Остается актуальным комплексное изучение механизмов, приводящих к развитию анемии, в том числе патоморфологических аспектов данной проблемы. В ряде исследований установлены взаимосвязи кроветворных клеток и костномозгового микроокружения при лимфопролиферативных заболеваниях [1 - 4].
Исследований, посвященных структурно-функциональным изменениям эритрона и их взаимосвязям с развитием миелофиброза, как одной из составляющих костномозгового микроокружения, у пациентов с ХМЛ недостаточно [12, 14]. Как правило, представленные в этих работах результаты носят полуколичественный характер, что затрудняет понимание патогенеза анемии.
Цель исследования - с помощью комплексного клинико-морфологического анализа оценить структурно-функциональные особенности эритрона при развитии МФ у пациентов в различные фазы ХМЛ и в динамике химиотерапии.
Материал и методы исследования
Проведено клинико-морфологическое обследование 88 пациентов с ХМЛ (52 мужчины, 36 женщин в возрасте от 16 до 82 лет, средний возраст - 55,8±1,9 лет), находившихся на лечении в ГБУЗ НСО «Государственная Новосибирская областная клиническая больница» с 2006 по 2013 годы.
Всех пациентов разделили на две группы. 1-я группа - дебют хронической фазы ХМЛ или потеря полного гематологического ответа (n=53). У 60% пациентов (32 человека) этой группы потеря полного гематологического ответа наступила после одной линии химиотерапии (гидроксикарбамид+интерферон альфа-2β), у 15% пациентов (8 человек) - после двух линий (гидроксикарбамид+интерферон альфа-2β, иматиниб). 2-я группа - продвинутые фазы (фаза акселерации и фаза бластного криза) ХМЛ (n=35). Из пациентов 1-й группы была выделена дополнительная подгруппа (19 человек), в которую вошли пациенты, ответившие на лечение (полный гематологический ответ, полный цитогенетический ответ, большой цитогенетический ответ). Из них одну линию химиотерапии (гидроксикарбамид+интерферон альфа-2β) получили 58% больных (11 человек), две (гидроксикарбамид+интерферон альфа-2β, иматиниб) - 42% пациентов (8 человек).
Контрольную группу составили 50 человек без гематологических заболеваний и анемического синдрома (30 мужчин, 20 женщин, средний возраст - 44,73±2,48 лет), у которых исследованы показатели периферического звена эритрона. У 10 пациентов с целью исключения диагноза гемобластоза проводили цитологическое исследование костномозгового компартмента эритрона и патоморфологическое изучение трепанобиоптатов подвздошной кости.
Диагноз ХМЛ устанавливали на основании клинико-гематологических данных (лейкоцитоз, миелоцитарный сдвиг, эозинофильно-базофильная ассоциация, анемия, тромбоцитоз или тромбоцитопения, гепато- и спленомегалия), цитогенетических и молекулярно-генетических исследований крови и костного мозга, выявляющих Ph-хромосому и/или слитный ген BCR-ABL [6].
Результаты терапии ХМЛ оценивали согласно критериям международной организации European Leukemia Net 2009 г. [8].
Наличие анемии у пациентов регистрировали при уровне гемоглобина в периферической крови менее 120 г/л. Для определения степени тяжести анемии использовали классификацию ВОЗ: легкая анемия - Hb ≥ 95 г/л, умеренная - 80 - 94 г/л, выраженная - 65 - 79 г/л и тяжелая - менее 65 г/л.
Клинико-морфологические исследования выполнены с информированного согласия испытуемых и в соответствии с этическими нормами Хельсинской Декларации (2000 г.)
Для исследования показателей центрального и периферического звеньев эритрона в динамике химиотерапии использовали мазки периферической крови и аспираты костного мозга, окрашенные по методу Романовского-Гимзы. Показатели центрального звена эритрона оценивали по 400 ядросодержащих клеток костного мозга.
Степень МФ устанавливали согласно шкале Европейского консенсуса [13]. При этом миелофиброз 1-й степени расценивали как начальный фиброз, а МФ 2-й и 3-й степеней - как выраженный [12].
