Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

LIMITED PROTEOLYSIS AND ITS INHIBITION IN ASCITIC FLUID IN OVARIAN CANCER AND TUBERCULOSIS OF THE UTERINE APPENDAGES

Frantsiyants E.M. 1 Moiseenko T.I. 1 Kozlova L.S. 1 Isakova F.S. 1
1 FSBI "Rostov scientific and research institute of oncology" of the Ministry of Health of Russia
Activity of trypsin-like enzymes, α2-macroglobulin (α2M) and α1-proteinase inhibitor (α1PI) with a sharp proteinase-inhibitor imbalance were found in the ascitic fluid (AF) in ovarian cancer (OC, n=26 – cystadenocarcinoma, T3-4N0M0) and tuberculosis of the uterine appendages (TUA, n=11), in comparison with the blood. In TUA, only plasminogen and plasmin with significant activation had a normal balance, while quantity of endogenous inhibitors was insufficient. High content of α2M and α1PI in AF in OC could be the result of ingress of proteins with modified characteristics from the tumor which prevented control of proteolysis. In OC, depletion and imbalance of kallikrein-kinin system (KKS) and fibrinolytic system (FS), even with a greater quantity of inhibitors, excluded protective and adaptive functions of KKS and FS making them damaging factors contributing to the malignant process spread.
inhibitors.
trypsin-like proteinases
ovaries
acsitic fluid

Неослабевающий интерес к особенностям метаболизма трипсиновых протеиназ, в частности компонентов калликреин-кининовой и фибринолитической систем (ККС и ФС), а также молекулярным механизмам взаимодействия между собой и с универсальными ингибиторами, объясняется их участием в регуляциимногих физиологических функций организма [3,8,9]. Калликреин считается центральным регулятором многих систем ограниченного протеолиза, но регуляторныйфермент может также стать причиной или участником патологических событий в организме [9,12]. Плазмин известен своей важной ролью в регуляции функций и плотности межклеточного матрикса, ангиогенезе, созревании половых клеток, санации полостей, тканей и жидкостей организма, развитии воспаления и злокачественных опухолей [3]. Универсальные ингибиторы α-2-макроглобулин (α2М) и α-1-протеиназный ингибитор (α1ПИ) регулируют активность протеолиза и являются молекулярной составляющей эндогенной защиты организма.

Асцитическая жидкость (АЖ) при различных заболеваниях яичников является ценной для изучения биологической средой поражённого организма, содержащей белкаоколо 20-50 г/л [1,2].

Асцит может развиться при любом воспалительном заболевании органов брюшной полости, но, вследствие быстротечности большинства таких патологий, выраженный и длительный асцит наблюдается только при туберкулезном перитоните [1]. В связи с этим для сравнения с АЖ, образующейся при асцитической форме рака яичников, нами использован подобный материал, полученный при операции по поводу туберкулёза придатков (ТП). Рак яичников (РЯ), в силу его тяжёлого течения и высокой смертности, является одной из наиболее агрессивных опухолей.У большинства больных РЯ заболевание в основном остаётся ограниченным брюшной полостью.ТП является типичным воспалительным заболеванием, для которого характерна экссудативная реакция [1].Часто АЖ, образующаяся при раке яичников, по внешнему виду и составу не отличается от экссудатов другого происхождения [1,7]. В представляемом исследовании также не было выявлено явных различий между двумя видами исследуемого материала.Ограниченный протеолиз и его ингибирование в асцитической жидкости ранее не исследовались.

Цель исследования: изучениепротеиназо-ингибиторного равновесия вАЖбольных раком яичников и туберкулёзом придатков для определения его роли в развитии заболеванийи точек приложения медикаментозной терапии.

Материалы и методы исследования

Во всех случаях получено письменное добровольное информированное согласие больных и этического комитета РНИОИ на использование операционного материала для научных исследований. ИзученаАЖ больных злокачественными опухолями яичников без лечения(n=26,цистаденокарциномы, T3-4N0M0), результаты сравнивали с полученнымив АЖбольных туберкулёзом придатков до лечения (ТП, n=11). Медиана возраста женщин составила 56,5±2,6 лет, все находились в различных периодах менопаузы. Внешнихразличий асцитической жидкости при указанных патологиях не отмечено: во всех случаях она была непрозрачной, в 29,3% случаев имелся лёгкий осадок, составляющий около 20-22% объёма. Розовый оттенок (геморрагическаясоставляющая) присутствовал примерно в 64-72%случаев при каждом заболевании. В нативной АЖ исследовали трипсиноподобные протеиназы и ингибиторы с последующим пересчётом на 1 мг белка в 1 мл (по Лоури).Кинетику ферментов ККС определяли спектрофотометрически по скорости гидролиза этилового эфира N-α-бензоил-L-аргинина и гиппурил-L-лизина;плазминоген, плазмин, α2М и α1ПИ - методами ИФА на стандартных тест-наборах. Для сравнения использовали плазму крови 32 практически здоровых доноров.Статистический анализ производили с помощью программы Statisticav.10и t-критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

