Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

OCCURRENCE OF TROMBOGENNY ALLELIC POLYMORPHISMS AT CHILDREN WITH SHARP GLOMERULONEFRIT

Makhova E.G. 1 Vykhodtseva G.I. 1
1 GBOU VPO "Altai State Medical University" of the Russian Ministry of Health
The analysis of prevalence of polymorphisms of hereditary thrombophilia at children with an acute glomerulonephritis with a nephritic syndrome and a nephrotic syndrome is carried out. The importance of presence of separate polymorphisms at population for development of an acute glomerulonephritis is shown. Research established that, at an acute glomerulonephritis with a nephrotic syndrome the heterozygotic polymorphic option of 677 ST of a gene of MTHFR was taped more often than in group of control. A heterozygotic polymorphism 66 AG genes of MTRR meets at patients with a nephrotic and nephritic syndrome than in control group more often. The conducted research established that at children the frequency of minor option T 677 of a gene of MTHFR meets an acute glomerulonephritis more often than at healthy children. High frequency of a carriage of heterozygotic genotypes of 677 ST of a gene of MTHFR and 66 AG genes of MTRR in group of children with a glomerulonephritis is determined, and existence of these options of genes is a disease failure predictor.
trombogenny polymorphisms
glomerulonefrit
the pediatrics

В последние годы неуклонно возрастает интерес к изучению различных форм сосудистой патологии почек. По современным представлениям, нарушения в системе гемостаза по значимости мало уступают иммунному патологическому процессу в развитии нефритов. От характера и выраженности локальной и системной внутрисосудистой гиперкоагуляции, во многом зависят активность нефрита и скорость прогрессирования нефросклероза [1,2,4,5,6]. Тромбоз у детей с генетически обусловленными тромбофилиями в большинстве случаев возникает при воздействии дополнительных факторов риска. Но и пациенты с гетерозиготными формами мутации нуждаются в профилактической анитромботической терапии. К настоящему времени сложилось представление о тромбозе у детей как о мультифакторной патологии, что определяет его значение в качестве мультидисциплинарной проблемы, привлекающей внимание специалистов различного профиля [3,7]. Наиболее значимым среди наследственных механизмов, повышающих риск тромбозов, является наличие тромбогенных полиморфизмов [9]. Среди последних выделяют мутации G1691А в гене V фактора свертывания (Лейденская мутация), мутация G20210A в гене протромбина,  мутацию С677Т в гене метилентетрагидрофолатредуктазы (МТНFR). К настоящему времени выявлено более ста мутаций. Как правило, для возникновения тромбоза необходима не только генетическая предрасположенность - носительство тромбогенных аллельных полиморфизмов, но и наличие пусковых факторов, к которым относят катетеризацию сосудов, генерализованные инфекции и многое другое, в том числе воспалительный процесс при нефропатиях [8,10]. В настоящее время доказана связь тромбофилии и тромбоза вен, но имеются лишь единичные данные касающиеся связи наследственной тромбофилии и поражения почек [3,7,8,9].

Цель исследования: установить распределение тромбогенных аллельных полиморфизмов у детей с острым гломерулонефритом.

Материал и методы исследования

В качестве материала для проведения молекулярно-генетического исследования на носительство полиморфных вариантов генов системы гемостаза и генов фолатного цикла использованы образцы ДНК 31 пациента (22 мальчиков и 9 девочек) в возрасте 2-15 лет, находящихся на стационарном  лечении в Алтайской краевой клинической детской больницы г. Барнаула с диагнозом острый гломерулонефрит с нефротическим и нефритическим синдромами.

Определение аллельных вариантов генов осуществлялось в лаборатории молекулярной генетики Алтайского краевого диагностического центра (г. Барнаул). В основе анализа лежал метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (Real-Time PCR) с использованием конкурирующих TagMan зондов. Проведено генетическое исследование шести протромботических полиморфных маркёров генов-кандидатов: фактора II протромбина (G20210А); фактора V Лейден (Arg506Gln); фактора VII свертывания крови (Arg353Gln); фактора XIII свертывания крови (Val134Leu); фибриногена G(-455)A; ингибитора активатора плазминогена PAI-1 4G(-675)5G и четырех полиморфных вариантов генов, ассоциированных с нарушениями фолатного цикла: метилентетрагидрофолатредуктазы - (MTHFR Ala223Val, С677Т, rs1801133 и MTHFR Е429А, А1298С, rs1801131), В12-зависимой метионин-синтазы - (MTR Asp919Gly, А2756G, rs1805087) и метионин-синтазы редуктазы - (MTRR  Ile22Met, A66G, rs1801394).

