Известно, что нефункциональные нуль-аллели локусов Wx-A1, Wx-B1 и Wx-D1 Waxy-генов пшеницы имеют прямое влияние на образование крахмала амилопектинового типа, где наиболее существенное снижение содержания амилозы оказывает хозяйственно-ценный нулевой аллель Wx-B1-локуса – Wx-B1b, идентификация которого диагностически значима [9]. А с учетом положительного влияния аллельных вариантов Glu-D1d (5+10) и Glu-A1b (Ax2*) HMW-GS на повышение мукомольно-хлебопекарных качеств, конкурентного преимущества Glu-A1b над Glu-A1a (Ax1), и отрицательного влияния аллелей Glu-D1a (2+12) и Glu-A1c (Axnull), приводящих к снижению хлебопекарных свойств пшеницы, одной из наиболее хозяйственно-ценных комбинаций HMW субъединиц глютенинов, ассоциированных с высокими качествами зерна, является желаемая для селекции комбинация Ax2*/5+10 [4].
Развитие высокоточных подходов к оценке аллельного полиморфизма Waxy-генов и HMW субъединиц глютенинов пшеницы на основе молекулярно-генетических методов диагностики – востребованная для маркер-вспомогательной селекции область исследования, достоверность генотипирования в которой является фактором, предопределяющим эффективность селекционной работы.
Основной целью настоящей работы являлось изыскание молекулярных подходов к идентификации генотипов Triticum aestivum L. по аллельным вариантам Waxy-генов и HMW субъединиц глютенинов для маркер-вспомогательной селекции сортов яровой пшеницы с высокими мукомольно-хлебопекарными и технологическими свойствами зерна.
Материалы и методы исследования
Молекулярно-генетическим исследованиям было подвергнуто 70 образцов яровой пшеницы селекции ТатНИИСХ на предмет идентификации генотипов по аллельным вариантам Waxy-генов и HMW субъединиц глютенинов методами ПЦР, ПЦР-ПДРФ и прямого секвенирования амплифицированной ДНК.
Экстракция геномной ДНК из зерновок яровой пшеницы молочно-восковой спелости осуществлена коммерческим набором «ДНК-сорб С» («ЦНИИ эпидемиологии», Россия).
Амплификация геномной ДНК выполнена на термоциклерах «Терцик» («ДНК-технология», Россия), «PTC-200» («MJ Research», Канада) и «MyCycler» с градиентом («Bio-Rad», США), с последующим проведением, в ряде случаев, этапа ПДРФ-анализа.
Перечень использованных праймеров и условия проведения ПЦР- и ПЦР-ПДРФ-анализа для идентификации аллелей генов Waxy и HMW-GS представлены в таблице 1.
Таблица 1
Перечень использованных праймеров и условия проведения ПЦР-
и ПЦР-ПДРФ-анализа для идентификации аллелей генов Waxy и HMW-GS
Наименования праймеров и их нуклеотидные последовательности |
Локус |
Режимы ПЦР-амплификации |
ПДРФ-анализ |
4F: 5/-AAGAGCAACTACCAGT-3/ 4R: 5/-TCGTACCCGTCGATGAAGTCGA-3/ |
Wx-A1 Wx-B1 Wx-D1 |
