Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

FEATURES OF DYNAMICS OF SOME GROWTH FACTORS IN LIVER AND LUNG TISSUES IN THE EARLY STAGES OF METASTASIS IN EXPERIMENT.

Frantsiyants E.M. 1 Kaplieva I.V. 1 Kolesnikov E.N. 1 Trepitaki L.K. 1 Ayrapetova T.G. 1 Pogorelova Yu.A. 1
1 FSBI "Rostov scientific and research institute of oncology" of the Ministry of Health of Russia
Liver and lung metastases are the most frequent complications of neoblastoma; they are practically untreatable at the time of diagnosis. Oncological studies are now focused on the detection of markers of predisposition to metas-tases for their early diagnostics and on optimization of the treatment and prevention methods. Dynamics of growth factors (IGF-I, IGF-II, TGF-β1) in the liver and lungs of white outbred male rats 1 and 2 weeks after sar-coma 45 metastasis to the organs was studied comparatively. Growth factors were determined by ELISA. Com-mon early signs of metastases included an increased content of ТGF-β1, as well as unchanged IGF-I and changes in IGF-II towards the similar levels in both organs 1 week after metastasis. Distinguishing features were multidirec-tional changes in IGF-I 2 weeks after metastasis and in IGF-II during the both observation periods, as well as a later increase in ТGF-β1 level in lungs (after 2 weeks of metastasis) in comparison with the liver (after 1 week of metastasis). Thus, dynamics of growth factors in the early stages of metastasis development in the liver and lungs has both common and different features depending on the localization of the pathological process.
rats
lung metastases
liver metastases
growth factors

Ежегодно в мире диагностируется более 10 миллионов больных первичными злокачественными новообразованиями. Метастазы в печень и легкие представляют собой наиболее частые и в большинстве случаев трудноизлечимые осложнения злокачественных заболеваний. Несмотря на усовершенствование уже имеющихся и внедрение новых методов диагностики, в 50-75% случаев эта патология выявляется поздно, когда больному помочь уже практически невозможно [5]. Огромное число исследований сфокусировано на поиске маркеров предрасположенности к возникновению метастазов для их ранней диагностики, с одной стороны, и выявлении факторов, позволяющих прогнозировать развитие заболевания и оптимизировать методы лечения – с другой. На сегодняшний момент накоплено множество данных, подтверждающих участие факторов роста в развитии и прогрессировании злокачественных новообразований. Нередко эти сведения достаточно противоречивы.

Целью работы явилось изучение динамики инсулиноподобных факторов роста I и II типов (IGF-I, IGF-II) и трансформирующего фактора роста β1 (ТGF-β1) в печени и легких на ранних этапах метастазирования.

Материалы и методы исследования

Работа выполнена на 42 белых беспородных крысах самцах массой 220-250 граммов. 1 группу (К 1) составили интактные крысы (7 шт.); 2 группу (К 2) – крысы с подкожно выведенной селезенкой (7 шт.); 3 группу - крысы через 1 неделю после введения саркомы 45 (С-45) в селезенку (7 шт.); 4 группу - крысы через 2 недели после введения С-45 в селезенку (7 шт.); 5 группу - крысы через 1 неделю после введения С-45 в подключичную вену (7 шт.); 6 группу - крысы через 2 недели после введения С-45 в подключичную вену (7 шт.).

Модель экспериментального метастазирования в печень воспроизводили по следующей схеме. Предварительно, за 3-4 недели до перевивки С-45, под кожу живота выводили селезенку. Затем путём интралиенальной инъекции помещали опухолевые клетки в орган (0,1 мл взвеси С-45 в физиологическом растворе, 1×106), где впоследствии развивался первичный опухолевый узел, метастазирующий в печень [3]. Модель экспериментального метастазирования в легкие осуществлялась путем введения взвеси клеток С-45 (в объеме 0,5 мл в физиологическом растворе, 2×106) в подключичную вену [4].

Крыс умерщвляли путем декапитации на гильотине. Извлекали печень и легкие (визуально: без опухоли); 100 мг ткани промывали 1×фосфатно-солевым буфером (PBS), гомогенизировали в 1×PBS и оставляли на ночь при -20 °С. В дальнейшем для полного разрушения клеточных мембран проводили два цикла замораживания-оттаивания. Полученную суспензию центрифугировали 5 минут при 5000 g (2-8 °С). Перед исследованием образцы размораживали и ещё раз центрифугировали. Определение факторов роста проводили методом ИФА с применением стандартных тест-систем.  

