Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

INFLUENCE OF GAMMA RADIATION, LOW PRESSURE AND LOW TEMPERATURE ON VIABILITY OF MICROBIAL COMMUNITY OF THE GRAY SOIL AS ANALYTICAL MODEL OF MARTIAN REGOLITH

Cheptsov V.S. 1 Vorobeva E.A. 1, 2 Gorlenko M.V. 1 Manucharova N.A. 1 Pavlov A.K. 3 Vdovina M.A. 3 Lomasov V.N. 4 Zvyagintsev D.G. 1
1 Lomonosov Moscow State University
2 Space Research Institute of the Russian Academy of Sciences
3 Ioffe Physical-Technical Institute of the Russian Academy of Sciences
4 Saint-Petersburg State Polytechnical University
Astrobiology has set to researchers the questions about the limits of biological life and the its existence beyond the Earth. The viability of terrestrial organisms is studied in the low Earth orbit, and model experiments are conducted studying the influence of different physical and chemical factors on living organisms. Particular attention is paid to ionizing radiation as one of the most important space factors. Extraterrestrial environment and open space are characterized by the most extreme impacts on life. Life response in such conditions is poorly studied. Space research and laboratory modeling data give evidences that the stability of the Earth´s life forms surpasses existing ideas. The interaction of microorganisms with the mineral matrix in soil or meteorites, and their inherent ability to survive long-term stress may be estimated as necessary and sufficient properties of biological life for its distribution in the Solar System and beyond. The aim of this work was to study the combined effects of high doses of gamma radiation (100 kGy), low temperature (-50°C) and low pressure (1 torr) as the key parameters of the Martian soil and open space on the microbial community of the desert gray soil. It is shown that the extreme impact does not result in the death of the bacteria in situ, and causes changes in the physiological state of the cells while maintaining their abundance. Microbial community can be returned to its original state after changing the environmental conditions.
astrobiology
Mars
gamma radiation
microbial communities
soil

На сегодняшний день перед астробиологией стоит ряд вопросов, наиболее важными из которых являются проблемы происхождения жизни, пределы ее существования, возможность жизни на других планетах. В связи с этим проводятся модельные эксперименты, позволяющие выявлять разнообразные адаптационные возможности микроорганизмов за пределами планетного варьирования воздействующих физико-химических факторов в условиях, приближенных к конкретным целевым объектам астробиологии. Прогноз эволюции, потенциально возникшей на раннем этапе марсианской биосферы, необходимо подразумевает анализ воздействия в числе важнейших факторов ионизирующей космической радиации. В подповерхностных слоях грунта, недоступных ультрафиолету, этот фактор приобретает лимитирующий статус. Длительное его воздействия имеет следствием гибель клеток вследствие накопления смертельной дозы или, напротив, адаптивную эволюцию при наличии репаративных возможностей в клетках. Таким образом, для астробиологического прогноза возможности обнаружения биологической жизни в грунте Марса одним из ключевых является вопрос о предельных дозах ионизирующей радиации для микробных сообществ in situ.

Целью настоящей работы явилось изучение совместного воздействия гамма-излучения в дозе 100 кГр, низкой температуры (-50°С) и низкого давления (1 торр) как ключевых параметров марсианского грунта и открытого космоса на естественное бактериальное сообщество серозема из пустыни Негев (Израиль).

Материалы и методы

В работе использован образец серозема, отобранный в пустыне Негев вблизи г. Авдат (30°47'N/34°46'E) с глубины 5-10 см (горизонт А) [3]. Выбор объекта исследования обусловлен тем, что природные экстремальные местообитания Земли, в том числе почвы и породы пустынь, рассматриваются как земные аналоги марсианского реголита ввиду сходства ряда воздействующих факторов среды, таких как сильное высушивание, высокая инсоляция и др. [7].