Автоматизированное морфометрическое исследование МФ проводили с использованием программы анализа изображений AxioVision 4.6, камеры Axio Cam, микроскопа Zeiss, компьютера. В парафиновых срезах трепанобиоптатов подвздошной кости, толщиной 4 мкм, импрегнированных серебром по методу Гомори и окрашенных по методу ван Гизона, при увеличении в 200 раз измеряли абсолютную площадь фиброзной ткани. Абсолютную площадь гемопоэтической ткани измеряли в срезах, окрашенных гематоксилином и эозином. Изучали все костномозговые полости одного среза, что соответствовало 5 - 7 полям зрения микроскопа и 20 - 30 полям зрения камеры (в зависимости от размера среза). Площадь одного поля зрения камеры составляла 364 000 мкм2 (0,7 мм2). Суммарную абсолютную площадь фиброзной ткани в пределах одного среза получали путем сложения площадей фиброзной ткани во всех полях зрения камеры. Аналогичным образом получали суммарную абсолютную площадь гемопоэтической ткани. Затем вычисляли относительную площадь фиброзной ткани: Sотн.фибр.тк. = Sфибр.тк./.Sгемопоэт.тк. х 100%, где Sфибр.тк. - суммарная абсолютная площадь фиброзной ткани, Sгемопоэт.тк. - суммарная абсолютная площадь гемопоэтической ткани.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы SPSS (версия 17.0). Результаты представлены в виде M±σ, где М - среднее арифметическое значение, σ - стандартное отклонение, а также M±m, где М - среднее арифметическое значение, m - ошибка средней арифметической. Проверку соответствия выборок анализируемых данных нормальному распределению проводили по критерию Шапиро-Уилка. Средние значения в разных выборках сравнивали с помощью U-теста по методу Манна и Уитни (непараметрического теста) и критерия Стьюдента (t-критерий). Связь между двумя переменными определяли с помощью коэффициентов корреляции Пирсона и Спирмана.
Результаты исследования и их обсуждение
У пациентов 1-й и 2-й групп наименьшее общее число эритроидных клеток в костном мозге (по данным миелограммы), наименьший уровень эритроцитов в периферической крови и наименьший уровень гемоглобина выявлены при выраженном МФ, наибольшие значения данных показателей обнаружены у пациентов без МФ (табл. 1).
Таблица 1
Показатели эритрона в 1-й и 2-й группах пациентов при миелофиброзе различной выраженности (M±m)
МФ |
Общее число эритроидных клеток в костном мозге, по данным миелограммы, % |
Эритроциты в периферической крови, х109/л |
Гемоглобин, г/л |
|||
1-я группа |
2-я группа |
1-я группа |
2-я группа |
1-я группа |
2-я группа |
|
1. МФ-0, n=25/17* |
11,9±2,3 |
16,2±5,9 |
4,4±0,3 |
3,9±1,8 |
125,6±6,2 |
107,3±6,2 |
2. Начальный МФ, n=13/8 |
7,8±1,6 |
13,4±4,4 |
4,0±0,3 |
3,4±0,3 |
114,5±7,0 |
100,1±9,8 |
3.Выраженный МФ, n=15/10 |
6,0±1,2 |
5,9±1,9 |
3,9±0,2 |
2,9±0,3 |
107,3±6,9 |
87,1±9,4 |
4. Контрольная группа, n=10 |
20,6±2,2 |
20,6±2,2 |
5,4±1,1 |
5,4±1,1 |
134,5±5,3 |
134,5±5,3 |
р |
p1,2, p2,3, p1,3, р1,4, р2,4, р3,4 <0,05 |
p1,2, p2,3, p1,3, р1,4, р2,4, р3,4 <0,05 |
p1,2, p2,3, p1,3, р1,4, р2,4, р3,4 <0,05 |
p1,2, p2,3, p1,3, р1,4, р2,4, р3,4 <0,05 |
p1,2, p2,3, p1,3, р1,4, р2,4, р3,4 <0,05 |
p1,2, p2,3, p1,3, р1,4, р2,4, р3,4 <0,05 |
Примечание. МФ - миелофиброз; * - n представлено в виде а/b, где а - число пациентов в дебюте хронической фазы ХМЛ или при потере полного гематологического ответа, b - число больных в продвинутые фазы ХМЛ.
Все показатели эритрона в 1-й и во 2-й группах оказались меньше, чем в группе контроля. Уровень гемоглобина у пациентов 2-й группы был достоверно меньше, чем у пациентов 1-й группы вне зависимо от наличия МФ и степени его выраженности (р<0,05).
У больных 1-й группы обнаружена обратная корреляционная связь между Sотн.фибр.тк. и уровнем гемоглобина как при начальном (r=-0,477, p=0,048), так и при выраженном (r=-0,432, p=0,031) МФ. Во 2-й группе пациентов также выявлена обратная корреляция между Sотн.фибр.тк. и уровнем гемоглобина как при начальном (r=-0,506, p=0,032), так и выраженном (r=-0,834, p=0,005) МФ.
Показано, что в 1-й группе Sотн.фибр.тк. у больных с начальным МФ при тяжелой анемии больше, чем при отсутствии анемии и при анемии легкой степени (табл. 2). Во всех случаях анемии Sотн.фибр.тк. у больных с выраженным МФ достоверно больше, чем у больных с начальным МФ.
У всех пациентов 2-й группы обнаружена анемия. Наибольшая Sотн.фибр.тк как у больных с начальным МФ, так и выраженным МФ была выявлена при анемии тяжелой степени, наименьшие аналогичные показатели - при анемии легкой степени (табл. 3). Sотн.фибр.тк. у больных с выраженным МФ превышала таковую у больных с начальным МФ при анемии любой степени выраженности.