×1: 94 0С – 4 мин. ×40: 94 0С – 30 сек, 58 0С – 30 сек, 72 0С – 30 сек. ×1: 72 0С – 7 мин. |
AcsI 50 0C 3 часа |
4F-c: 5/-CCCCCAAGAGCAACTACCAGT-3/ 4R: 5/-TCGTACCCGTCGATGAAGTCGA-3/ |
Wx-A1 Wx-B1 Wx-D1 |
×1: 94 0С – 4 мин. ×40: 94 0С – 30 сек, 64 0С – 30 сек, 72 0С – 30 сек. ×1: 72 0С – 7 мин. |
AcsI 50 0C 3 часа |
Wx-A1L: 5/-CCCCAAAGCAAAGCAGGAAAC-3/ Wx-A1R: 5/-CGGCGTCGGGTCCATAGATC-3/ |
Wx-A1 |
×1: 94 0С – 4 мин. ×40: 94 0С – 45 сек, 55 0С – 30 сек, 72 0С – 1 мин. ×1: 72 0С – 7 мин. |
HindIII 37 0C 3 часа |
Wx-A2L: 5/-CGCAGGGGAAGACGTGGT-3/ Wx-A2R: 5/-CGTTGACGATGCCGGTGATC-3/ |
Wx-A1 |
×1: 94 0С – 4 мин. ×40: 94 0С – 30 сек, 65 0С – 30 сек, 72 0С – 30 сек. ×1: 72 0С – 7 мин. |
|
Wx-B1L: 5/-CGCAGGGGAAGACGTGGT-3/ Wx-B1R: 5/-CGTTGACGATGCCGGTGATG-3/ |
Wx-B1 |
×1: 94 0С – 4 мин. ×40: 94 0С – 45 сек, 65 0С – 40 сек, 72 0С – 50 сек. ×1: 72 0С – 7 мин. |
|
Wx-B1L: 5/-CGCAGGGGAAGACGTGGT-3/ Wx-B2R: 5/-CGTTGACGATGCCGGTGTTG-3/ |
Wx-B1 |
×1: 94 0С – 4 мин. ×40: 94 0С – 45 сек, 65 0С – 40 сек, 72 0С – 50 сек. ×1: 72 0С – 7 мин. |
|
Wx-D1L: 5/-GCCGACGTGAAGAAGGTGGTG-3/ Wx-D1R: 5/-CCCCTTGCGTCATTTGTTGTGT-3/ |
Wx-D1 |
×1: 94 0С – 4 мин. ×40: 94 0С – 45 сек, 55 0С – 30 сек, 72 0С – 1 мин. ×1: 72 0С – 7 мин. |
|
UMN19F: 5/-CGAGACAATATGAGCAGCAAG-3/ UMN19R: 5/-CTGCCATGGAGAAGTTGGA-3/ |
Glu-A1 (Ax1/Axnull, Ax2*) |
×1: 94 0С – 4 мин. ×40: 94 0С – 30 сек, 60 0С – 30 сек, 72 0С – 30 сек. ×1: 72 0С – 5 мин. |
HaeIII 37 0C 3 часа |
Axnull-F: 5/-ACGTTCCCCTACAGGTACTA-3/ Axnull-R: 5/-TATCACTGGCTAGCCGACAA-3/ |
Glu-A1 (Axnull) |
×1: 94 0С – 4 мин. ×40: 94 0С – 1 мин, 58 0С – 1 мин, 72 0С – 1 мин. ×1: 72 0С – 7 мин |
|
UMN25F: 5/-GGGACAATACGAGCAGCAAA-3/ UMN25R: 5/-CTTGTTCCGGTTGTTGCCA-3/ |
Glu-D1 (Dx2, Dx5) |
×1: 94 0С – 4 мин. ×40: 94 0С – 30 сек, 60 0С – 30 сек, 72 0С – 30 сек. ×1: 72 0С – 5 мин. |
HaeIII 37 0C 3 часа |
Dx5-1: 5/-GCCTAGCAACCTTCACAATC-3/ Dx5-2: 5/-GAAACCTGCTGCGGACAAG-3/ |
Glu-D1 (Dx2, Dx5) |
×1: 94 0С – 4 мин. ×40: 94 0С – 30 сек, 63 0С – 30 сек, 72 0С – 30 сек. ×1: 72 0С – 5 мин. |
|
UMN26F: 5/-CGCAAGACAATATGAGCAAACT-3/ UMN26R: 5/-TTGCCTTTGTCCTGTGTGC-3/ |
Glu-D1 (Dy10, Dy12) |
×1: 94 0С – 4 мин. ×40: 94 0С – 30 сек, 60 0С – 30 сек, 72 0С – 30 сек. ×1: 72 0С – 7 мин. |
HaeIII 37 0C 3 часа |
Dy10/12-F: 5/-GTTGGCCGGTCGGCTGCCATG-3/ Dy10/12-R: 5/-TGGAGAAGTTGGATAGTACC-3/ |
Glu-D1 (Dy10, Dy12) |
×1: 94 0С – 4 мин. ×40: 94 0С – 30 сек, 65 0С – 30 сек, 72 0С – 30 сек. ×1: 72 0С – 5 мин. |
|
Детекция результатов ПЦР- и ПЦР-ПДРФ-анализа выполнена методом горизонтального электрофореза в 2–3 % агарозном геле в буфере ТBE (рН 8,0), содержащем этидий бромид с последующей визуализацией результатов в ультрафиолетовом трансиллюминаторе (λ=310 нм).
