения наступления специфических диабетических изменений в почечной ткани используют хирургическую редукцию массы функционирующих нефронов. С этой целью крысам предварительно (за 3 нед. до инъекции СТЗ) производят правостороннюю нефрэктомию. В таком случае начальные признаки ДН выявляются уже в течение первого месяца после манифестации диабета, проявляющиеся гиперфильтрацией [15], значимое повышение АД отмечается на 8-й неделе, а после 8 мес. диабетического статуса – более чем 30-кратное повышение уровня экскреции альбумина с мочой относительно исходных данных, а также морфологические признаки диабетического гломерулосклероза различной степени выраженности [15, 40].
Тем не менее, данная стрептозотоциновая модель СД 1 типа у крыс имеет ряд существенных недостатков, ограничивающих её широкое использование с экспериментальной целью. Однократное введение СТЗ в высокой дозе приводит к возникновению выраженной инсулинопении и быстрой декомпенсации течения заболевания у крыс, что не позволяет проводить длительные хронические эксперименты на таких животных без введения инсулина, что существенно ограничивает её применение при исследовании сахароснижающих препаратов. Кроме того, СТЗ в высокой дозе, действуя через имеющийся в эпителиоцитах почечных канальцев вышеупомянутый глюкозный транспортёр GLUT 2, непосредственно вызывает повреждение ДНК клеток тубулярного эпителия, сохраняющееся до 4-х нед. после введения препарата [29], что необходимо учитывать при планировании длительности эксперимента и времени определения маркеров повреждения почек.
Моделирование диабетической нефропатии при стрептозотоциновом сахарном диабете 2 типа у крыс
Существенным недостатком модели ДН при стрептозотоциновом СД 1 типа является недостаточная её валидность при исследовании лекарственных средств для лечения СД 2 типа. К тому же отсутствует возможность наравне с гипергликемией оценить вклад таких серьёзных патогенетических компонентов СД 2 типа и ДН, как инсулинорезистентность, ожирение и дислипидемия. В связи с чем в экспериментальной диабетологии были разработаны несколько негенетических моделей ДН при СД 2 типа, воспроизводимого с использованием СТЗ у крыс.
Так, относительно недавно стали применяться модели геминефрэктомированных крыс с алиментарным ожирением (вызванным назначением высокожирового питания) и индукцией диабета посредством одно- или двукратного введения c недельным интервалом субдиабетических доз СТЗ (30-35 мг/кг) [21, 37]. СД 2 типа диагностируют спустя 1 нед после инъекции СТЗ посредством проведения орального глюкозотолерантного теста, в процессе которого крысам измеряют уровень гликемии натощак и через 30, 60, 90 и 120 мин. после внутрижелудочного введения 40% раствора глюкозы в дозе 3 г/кг, и уровне гликемии от 9,0 до 14,0 ммоль/л. При этом авторы описывают развитие лабораторных и морфологических признаков поздних стадий ДН на 35-40 нед эксперимента (протеинурия, снижение СКФ, диффузный гломерулосклероз). Интересно отметить, что выраженность морфологических диабетических изменений в группе крыс, получавших высокожировое питание и двукратную инъекцию СТЗ, несмотря на умеренную гипергликемию оказалась значимо выше по сравнению с крысами с СД 1 типа [45]. Однако в пилотных исследованиях по отработке обозначенной методики нам не удалось зафиксировать пороговую для СД 2 типа гипергликемию у крыс (при введении рекомендуемой в этих работах низкой дозы СТЗ (30 мг/кг) при однократном введении), а при интервальном двукратном введении СТЗ наблюдалось развитие диабета, по уровню дефицита секреции инсулина, приближающегося к абсолютной инсулинопении [2]. В связи с чем нами была апробирована модель ДН у геминефрэктомированных крыс стока Wistar, получавших в течение 5 нед. высокожировое питание, с последующей индукцией никотинамид-стрептозотоцинового СД 2 типа, в которой к 28 нед. после индукции СД развивается значимая альбуминурия и морфологические признаки ДН, выявляемые при световой микроскопии (увеличение индекса мезангиальной экспансии, артериологиалиноз, тубулоинтерстициальный фиброз), а на 16 нед., по результатам электронной микроскопии, зафиксировано значимое утолщение гломерулярной базальной мембраны [19]. Внутрибрюшинное ведение никотинамида в дозе 230 мг/кг за 15 мин. до инъекции СТЗ (65 мг/кг) минимизирует повреждающее действие цитотоксина как на бета-клетки поджелудочной железы, вызывая лишь частичную инсулинопению и стабилизацию других клинических проявлений СД [26] за счёт способности никотинамида ингибировать вышеупомянутый фермент PARP [38].
Стоит отметить, что модель стрептозотоцин-индуцированного СД 2 типа с предварительным введением никотинамида ранее успешно была применена на практике зарубежными исследователями [26] и нашими соотечественниками [11], однако, без высокожирового питания и нефрэктомии специфических лабораторно-морфологических признаков ДН у крыс в этих работах не выявлено.
Преимуществами данной модели ДН у крыс по сравнению с генетическими моделями являются широкая доступность, низкая затратность, а также относительно простая методика воспроизведения. По нашим наблюдениям, такие животные развивают ожирение, среднюю по выраженности гипергликемию, инсулинорезистентность, альбуминурию, дислипидемию и умеренную артериальную гипертензию, являющиеся основными компонентами патогенеза ДН при СД 2 типа [12].
Заключение
Несмотря на большое разнообразие описанных на сегодняшний день моделей сахарного диабета у экспериментальных животных, негенетические модели стрептозотоцинового сахарного диабета по-прежнему остаются наиболее доступными, относительно легко реализуемыми и достаточно валидными, адекватно воспроизводящими обратимые стадии диабетической болезни почек у людей, когда воздействие фармакологических препаратов с нефропротективными свойствами может замедлить прогрессирование течения осложнения. Ряд имеющихся недостатков таких моделей (возможность разброса экспериментальных данных по уровню гликемии, потенциальная нефротоксичность стрептозотоцина, возможность спонтанной нормализации инсулин-секреторной функции) могут быть устранены путём правильного подбора диабетогенной дозы препарата, заблаговременного планирования протокола эксперимента и времени определения маркеров почечной дисфункции, а также посредством предварительного введения химических соединений, уменьшающих повреждающее действие цитотоксина на инсулин-секретирующие клетки (никотинамид). Кроме того, при использовании определённых схем введения стрептозотоцина у крыс с индуцированным алиментарным ожирением возможно моделирование умеренной гипергликемии, инсулинорезистентности и дислипидемии, т.е. ключевых патогенетических компонентов сахарного диабета 2 типа, а хирургическая редукция массы функционирующей почечной паренхимы может способствовать ускорению манифестации гипертензии и лабораторно-морфологических признаков диабетической нефропатии.
Работа выполнена в сотрудничестве с ресурсным центром «Развитие молекулярных и клеточных технологий» СПбГУ.
Рецензенты:
Митрейкин В.Ф., д.м.н., профессор кафедры патологической физиологии с курсом клинической патофизиологии ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова, г. Санкт-Петербург;
Гринева Е.Н., д.м.н., профессор, директор Института эндокринологии ФГБУ «СЗФМИЦ», г. Санкт-Петербург.