Таблица 2
Относительная площадь фиброзной ткани у больных с начальным МФ и выраженным МФ в дебюте хронической фазы ХМЛ и при потере полного гематологичесого ответа в условиях анемии различной степени выраженности (M±σ)
Анемия |
Относительная площадь фиброзной ткани, % |
р´ |
|
при начальном МФ |
при выраженном МФ |
||
1.Отсутствует, n=19 |
6,9±20,1 |
7,9±20,1 |
р´=0,128 |
2.Лёгкая, n=28 |
9,4±15,1 |
19,3±29,6 |
р´=0,012 |
3.Умеренная, n=16 |
10,1±13,3 |
24,5±21,4 |
р´=0,033 |
4.Выраженная, n=10 |
12,5±12,4 |
45,4±23,4 |
р´=0,005 |
5.Тяжёлая, n=8 |
15,6±12,2 |
62,3±24,6 |
р´=0,007 |
р |
р1,2, р1,3, р1,4, р2,3, р2,4, р3,4, р3,5, р4,5≥0,05 р1,5=0,018 р2,5=0,032 |
р1,2, р1,3, р1,4, р2,3, р2,4, р2,5, р3,4, р3,5, р4,5≥0,05 р1,5=0,048 |
|
Таблица 3
Относительная площадь фиброзной ткани у больных с начальным МФ и выраженным МФ в продвинутые фазы ХМЛ при анемии различной степени выраженности (M±σ)
Анемия |
Относительная площадь фиброзной ткани, % |
р´ |
|
при начальном МФ |
при выраженном МФ |
||
1.Легкая, n=22 |
6,4±7,0 |
18,5±23,1 |
р´=0,004 |
2.Умеренная, n=6 |
10,5±18,9 |
34,7±53,3 |
р´=0,039 |
3.Выраженная, n=4 |
26,3±45,6 |
51,7±49,6 |
р´=0,002 |
4.Тяжелая, n=3 |
43,5±40,3 |
65,4±29,8 |
р´=0,036 |
р |
р1,2=0,362 р1,3, р1,4, р2,3, р2,4, р3,4<0,05 |
р1,2=0,110 р1,3, р1,4, р2,3, р2,4, р3,4<0,05 |
|
У пациентов дополнительной подгруппы, ответивших на лечение, все изменения эритрона относительно МФ были аналогичны изменениям, характерным для пациентов 1-й и 2-й групп. В то же время у больных этой подгруппы без МФ общее число эритроидных клеток в костном мозге и число эритроцитов в периферической крови не отличались от нормы.
Одно из объяснений угнетения эритрона при развитии МФ заключается в вытеснении фиброзными волокнами и опухолевой тканью гемопоэтических клеток. По аналогии с лимфопролиферативными заболеваниями при опухолевом поражении костного мозга развивается «синдром занятого места» [5, 7] с проявлениями в виде гипоплазии нормальных ростков кроветворения.
Нами впервые установлено, что у пациентов в фазе акселерации и фазе бластного криза при выраженном МФ происходит наибольшее угнетение эритрона. У пациентов хронической фазы, ответивших на лечение, показатели эритрона были меньше таковых в группе контроля только в случае наличия МФ. Отсутствие МФ у пациентов хронической фазы, ответивших на лечение, ассоциировано с нормальными показателями эритрона.
Угнетение эритропоэза ни во всех случаях объясняется исключительно механическим вытеснением нормального кроветворения. Среди механизмов, негативно влияющих на костномозговое звено эритрона, ведущую роль играют провоспалительные цитокины, такие как сосудисто-эндотелиальный фактор роста [15] и ИЛ-6 [11], индуцирующие неэффективный эритропоэз. По мере прогрессирования заболевания увеличивается концентрация провоспалительных цитокинов [15], что и объясняет более выраженное угнетение эритрона и наличие анемии у всех больных фазы акселерации и фазы бластного криза.
Таким образом, анализ состояния эритрона в мазках костного мозга, трепанобиоптатах подвздошной кости и периферической крови выявил его взаимосвязи с выраженностью МФ. Наибольшее угнетение эритрона отмечается при выраженном МФ, при этом степень его угнетения прямо коррелирует с распространенностью МФ в любую фазу ХМЛ. Самое выраженное подавление эритрона происходит в продвинутые фазы ХМЛ, характеризующиеся наибольшей Sотн.фибр.тк. У пациентов в хронической фазе ХМЛ, ответивших на лечение, угнетение эритрона отмечено только при наличии МФ.
Использование автоматизированной морфометрической оценки МФ позволяет объективно оценить патогенетическую роль МФ в изменениях эритрона, в том числе в развитии анемии у пациентов с ХМЛ.
Рецензенты:
Гуляева Л.Ф., д.б.н., профессор, зав. лабораторией молекулярных механизмов канцерогенеза ФГБНУ «НИИ молекулярной биологии и биофизики», г. Новосибирск;
Сидорова Л.Д., д.м.н., профессор, профессор кафедры внутренних болезней Новосибирского государственного медицинского университета МЗ РФ, г. Новосибирск.