Для суждения о нормальном распределении в популяции генотипов генов системы гемостаза и генов фолатного цикла обследовано 115 здоровых детей (контрольная группа) со сходными демографическими характеристиками.

Статистическая обработка результатов исследования проводилась с помощью пакета программ "STATIstica for Windows 5.0" (STATSoft). Для проверки гипотезы о нормальном распределении использовали критерий Шапиро-Уилка. Попарное сравнение частот аллелей и генотипических групп в разных популяциях проводили с помощью двустороннего точного критерия Фишера (ТКФ) и критерия Пирсона. Соответствие распределения генотипических частот равновесию Харди-Вайнберга проверяли посредством критерия χ2, используя при этом онлайн калькулятор (http://www.oege.org/software/hardy-weiberg.shtml). Различия сравниваемых величин считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Гены-кандидаты предрасположенности к повышенному тромбообразованию в дебюте острого гломерулонефрита (ОГН) были исследованы у 22 (71,0%) мальчиков и 9 (29,0%) девочек, при этом отмечено достоверно значимое преобладание мальчиков (р=0,002) по отношению к девочкам при данной патологии.

В исследованной выборке детей с ОГН не было обнаружено гетерозиготных и гомозиготных (минорных аллелей) полиморфных вариантов гена FII G20210A и гена FV G1691A свертывающей системы крови, что не позволило включить данные генотипы в статистическую обработку и провести соответствующие расчеты.

В ходе исследования пациентов с острым гломерулонефритом были рассчитаны частоты аллелей изученных полиморфных вариантов генов системы гемостаза и фолатного цикла (табл. 1). При сравнении распределения частоты аллелей генов факторов свертывания крови у больных гломерулонефритом и контрольной группы, статистически значимых различий выявить не удалось (р>0,05). Однако, результаты генотипирования генов фолатного цикла показали, что частота минорного аллеля Т 677 гена MTHFR у больных с острым гломерулонефритом статистически значимо больше, чем в группе контроля (р=0,026). По данным исследования M. Fodinger и соавт. [98], установлено, что носительство мутантного аллеля Т 677 гена MTHFR у больных с гломерулонефритом сопряжено с высоким темпом утраты функционирующих нефронов и повышением риска развития почечной недостаточности.

Таблица 1

Распределение частот аллелей генов системы гемостаза (тромбогенных полиморфизмов) и фолатного цикла у детей с острым гломерулонефритом

 

 

Локус

Аллели

Группа детей

с ОГН

(%)

Группа контроля (здоровые дети)

(%)

р

FGB

G(-455)A

G

A

22 (78,6)

  6 (21,4)

60 (78,9)

 16 (21,1)

1,000

1,000

FVII

G10976A

G

A

25 (89,3)

3 (10,7)

65 (90,3)

   7 (9,7)

1,000

1,000

FXIII

G226A

G

A

20 (76,8)

  8 (28,6)

79 (76,0)

 25 (24,0)

1,000

0,764

PAI-1 4G

(-675)5G

5G

4G

33 (53,2)

29 (46,8)

94 (40,9)

136 (59,1)

0,106

0,379

MTHFR

С677Т

С

Т

39 (62,9)

23 (37,1)

171 (74,4)

59 (25,6)

0,344

0,026

MTHFR

А1298С

А

С

18 (64,3)

10 (35,7)

73 (70,2)

31 (29,8)

0,780

0,541

MTR

A2756G

А

G

22 (78,6)

6  (21,4)

73 (81,1)

17 (18,9)

1,000

0,762

MTRR

A66G

A

G

16 (57,1)

5 (42,9)

44 (44,0)

56 (56,0)

1,000

<0,001

Статистика: р - точный критерий Фишера (ТКФ); в скобках - %.

Интересно, что частота минорного аллеля G 66 гена MTRR определялась достоверно чаще в группе контроля (р<0,001) по сравнению с больными ОГН. Выявленные изменения  можно объяснить данными Л.А. Строзенко и соавт., что в популяции здоровых подростков г. Барнаула наблюдается высокий процент гомозиготного генотипа 66 GG (41,8%) и частоты аллеля G 66 гена MTRR (56,9%), что дает основание предположить адаптивное преимущество полиморфизма А66G гена MTRR в процессе эволюции или возможный «эффект основателя». По остальным частотам аллелей в исследованных полиморфных вариантах генов факторов свертывания крови и фолатного метаболизма статистически значимых различий не наблюдалось.