Статистическую обработку полученных результатов проводили при помощи параметрического критерия Стьюдента на персональном компьютере посредством программы STATISTICA 10.0 и непараметрического критерия Вилкоксонна-Манна-Уитни. Достоверными считали различия между двумя выборками при р<0.05.

Результаты исследования и их обсуждение

I. Контрольные группы. У интактных животных уровни факторов роста в исследуемых тканях отличались между собой изначально: в легких содержание IGF-I и ТGF-β1 было больше, чем в печени, в 1,4 и 1,8 раза соответственно, концентрация IGF-II, напротив, была в 2,3 раза ниже (табл. 1). У крыс с подкожно выведенной селезенкой в печени резко в 4,4 раза возрастал уровень IGF-II. В результате коэффициент IGF-I/IGF-II уменьшался в 6,7 раза (таблица).

          Факторы

роста

Группы крыс

Печень

Легкие

IGF-I

(нг)

IGF-II

(нг)

IGF-I

IGF-II

ТGF-β1

(пг)

IGF-I

 (нг)

IGF-II

(нг)

IGF-I

IGF-II

ТGF-β1

(пг)

Интактные самцы (К1)

19,9

± 3,1

9,3

± 1,0

2,0

 ± 0,4

2230,1

±473,2

26,9

± 2,4▲

4,0

± 0,4▲

5,7

± 0,5▲

4107,3

±422,4▲

Селезенка п/к (К2)

11,1

± 1,8

40,9

± 12,4*

0,03

 ± 0,02*

2463,1

±1100,1

-

-

-

-

1 неделя метастазирования

19,3

± 2,4

17,8

± 2,4*,+

↑↓

1,1

± 0,2+

6549,8

±758,7*

24,5

± 2,1

8,7

± 1,1*

2,6

± 0,3*

4171,3

± 328,9

2 неделя метастазирования

31,2

± 4,1*,+,1

↑↑↑

27,3

± 1,3*,1

↑↑

1,1

± 0,1+

7819,8

±157,0*

15,7

 ± 2,6*,1

↓↓

3,1

± 0,61

6,1

± 0,81

6138,3

±380,0*,1

↑↑

Содержание факторов роста в ткани печени и легких у крыс с метастазами в этих органах

(на 1 г ткани)

Примечание. * - достоверные отличия от интактных крыс, + - достоверные отличия от крыс с подкожно выведенной селезенкой, 1 – достоверные отличия от 1 недели метастазирования, ▲  - достоверные отличия ткани печени от легких.

Большее содержание IGF-II и меньшее содержание TGF-β1 в печени по сравнению с легкими у интактных крыс связано, по всей видимости, с большей пролиферативной активностью гепатоцитов. Известно, что IGF-II является мощным митогенным фактором для многих клеток, он стимулирует их пролиферацию и дифференцировку, в то же время TGF-β1 является важным регуляторным супрессорным фактором в гепатоцитах [8]. Резкое увеличение концентрации IGF-II в печени после выведения селезенки под кожу могло явиться следствием модификации кровообращения из-за дислокации селезенки, что создавало условия для ещё большей активации пролиферативных процессов в печени.

Большее содержание TGF-β1 в легких у интактных крыс могло быть обусловлено большим стромальным компонентом в них. Известно, что в нормальных нетрансформированных клетках TGF-β1 стимулирует продукцию белков экстрацеллюлярного матрикса – коллагена и фибронектина, а также снижает уровень секреции ферментов деградации внеклеточного матрикса – коллагеназы, гепариназы и стромелизина [1].

II. Модель экспериментальных метастазов в печень. Через 1 неделю после введения в селезенку опухолевой взвеси С-45 в печени отмечалось уменьшение содержания IGF-II - более чем в 2 раза, в результате коэффициент IGF-I/IGF-II увеличивался в 3,7 раза относительно К2. ТGF-β1  также увеличивался, он был в 2,9 раза больше, чем у интактных животных (таблица).

Через 2 недели от начала воссоздания метастатического процесса в печени в ней увеличивались уровни IGF-I и IGF-II относительно крыс из предыдущего срока наблюдения соответственно в 1,6 и 1,5 раза. Коэффициент IGF-I/IGF-II не изменялся. Концентрация ТGF-β1 оставалась такой же высокой, как и на предыдущем сроке наблюдения (таблица).