            Исследование АЖ при РЯ и ТПпоказало наличие активности трипсиноподобных протеиназ и универсальных ингибиторов.По общей активности трипсиновых протеиназ (ОАТ) в АЖотличий практически не было, но активность калликреина (К) и плазмина (П), содержание их проферментов прекалликреина (ПК) и плазминогена (ПГ), активность кининазы 1 (карбоксипептидазы N, КПN), а также содержание ингибиторов α2М и α1ПИ достоверно различались (табл. 1).

Учитывая состав АЖ, мы сочли возможным сравнить полученные данные с плазмой крови (табл. 1,2), т.к. считается, что выпот происходит в основном из повреждённых воспалением сосудов [1,2,7]. В крови при злокачественных новообразованиях установлен дефицит прекалликреина [6], что может определять его низкое содержание и в АЖ (табл. 1). В ткани злокачественной опухоли количество ПК увеличивается, сравнительно с линией резекции [5], поэтому при тканевом выпоте в брюшную полость в АЖ неизбежно увеличилось бы и содержание прекалликреина.

Таблица 1

Компоненты кининовой системы, фибринолитической системы

и универсальные ингибиторы в асцитической жидкости

Исследуемые показатели

в пересчёте на 1 мг белка

в 1 мл жидкости

Плазма крови здоровых доноров

Туберкулёз придатков (M±m)

Злокачественная опухоль одного яичника (M±m)

Общий белок по Лоури г/л

72,13±5,2

55,04±3,21

59,98±3,31

ОАТ  ед/мг/мин

4,908±0,3

18,07±1,11

17,73±1,11

ПК     ед/мг/мин

4,889±0,3

3,589±0,21

2,068±0,1       1,2

К        ед/мг/мин

0,664±0,05

2,183±0,11

1,807±0,1       1,2

КПN  мкМ/мг/мин

0,011±0,001

0,011±0,001

0,014±0,001   1,2

ПГ     мкМ/мг 

0,027±0,002

0,070±0,0051

0,043±0,003   1,2

П       мкМ/мг

0,012±0,001

0,032±0,0021

0,073±0,005   1,2

α2М   мкМ/мг

0,059±0,004

0,042±0,0021

0,060±0,004   1,2

α1ПИ мкМ/мг

0,386±0,03

0,306±0,021

0,734±0,04     1,2

Таблица 2

Баланс протеиназ и ингибиторов в асцитической жидкости

Коэффициенты баланса 

Плазма крови здоровых доноров(M±m)

Туберкулёз придатков (M±m)

Злокачественная опухоль одного яичника(M±m)

К/ОАТ

0,14±0,01

12,1±0,81

10,2±0,6   1,2

ПК/К

7,4±0,5

1,6±0,11

1,1±0,1     1,2

К/КПN

60,4±3,8

195±10,31

129±6,8    1,2

ПГ/П

2,3±0,2

2,2±0,1

0,6±0,1     1,2

К/α2М

11,3±0,8

52,1±2,91

30,4±1,6   1,2

П/α2М   

0,2±0,01

1,3±0,11

0,9±0,1     1,2

ОАТ/α1ПИ 

12,7±0,9

59,1±3,51

24,2±1,4   1,2

Примечание для табл. 1 и 2: 1- достоверно, сравнительно с плазмой крови (р<0,01);

2 -достоверно относительно данных незлокачественного заболевания (р<0,05).

При цистаденокарциноме яичника, на III-IV стадиях, асцит является доминирующим синдромом [1,2,7]. Как и при туберкулезном перитоните, жидкость в одних случаях оказывается экссудатом, в других - транссудатом. Учитывая высокое содержание белка в исследуемой АЖ при обоих заболеваниях (табл. 1), очевидно следует считать её экссудатом. Для хронических туберкулёзных перитонитов характерным считается преобладание лимфоцитов в асцитической жидкости [1]. В условиях раковой интоксикации, в асцитической жидкости содержатся циркулирующие иммунные комплексы и множество белков, в основном изменённой конформации, которые не могут эффективно выполнять свои функции [2]. Этим же автором установлено, что до проведения специализированного лечения у больных раком яичников в сыворотке крови и в асцитической жидкости выявляются значительные метаболические нарушения.