Распределение частот аллелей и генотипов в изученных генах факторов свертывания крови и генов фолатного метаболизма у детей проверено на соответствие равновесию Харди-Вайнберга (табл. 2).

Таблица 2

Распределение полиморфных вариантов генов факторов свертывания крови

и генов системы фолатного цикла у детей с ОГН

Локус

Генотип

N.O.

%

N.E.

%

χ2

d.f.=1

Частота аллеля

Ho±S.E.

He±S.E.

FGB

G(-455)A

(n=14)

GG

64,3

61,7

0,321

p=0,571

G=0,79

A=0,21

  Ho=0,286± 0,121

  He=0,337±0,126

GA

28,6

33,7

AA

7,1

4,6

FVII

G10976A

(n=14)

GG

78,6

79,7

0,202

p=0,653

G=0,89

A=0,11

   Ho=0,214±0,111

  He=0,191±0,105

GA

21,4

19,1

AA

0

1,2

FXIII

G226A

(n=14)

GG

57,1

51,0

0,126

p=0,262

G=0,71

A=0,29

Ho=0,286 ± 0,121

He=0,408 ± 0,131

GA

28,6

40,8

AA

14,3

8,2

PAI-1 4G

(-675)5G

(n=31)

5G/5G

32,3

28,3

0,772

p=0,380

5G=0,53

4G=0,47

Ho=0,419±0,089

He=0,498±0,090

4G/5G

41,9

49,8

4G/4G

25,8

21,9

MTHFR

С677Т

(n=31)

СС

32,3

39,6

3,042

p=0,081

C=0,63

T=0,37

Ho=0,613±0,087 

He=0,467±0,090 

СТ

61,3

46,7

ТТ

6,4

13,8

MTHFR

А1298С

(n=14)

АА

35,7

45,9

0,836

p=0,360

A=0,64

C=0,36

Ho=0,572±0,132   

He=0,495±0,134 

АС

57,2

49,5

СС

7,1

12,8

MTR

A2756G

(n=14)

AA

57,2

61,7

1,041

p=0,307

A=0,79

G=0,21

Ho=0,428±0,132

He=0,337±0,126 

AG

42,8

33,7

GG

0

4,6

MTRR

A66G

(n=14)

AA

21,4

32,6

2,941

p=0,0864

A=0,57

G=0,43

Ho=0,715±0,121

He=0,490±0,134 

AG

71,5

49,0

GG

7,1

18,4

Примечание. N.O. - наблюдаемые частоты генотипов; N.E. - ожидаемые частоты генотипов; критерий χ2 оценка соответствия равновесию Харди-Вайнберга; число степеней свободы; Ho±S.E. и He±S.E. - соответственно наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность с ошибкой.

Обнаружено, что распределение частот генотипов генов факторов свертывания крови и генов фолатного метаболизма соответствует равновесию Харди-Вайнберга.

Как видно из таблицы 2, наблюдаемое распределение генотипов протромботических генов согласуется с ожидаемыми частотами распределения. Высокий уровень ожидаемой гетерозиготности по полиморфным вариантам генов факторов свертывания крови был определен нами для трех генов: G(-455)A гена FGB (0,337); G226A гена FXIII (0,408); 4G(-675)5G гена PAI-1 (0,498). В том числе, выявлен высокий уровень теоретической гетерозиготности по полиморфизмам генов фолатного метаболизма (от 0,467 до 0,490). 

Анализ частоты встречаемости тромбогенных аллельных полиморфизмов у пациентов с ОГН показал (табл. 3) отсутствие достоверно значимых различий в распределении генов системы гемостаза у больных и детей контрольной группы (р>0,05). Однако, в группе детей с ОГН гетерозиготный вариант 677 СТ гена MTHFR и гетерозиготный вариант 66 AG гена MTRR достигали уровня статистической значимости (р=0,007) по сравнению с контрольной группой. Вместе с тем, гомозиготный вариант (мажорный аллель) 677 СС гена MTHFR и гомозиготный вариант (минорный аллель) 66 GG гена MTRR значимо чаще определялись в группе здоровых детей (р=0,015).