III. Модель экспериментальных метастазов в легкие. Через 1 неделю метастазирования в легких в 2,2 раза увеличивался уровень IGF-II, в результате коэффициент IGF-I/IGF-II снижался во столько же раз (таблица). Через 2 недели - уменьшались значения обоих инсулиноподобных факторов роста относительно предыдущего срока наблюдения: IGF-I – в 1,6 раза, IGF-II – в 2,8 раза соответственно, при этом IGF-II восстанавливался до интактных значений, а IGF-I – был в 1,7 раза меньше, чем у интактных животных. Коэффициент IGF-I/IGF-II, напротив,  увеличивался в 2,3 раза. ТGF-β1 увеличивался в 1,5 раза (таблица).

Необходимо отметить, что уровни исследуемых факторов роста в органах складываются из нескольких составляющих. Известно, что эти субстанции синтезируются как клетками самих органов, с одной стороны, так и опухолевыми клетками - с другой. Через 1 неделю от начала метастазирования в величину факторов роста основной вклад, по всей видимости, вносят гепатоциты и альвеолоциты. Нами установлено, что первым начинает «реагировать» IGF-II: изначально увеличенный его уровень в печени снижается, а низкий уровень в легких - увеличивается до примерно одинаковых цифр. Напрашивается вывод, что для хорошего «приживления» злокачественных клеток в органах должен сформироваться определенный, больший, чем у интактных крыс, уровень IGF-II.

Через 2 недели от начала метастазирования клетки саркомы, попавшие в органы из кровеносных сосудов, начинают делиться и «работать» более активно. В результате в печени уровни обоих инсулиноподобных факторов роста увеличиваются. Известно, что лиганды IGF являются потенциальными митогенными и антиапоптозными пептидами, могут продуцироваться опухолевыми клетками и клетками стромы опухолей. Высокий уровень IGF-I в сыворотке крови коррелирует с высоким риском рака толстой кишки, предстательной железы, мочевого пузыря, молочной железы. Повышенная экспрессия IGF-II участвует в качестве биомаркера риска колоректального рака. Выявлена связь между стимуляцией рецептора IGF-I и опухолевой прогрессией. Рецептор IGF-I широко сверхэкспрессируется во многих видах рака и способствует пролиферации раковых клеток, их адгезии и миграции, имеет решающее значение для выживания раковых клеток и метастазов, в том числе и в печени [7; 9].

В легких, напротив, через 2 недели метастазирования уровень обоих IGF снижается. Причиной этого явления может быть связь лигандов с рецепторами. Возможно, что разная динамика уровней IGF-I в печени и легких через 2 недели метастазирования связана с особенностями экспериментальных моделей, выбранных нами для исследований. В легкие опухолевые клетки поступали одномоментно и однократно. В печень клетки саркомы могли попадать из опухоли, растущей в селезенке, не один раз. Известно, что уровень IGF-I в крови зависит от действия на печень не только соматотропного гормона, но и половых стероидов, тиреоидных гормонов, глюкокортикоидов, инсулина. При этом инсулин, андрогены, эстрогены повышают секрецию IGF-I печенью, а глюкокортикоиды ее снижают [2]. В перспективе необходимо более полное исследование системы инсулиноподобных факторов роста при метастазировании в печень и легкие, включая рецепторы и белки-переносчики.

Процесс формирования метастазов приводил к увеличению ТGF-β1 в обоих органах: при метастазировании в печень его величина возрастала через 1 неделю эксперимента, в легких – через 2 недели. Установлено, что доминирование проонкогенной активности TGF - β1 реализуется посредством его участия в процессах эпителиально-мезенхимального перехода, ангиогенеза, а также в процессе формирования иммунной супрессии [1]. Известно, что TGF -β1 может усиливать пролиферацию и миграцию клеток гепатоцеллюлярной карциномы [10]. Следовательно, в печени формирование метастатических узлов начинается раньше и интенсивность этого процесса выше, чем в легких.

Заключение

Таким образом, динамика факторов роста на ранних стадиях развития метастазов в печени и легких имела как общие черты, так и отличия.

К общим ранним признакам метастазирования можно отнести отсутствие сдвигов IGF-I и изменение уровня IGF-II через 1 неделю метастазирования, а также увеличение содержания ТGF-β1 в обоих органах.

К отличительным - разнонаправленные сдвиги IGF-I через 2 недели и IGF-II на обоих сроках наблюдения, а также более позднее увеличение уровня ТGF-β1 в легких (через 2 недели метастазирования) по сравнению с печенью (через 1 неделю метастазирования).

 

Рецензенты:

 

Шихлярова А.И., д.б.н., профессор ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России, г. Ростов-на-Дону;

Непомнящая Е.М., д.м.н., профессор, главный научный сотрудник лаборатории иммунофенотипирования ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России, г. Ростов-на-Дону.