Размеры фрагментов ДНК оценены по подвижности в сравнении со стандартными ДНК маркерами.
В работе использованы реактивы для молекулярно-биологических исследований производства ООО «СибЭнзим» (Россия) и ООО «Биотех-Индустрия» (Россия).
Секвенирование продуктов амплификации Wx-A1-локуса Waxy-гена линий яровой пшеницы Kk-71/06-3 (GenBank A/N: JX649155), Kk-11/06-10 (GenBank A/N: JX649156), Kk-11/06-11 (GenBank A/N: JX649157) и Kk-69/06-1 (GenBank A/N: JX649158) селекции ТатНИИСХ проведено на генетическом анализаторе «ABI PRISM 3100» (Applied. Biosystems, США) в НПК «Синтол» (Россия).
Выравнивание частичных нуклеотидных последовательностей аллельных вариантов генов Waxy и HMW-GS: CLUSTAL W (v. 1.83) и BLAST.
Результаты исследования и их обсуждение
Одним из подходов к идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы является общепринятый способ проведения ПЦР с олигонуклеотидными праймерами 4F: 5/-AAGAGCAACTACCAGT-3/ и 4R: 5/-TCGTACCCGTCGATGAAGTCGA-3/, инициирующими амплификацию соответствующих аллельспецифичных продуктов Wx-A1-, Wx-B1- и Wx-D1-локусов [5, 7].
Существенным недостатком данного способа проведения ПЦР является невозможность идентификации нуль-аллеля Wx-B1b от активного аллеля Wx-B1e, а также трудность дискриминации Wx-A1a от Wx-A1g.
Для более эффективной аллельной дискриминации Waxy-генов, нами был разработан оригинальный способ ПЦР- и ПЦР-ПДРФ-генотипирования, отличающийся от прототипа тем, что на этапе ПЦР используют другой прямой праймер 4F-с: 5/-СССССAAGAGCAACTACCAGT-3/, и после этапа ПЦР проводят процедуру ПДРФ-анализа с эндонуклеазным расщеплением ампликонов рестриктазой AcsI.
В части аллельной дискриминации Wx-A1g от Wx-A1a, оригинальность разработанного нами способа генотипирования заключается в реконструкции прямого праймера 4F путем наращивания его 5/-концевого участка пятизвенным oligo (dC)5 блоком, для выравнивания температур плавлений реконструированного (4F-c) и обратного (4R) праймеров с целью подбора оптимальной температуры отжига, равной 64 0C. А принцип дискриминации данных аллелей основан на учете, как отсутствия ПЦР-продукта размером 262 bp в разработанном нами способе генотипирования с праймерами 4F-c и 4R (рис. 1a, треки 5-7), так и наличия амплифицированного фрагмента локуса Wx-A1g размером 257 bp в постановке ПЦР с праймерами 4F и 4R (рис. 1b, треки 5-7).
Рис. 1. Электрофореграмма технического результата предложенного способа проведения ПЦР и прототипа для комплексной идентификации
аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы
Обозначения: a) Предложенный способ проведения ПЦР (праймеры 4F-c + 4R). b) Прототип (праймеры 4F + 4R). М) ДНК-маркеры 100 bp + 1,5 kb (СибЭнзим); 1-9) генотипы Triticum aestivum L с комбинациями Wx-аллелей: 1-4) Wx-A1a/B1a/D1a; 5-7) Wx-A1g/B1a/D1a; 8-9) Wx-A1a/B1b/D1a.
Таким образом, сочетанием общепринятого и предложенного нами способов генотипирования достигается точность ДНК-анализа в части эффективной аллельной дискриминации Wx-A1g, как от нуль-аллеля Wx-A1b, так и активного аллеля Wx-A1a Waxy-гена. А для эффективной дискриминации нулевого аллеля Wx-B1b от функционального аллеля Wx-B1e, нами были подобраны условия ПЦР-ПДРФ-анализа с праймерами 4F-c + 4R и эндонуклеазным расщеплением рестриктазой AcsI, приводящие к образованию аллельспецифичных профилей, в частности, с характерным для Wx-B1b-аллеля отсутствием ПДРФ-фрагмента размером 84 bp (рис. 2 a, треки 8-9), или наличием неразрезанного ПЦР-продукта локуса Wx-B1e-аллеля длиной 266 bp из-за отсутствия у него соответствующего сайта рестрикции (R↑AATTY).