Перед облучением навеску образца увлажняли стерильной водой и инкубировали в термостате при температуре 28°С в течение 10 суток с целью активации микробного сообщества, затем высушивали до воздушно-сухого состояния в течение суток при той же температуре. Для облучения образец помещали в ранее описанную климатическую камеру [8], позволяющую поддерживать давление 1 торр и температуру -50°С в течение всего времени облучения. Облучение проводили на гамма-установке К‑120000 с источниками 60Со при интенсивности излучения 1 кГр/ч. Контролем служил активированный необлученный образец. После облучения до проведения анализов образцы хранили при -18°С.

Определение численности культивируемых бактерий проводили методом посева на твердые питательные среды: глюкозо-пептоно-дрожжевую (ГПД) и ½ R2A («Difco», США). Перед посевом проводили десорбцию микроорганизмов на вортексе Heidolph Multi Reax в течение 30 мин при 2000 об./мин. Суспензии образцов в различных разведениях рассевали в трехкратной повторности с одновременным контролем стерильности среды и контролем присутствия воздушной микрофлоры. Культивирование проводили при температуре +28°С.

Общую численность прокариот в образцах определяли методом эпифлуоресцентной микроскопии (ЭФМ) с акридином оранжевым. Десорбцию клеток проводили с помощью ультразвука (22 кГц, 0.4 А, 2 мин). Препараты готовили в шестикратной повторности и фиксировали нагреванием, затем окрашивали и просматривали на микроскопе Биомед-6 ПР ЛЮМ при увеличении ×700 по 20 полей зрения для каждой повторности. Учитывали клетки с зеленым свечением. Численность прокариот рассчитывали по формуле N=(S1×a×n)/(V×S2×c), где N - число клеток в 1 г почвы; S1 - площадь препарата (мкм2); a - количество клеток в поле зрения; n - показатель разведения; V - объем капли, наносимой на стекло (мл); S2 - площадь поля зрения микроскопа (мкм2); с - навеска почвы (г).

Оценку численности отдельных групп микроорганизмов в исследуемых образцах проводили с помощью метода флуоресценции in situ гибридизации с рРНК-специфичными флуоресцентно мечеными олигонуклеотидными зондами (FISH-fluorescent in situ hybridization). В настоящей работе были применены зонды ARCH915 и EUB338 («Синтол», Россия), специфичные для представителей доменов Archaea и Bacteria соответственно. Анализ проводили по методике, описанной ранее [2]. Препараты просматривали на люминесцентном микроскопе ZEISS Mikroskop Axioskop 2 plus со светофильтрами Filter set15 по 64 поля зрения. Учитывали бактерии с красным свечением. Численность клеток рассчитывали по формуле N=(S1×a×n)/(V×S2×c), где N - число клеток в 1 г почвы; S1 - площадь препарата (мкм2); a - количество клеток в поле зрения; n - показатель разведения; V - объем капли, наносимой на стекло (мл); S2 - площадь поля зрения микроскопа (мкм2); с - навеска почвы (г).

Оценку функционального состояния микробных сообществ в исследуемых образцах почвы проводили на основе спектров потребления органических субстратов методом мультисубстратного тестирования (МСТ) [1]. Навески почвы массой 0,3 г помещали в центрифужный стаканчик, заливали дистиллированной водой (1:100), десорбировали клетки с помощью ультразвука (22 кГц, 0,4 А, 2 мин), затем осаждали минеральные частицы центрифугированием (2000g, 2 мин). К выделенной фракции микробного сообщества добавляли индикатор потребления субстратов (соль тетразолия), перемешивали и вносили по 200 мкл в каждую лунку 96-луночного планшета «Эко-Лог©», содержащего набор из 47 тест-субстратов в двух повторностях [1]. Планшеты инкубировали в термостате при 28°С в течение 72 ч. После окончания инкубации фотометрически считывали оптическую плотность ячеек в диапазоне 510 нм и на основании полученных данных с помощью программного обеспечения «Эко-Лог©» вычисляли массив коэффициентов функционального биоразнообразия исследуемого микробного сообщества, являющихся характеристическими признаками его состояния [1].

Статистическую обработку данных проводили с помощью программ STATISTICA 8.0 и Microsoft Office Excel 2007.