При анализе активности ККС в АЖ становится очевидным, что баланс её компонентов (табл. 2) и при туберкулёзе придатков, и при раке яичников далёк от физиологического. Понятно, что нет возможности изучить нормальный баланс ККС в асцитической жидкости, поскольку уже само её присутствие в брюшной полости означает патологическое состояние. Однако в обстоятельном обзоре A. Pavlopoulouetal. [9] подчёркивается, что во всех тканях и жидкостях организмов любого уровня организации активных калликреинов в несколько раз меньше, чем их проферментов, причём цифры соотношения неактивной и активной форм тем выше, чем выше эволюционная ступень развития живого организма. В трудах Г.А. Яровой и других исследователей ККС неоднократно упоминается о том, что активность свободного калликреина крови в норме стремится к минимальным цифрам вплоть до нуля, значительно повышаясь лишь при патологии, тогда как содержание прекалликреина менее подвержено колебаниям, поскольку он является одним из факторов свёртывания, обязательным метаболитом стабильности эндотелия и межклеточного матрикса.В тканях, особенно железистых, активность калликреина и содержание прекалликреина могут быть несколько выше, т.к. они необходимы для нормального метаболизма [8].

Баланс ПК/К в АЖ, близкий к единице при ТП и РЯ (табл. 2), свидетельствует о значительном «перерасходе» запаса прекалликреина, сравнительно с плазмой крови, вплоть до его истощения, в связи с чем система ПК-К лишена возможности выполнять свои регуляторные и адаптивно-защитные функции.Соотношение скорости образования и распада свободных кининов (К/КПN,табл. 2) достоверно различалось в АЖ при злокачественном и незлокачественном заболеваниях яичников, причёмв последнем случае оно соответствовало данным плазмы крови.Это, по-видимому,связано с некоторыми различиями в содержании прекалликреина (табл. 1), полное истощение которого при РЯ могло сдерживать освобождение калликреина, даже при достаточном количестве активирующих факторов (белки, иммунные комплексы, раковые токсины, клетки крови и т.д.).При использовании одного субстрата в одинаковых условиях проведения реакции становится возможным оценитьпроцентное содержание калликреина в общей активности трипсиновых протеиназ. Это соотношение приведено в таблице 2 (К/ОАТ), и оно при раке яичниковбыло на 18,6% ниже (р<0,05), чем при туберкулёзе придатков,и в последнем случае достоверность различийс нормой крови не установлена, несмотря на значительно увеличенную активность обоих показателей (табл. 1). Следовательно, при РЯ в асцитической жидкости в большей степени, чем при ТП, активирован весь спектр трипсиновых протеиназ, в связи с чем снижалась доля калликреина в практически одинаковой ОАТ (табл. 1). Тем не менее, патологическая активация ККС считается опасной для любых тканей и жидкостей организма, поскольку многие калликреины вовлечены в разные стадии развития рака и его прогрессии[9].

Касательно ФС, установлено, что в АЖ при ТП содержание плазминогена выше, чем плазмина в 2,2 раза, а при РЯ коэффициент баланса ПГ/П составил 0,6 в связи с высоким содержанием плазмина и резким снижением количества профермента (табл. 1,2). 

При анализе изменений плазминогена и плазмина, очевидно, что их баланс при туберкулёзе придатков, несмотря на значительную активацию, близок к физиологическому.Такое же соотношение ПГ/П определяется, например, в крови доноров (табл. 2), в тканях интактных яичников и их доброкачественных опухолей[10].В АЖ при раке яичников ПГ меньше, чем П в 1,7 раза (табл. 1), что говорит о патологическом дисбалансе предшественник/фермент (ПГ/П, табл. 2). Повышенная активность плазмина характерна для крови, тканей и биологических жидкостей при злокачественных новообразованиях [4,6,10].Именно плазмин,кроме растворения фибрина, разжижает межклеточный матрикс, повреждает гистогематические барьеры и клеточные мембраны, является непосредственным активатором прекалликреина, трипсиногена, проэластазы и остальныхпроферментов сериновых протеиназ, в том числефакторов роста, а также матриксных металлопротеиназ, коллагеназ и др.[3].

Ингибиторная активность в АЖ при РЯ по α2М и α1ПИ была достоверно выше, чем при ТП (табл. 1). Баланс К/α2М и ОАТ/α1ПИ при РЯ оказался достоверно низким, относительно ТП (табл. 2), что объяснимо с точки зрения высокой активности α2М и α1ПИ при РЯ и небольшого запаса прекалликреина.Несмотря на это, баланс П/α2М при РЯ в 1,5 раза выше, чем при ТП в связи с большим содержанием плазмина.