Таблица 3

Распределение частот генотипов генов системы гемостаза и генов фолатного цикла у детей с ОГН


Ген

Генотип

Группа детей с ОГН

(%)

Группа контроля (здоровые дети)

(%)

р

FGB

(-455) GG

(-455) GA

(-455) AA

 

9 (64,3)

4 (28,6)

1 (7,1)

n=14

23 (60,5)

14 (36,8)

1 (2,6)

n=38

1,000

0,746

1,000

FVII

10976 GG

10976 GA

10976 AA

 

11 (78,6)

3 (21,4)

0

n=14

29 (80,6)

7 (19,4)

0

n=36

1,000

1,000

-

FXIII

226 GG

226 GA

226 AA

 

8 (51,7)

4 (28,6)

2 (14,3)

n=14

30 (57,7)

19 (36,5)

3 (5,8)

n=52

1,000

0,755

0,576

PAI-1

(-675) 5G5G

(-675) 4G5G

(-675) 4G4G

 

10 (32,3)

13 (41,9)

8 (25,8)

n=31

20 (17,4)

54 (47,0)

41 (35,6)

n=115

0,082

0,687

0,393

MTHFR

677 СС

677 СТ

677 ТT

 

10 (32,3)

19 (61,3)

2 (6,4)

n=31

66 (57,4)

39 (33,9)

10 (8,7)

n=115

0,015

0,007

0,743

MTHFR

1298 AA

1298 AC

1298 CC

 

5 (35,7)

8 (57,2)

1 (7,1)

n=14

24 (46,1)

25 (48,1)

3 (5,8)

n=52

0,555

0,764

1,000

MTR

2756 AA

2756 AG

2756 GG

 

8 (57,2)

6 (42,8)

0

n=14

30 (66,7)

13 (28,9)

2 (4,4)

n=45

0,538

0,514

1,000

 

MTRR

66 AA

66 AG

66 GG

 

3 (21,4)

10 (71,5)

1 (7,1)

n=14

15 (30,0)

14 (28,0)

21 (42,0)

n=50

0,739

0,005

0,023

Статистика: р - точный критерий Фишера (ТКФ); в скобках - %

Большой интерес представляло изучение распределения тромбогенных аллельных полиморфизмов у детей ОГН с нефритическим и нефротическим синдромами. Исследование позволило установить, что при ОГН с нефротическим синдромом гетерозиготный полиморфный вариант 677 СТ гена MTHFR выявлялся достоверно чаще, чем в группе контроля (60,0% против 33,9% контрольной группы, (р<0,05)). Напротив, гомозиготный вариант (частый аллель) 677 СС гена MTHFR с большей частотой определялся в группе контроля (57,4% против 35,0% детей с ОГН нефротическим синдромом, (р<0,05)). Следует отметить, что при ОГН с нефритическим синдромом и у детей контрольной группы статистически значимой разницы в распределении гетерозиготного полиморфизма 677 СТ гена MTHFR не обнаружено. Интересно, что гетерозиготный полиморфизм 66 АG гена MTRR с достоверной частотой зафиксирован у пациентов с нефротическим и нефритическим синдромом по сравнению с контрольной группой (р<0,05)). В распределении полиморфных вариантов генов системы гемостаза при ОГН с нефротическим синдромом достоверных различий с группой здоровых детей не было выявлено. Вместе с тем, показано, что гомозиготный вариант (частый аллель) (-675) 5G/5G  гена  PAI-1 значимо чаще выявлен в группе пациентов с ОГН нефротическим синдромом (р<0,05) по сравнению с контролем (40,0% против 17,4% контрольной группы, (р<0,05)).

Заключение. Таким образом, проведенное исследование позволяет сделать вывод о том, что у детей с ОГН частота минорного аллеля Т 677 гена MTHFR встречается с большей частотой, чем среди здоровых лиц. Установлена высокая частота носительства гетерозиготных генотипов 677 СТ гена MTHFR и 66 AG гена MTRR  в группе больных детей, вероятно, наличие данных полиморфных вариантов генов можно рассматривать в качестве предикторов неблагоприятного исхода заболевания. При этом выявлен высокий уровень ожидаемой гетерозиготности по полиморфным вариантам генов фолатного цикла.

 

Рецензенты:

Лобанов Ю.Ф., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой педиатрии №2 Алтайского государственного медицинского университета Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Барнаул;

Клименов Л.Н., д.м.н., профессор кафедры педиатрии №2 Алтайского государственного медицинского университета Министерства здравоохранения Российской Федерации,              г. Барнаул.