Результаты и обсуждение

После облучения численность аэробных гетеротрофных бактерий, способных к росту и размножению на питательных средах (КОЕ/г), снизилась с 9,5×107 до 6,4×106 кл/г и с 1×108 до 3,8×107 кл/г на средах ГПД и ½ R2A соответственно, однако сохранилась на высоком уровне. Важно отметить высокое биоразнообразие бактериальных сообществ в облученных образцах. Общая численность прокариот, учитываемая методом эпифлуоресцентной микроскопии (ЭФМ), практически не изменилась (8,3×108 и 6,7×108 кл/г) (рис. 1). Проведенный FISH-анализ показал присутствие в составе микробных сообществ контрольного и облученного образцов архей и бактерий. Применение FISH-анализа подтвердило данные ЭФМ об отсутствии ингибирующего эффекта с точки зрения общего обилия прокариот в образце при воздействии ионизирующего излучения в высокой дозе. Кроме того, выявлено, что бактериальные и архейные сообщества in situ находятся преимущественно в метаболически активном состоянии. После воздействия на образец гамма-излучения отмечено увеличение численности метаболически активных клеток обеих рассматриваемых групп микроорганизмов в 2-2,5 раза (рис. 2), при этом несколько возросла доля архей в прокариотном комплексе (с 11% до 14%). Такой результат указывает на то, что до облучения часть клеток находилась в покоящемся состоянии и данным методом не обнаруживалась. Активизация клеток вызвана стрессовым воздействием и, по-видимому, связана с активной репарацией полученных повреждений. При этом, несмотря на увеличение содержания активных клеток, количество КОЕ снижалось, т.е. часть фиксируемых прямым методом метаболически активных клеток бактерий перестала культивироваться на используемых питательных средах, что может быть связано как с нарушением генеративных механизмов, так и с изменением функциональных физиологических свойств отдельных популяций. На основании полученных данных можно заключить, что совокупное воздействие гамма-излучения в высокой дозе 100 кГр, низкой температуры и низкого давления не приводит к гибели прокариотных комплексов почв и осадочных пород, но вызывает изменение их репродуктивной и метаболической активности. При воздействии совокупности стрессовых факторов отдельные популяции переходят в некультивируемое, но метаболически активное состояние, что является защитной реакцией на стрессовое воздействие.

Рис. 1. Влияние гамма-излучения (100 кГр), низкой температуры (–50°С) и низкого давления (1 торр) на численность прокариот в образце серозема. КОЕ/г, ГПД – синий; КОЕ/г, ½ R2A – зеленый; общая численность прокариот (кл/г), ЭФМ – красный. Значение погрешности соответствует стандартному отклонению

Рис. 2. Влияние гамма-излучения (100 кГр), низкой температуры (–50°С) и низ­кого давления (1 торр) на численность мета­болически активных клеток бактерий и архей в образце серозема (FISH). Археи, кл/г – синий; бактерии, кл/г – красный. Значение по­грешности соответствует стандартному отклонению

Примененное воздействие способствовало изменению функционального состояния микробного сообщества in situ. После облучения снизились удельная метаболическая работа, интегральный показатель общего благополучия системы и индекс Шеннона, произошло значительное сужение спектра потребляемых субстратов (табл. 1). Сократилась ассимиляция всех номинальных групп субстратов, при этом наиболее заметно снижение потребления гексоз (на 84%) и спиртов (на 71%) (рис. 3). Однако коэффициент рангового распределения спектров потребления субстратов, отражающий степень нагрузки на сообщество и возможность его восстановления, практически не изменился и был равен 0,485, что характерно для систем с истощенными ресурсами или находящихся под обратимым воздействием какого-либо нарушающего фактора [1].

Таким образом, при воздействии на микробное сообщество серозема гамма-излучения в дозе 100 кГр в сочетании с давлением 1 торр и температурой –50оС функциональное состояние его несколько ухудшилось, произошла перестройка его метаболизма, однако сохранились высокий потенциал бактериальной биомассы, ее разнообразия и возможность восстановления и нормального функционирования сообщества.