При выраженном воспалительном процессе, всегда сопровождающем туберкулёз, экссудация происходит вследствие резкого повышения проницаемости гистогематических барьеров, как следствие усиления процесса выпота(фильтрации) плазмы крови и микровезикулярного транспорта. При злокачественных новообразованиях воспалительный процесс начинается на поздних стадиях, при некрозе участков опухоли и повреждении прилегающих тканей, диссеминации процесса с вовлечением в процесс больших участков микрососудистой сети. Выход жидкости и растворённых белков во всех случаяхосуществляется в местах соприкосновения эндотелиальных клеток. Фенестры увеличиваются при расширении сосудов, при сокращении контрактильных структур и округлении эндотелиальных клеток, что обусловлено прямым действием брадикинина [8].Как уже упоминалось, количество последнего в обоих случаях исследования АЖ было повышенным, судя по высокой активности калликреина (табл. 1) - абсолютно специфичной кининогеназы [8].Результатом экссудации является заполнение очага воспаления и интерстициальных пространств экссудатом. При сильном нарушении проницаемости, сопровождаемом разрушением стенки микрососуда, из плазмы выходят белки с высокой молекулярной массой (α2-глобулины, фибриноген)[1].

Таким образом, при ТП действие экзогенных этиологических факторов (микобактерии туберкулёза и их токсины), вызывая первичную альтерацию, приводит к длительному росту проницаемости микрососудов и воспалению с участием трипсиновых протеиназ и универсальных ингибиторов. В результате развивается некроз эндотелиальных клеток на уровне артериол небольшого диаметра, капилляров и венул, что ведет уже к стойкому повышению их проницаемости в очаге воспаления с выходом высокомолекулярных белков в интерстиций[1,7]. Сохранение нормального равновесия в системе ПГ-П АЖ, при высоком содержании компонентов, скорее подтверждает их активное участие в воспалительном процессе, чем свидетельствует о нормальном метаболизме.Биологический смысл экссудации состоит в отграничении очага через сдавление кровеносных и лимфатических микрососудов вследствие интерстициального отёка, а также в разведении факторов цитолиза в очаге воспаления для предотвращения избыточной альтерации[7].В этой связи возрастает необходимость санации интерстициальных пространств плазмином, протеиназой широкого спектра действия [3], при повышенной активности которого трудно провести грань между защитой и повреждением.

При РЯ истощение ККС и острый дисбаланс ФС, даже в присутствии большего количества ингибиторов, исключают защитно-адаптивные функции исследуемых систем в асцитической жидкости, обеспечиваютучастие их компонентов в патологическом процессе как повреждающих факторов, способствующих распространению злокачественного процесса[7-9,12].Значительное содержание в АЖ α2М и α1ПИ при РЯ может быть следствием их поступления не только из крови и ткани яичника, но и из злокачественной опухоли, что меняет их свойства и препятствует контролю протеолиза [11].

Заключение

Васцитической жидкости и при РЯ,и ТПобнаружены ферменты трипсинового типа и универсальные ингибиторы с резким нарушением протеиназо-ингибиторного баланса. Исключение составила активация системы ПГ-П, сохранившая нормальное соотношение «предшественник/фермент» при туберкулёзе придатков. Тем не менее в последнем случаенедостаточное количество эндогенных ингибиторов не может остановить развивающееся воспаление.

При раке яичников в АЖимеет местозначительнаяактивность системограниченного протеолиза и ингибиторовс качественным нарушением соотношения всехизученных показателей. Высокуюактивность плазмина при истощении профермента можно считать специфичной не только для агрессивной неоплазмы [4,10], но и для экссудата в брюшную полость при диссеминации рака яичников.Способность злокачественной опухоли секретировать не только ферменты, но и ингибиторы известна [11] и подтверждается нашими результатами. Это свидетельствует о серьёзномискаженииметаболических связей в ККС, ФС, обнаруженных в асцитической жидкости больных РЯ, а также их компонентов с системой универсальных ингибиторов и изменении статуса изученных систем с физиологическогона патологический.

Наличие ферментов ограниченного протеолиза, установленное в АЖ при ТП и РЯ, в частности трипсиновых протеиназ, а также универсальных ингибиторов (и первые, и вторые - обязательные участники воспаления), вполне ожидаемо и требует как системной, так и локальной медикаментозной коррекции экзогенными ингибиторами протеиназ даже после удаления АЖ, поскольку продолжающийся выпот будет обеспечивать новые поступления белков, в том числе ферментов, следовательно, и распространение патологического процесса.

Рецензенты:

Шихлярова А.И., д.м.н., профессор  ФГБУ РНИОИ МЗ РФ, г.Ростов на Дону;

Непомнящая Е.М., д.м.н., профессор ФГБУ РНИОИ МЗ РФ,  г.Ростов на Дону.