Таблица 1

Параметры функционального состояния микробного сообщества серозема до и после воздействия модельных условий.

Параметр функционального состояния микробного сообщества

Образец

Контрольный

Облученный

Коэффициент рангового распределения спектров потребления субстратов, d

0,449

0,485

Количество потребляемых субстратов, N

24

14

Удельная метаболическая работа, W

1754,4

1203,9

Выравненность, E

0.99

0,98

Индекс Шеннона, H

4.52

3.73

Интегральный показатель общего благополучия системы, G

113,7

61,4

Рис. 3. Потребление номинальных групп субстратов сообществом образца SN до и после воздействия гамма-излучения (100 кГр), низкого давления (1 торр) и низкой температуры (‑50°С). Контрольный образец – синий; облученный образец – красный. П — пентозы; Г — гексозы; О — олигосахара; С — спирты; А — аминокислоты; ОК – соли органических кислот; ПМ — полимеры; АН – амиды, нуклеозиды

Заключение

Природный грунт представляет собой сложную гетерогенную и гетерофазную среду обитания микроорганизмов. Распределение микробной биомассы и воздействие физико-химических факторов в такой среде имеют дискретный неравномерный характер. Микроорганизмы обладают различной генетически обусловленной радиорезистентностью, но также механизмами переживания стресса и адаптации. Вступая во взаимодействие с гетерогенной средой, микробные популяции и сообщества приобретают дополнительные шансы стабилизации, способность не ограниченного временем существования и функционирования в наиболее экстремальных условиях Земли (Vorobyova et al., 1997).

Моделирование множественного экстремального воздействия позволяет рассмотреть потенциальные возможности биологической активности природного грунта (почвы, породы) с превышением земных условий и приближением к условиям инопланетным (Марс) или космической среды. Проведенное исследование показало, что воздействие гамма-излучения в дозе 100 кГр в условиях низкого давления и низкой температуры не только не приводит к гибели микробного сообщества, но фактически не влияет на общую численность прокариот и содержание способных к росту и размножению аэробных гетеротрофных бактерий. Ранее сообщалось о культивировании бактерий из почв, облученных гамма-излучением в дозах вплоть до 65 кГр [6]. Наиболее радиорезистентные виды бактерий, такие как Deinococcus radiodurans и Rubrobacter radiotolerans, в чистой культуре устойчивы к воздействию гамма-излучения в дозах до 25 кГр [4, 5], а при понижении температуры во время облучения до –79оС Deinococcus radiodurans сохраняет жизнеспособность при воздействии доз до 80 кГр [4]. Сведения о сохранении бактериями жизнеспособности после облучения гамма-излучением в дозах более 80 кГр на данный момент отсутствуют. Исследование свидетельствует лишь о некоторых изменениях в метаболической активности клеток и функциональном состоянии сообщества при сохранении возможности его восстановления. Такой результат может быть объяснен как протекторной ролью природной гетерофазной среды по отношению к иммобилизованным в органоминеральной матрице клеткам, так и условиями облучения, в первую очередь низкотемпературным режимом [4].

Полученные данные подтверждают возможность длительного выживания микроорганизмов в приповерхностном слое марсианского реголита в случае формирования на раннем Марсе биосферы земного типа. Исследование дает основания и для подтверждения вероятности сохранения и переноса жизнеспособных микроорганизмов в космическом пространстве.

Результаты исследования могут быть учтены при планировании миссий к Марсу с астробиологическими задачами. Авторы благодарят Р. Энджела и О.Р. Коцюрбенко за предоставленные образцы аридных почв.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 13-04-01982) и Программы РАН «Эволюция органического мира и планетарных процессов» (подпрограмма 2).

Рецензенты:

Степанов А.Л., д.б.н., профессор кафедры биологии почв факультета почвоведения ФГБОУ ВО «Московский Государственный университет им. М.В. Ломоносова», г. Москва;

Чернов И.Ю., д.б.н., профессор, заведующий кафедрой биологии почв факультета почвоведения ФГБОУ ВО «Московский Государственный университет им. М.В. Ломоносова», г. Москва.