Рис. 2. Электрофореграмма результата предложенного способа проведения ПЦР-ПДРФ для комплексной идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы
Обозначения: a) Праймеры 4F-c + 4R. b) Праймеры 4F + 4R. М) ДНК-маркеры 50-100 bp (СибЭнзим). 1) ПЦР-профиль генотипа Triticum aestivum L с комбинацией аллелей Wx-A1a/B1a/D1a; 2-9) AcsI-ПЦР-ПДРФ-профили генотипов Triticum aestivum L с комбинациями Wx-аллелей: 2-4) Wx-A1a/B1a/D1a; 5-7) Wx-A1g/B1a/D1a; 8-9) Wx-A1a/B1b/D1a.
Следует отметить, что технический результат, выраженный в эффективной интерпретации образующихся ПЦР-продуктов (рис. 1) и ПЦР-ПДРФ-фрагментов (рис. 2), был полностью сопоставим с расчетными данными, которые в свою очередь были получены, исходя из анализа выравниваний нуклеотидных последовательностей аллельных вариантов Waxy-генов Triticum aestivum L., AcsI-рестрикционного картирования и расчета генерируемых ПЦР- и AcsI-ПЦР-ПДРФ-профилей (рис. 3).
Рис. 3. Выравнивание фланкируемых с праймерами 4F-c + 4R [4F + 4R] нуклеотидных последовательностей аллельных вариантов Waxy-генов Triticum aestivum L.,
AcsI-рестрикционное картирование и расчет AcsI-ПЦР-ПДРФ-профилей
Разработанный нами способ проведения ПЦР и ПЦР-ПДРФ для идентификации аллельных вариантов waxy-генов пшеницы является изобретением, на которое получен патент Российской Федерации (патент на изобретение RU 2 528 748 C1, опубликовано: 20.09.2014. Бюл. № 26).
Помимо комплексного подхода к идентификации аллельных вариантов одновременно по всем трем локусам Waxy-генов пшеницы, для обоснования достоверности заключения ДНК-тестов дополнительно были протестированы способы генотипирования по отдельно взятым локусам Waxy-генов пшеницы [7, 8] с праймерами: Wx-A1L + Wx-A1R и Wx-A2L + Wx-A2R (Wx-A1-локус), с использованием последних также в качестве сиквенсных при расшифровке частичных нуклеотидных последовательностей Wx-A1а- и Wx-A1g-аллелей; Wx-B1L + Wx-B1R и Wx-B1L + Wx-B2R (Wx-В1-локус), Wx-D1L + Wx-D1R (Wx-D1-локус).
Использованный же в работе праймер Wx-B2R является модифицированным нами аналогом Wx-B1R, отличающимся от прототипа «mismatch-нуклеотидом» в третьей позиции с 3/-конца олигонуклеотида, обеспечивающим корректную ПЦР-идентификацию аллельных вариантов Wx-B1-локуса Waxy-гена пшеницы.
Таким образом, при апробации вышеохарактеризованных общепринятых и разработанных нами способов генотипирования на образцах яровой пшеницы селекции ТатНИИСХ удалось провести их молекулярно-генетическую оценку на предмет идентификации генотипов по аллельным вариантам Waxy-генов, в результате которой было установлено, что из 70 происследованных образцов подавляющее большинство растений по классификации типов пшеницы с различным содержанием Waxy-генов относились к 1-му дикому типу (Wx-A1a/B1a/D1a = 65 растений, 92,8 %; Wx-A1g/B1a/D1a = 3 линии, 4,4 %), а 2 линии: Кк-8/06-6 и О-192/03-5 (2,8 %) принадлежали к 3-му типу пшеницы с совокупной комбинацией аллельных вариантов Wx-A1a/B1b/D1a (табл. 2).
Подытоживая результаты молекулярно-генетической оценки 70 образцов яровой пшеницы селекции ТатНИИСХ на предмет идентификации генотипов по аллельным вариантам Waxy-генов, можно вывести заключение, что наиболее перспективными генотипами, рассматриваемыми в качестве исходного материала для дальнейшей селекционной работы по созданию сортов с крахмалом амилопектинового типа являются две линии-носители нулевого Wx-B1b-аллеля (Кк-8/06-6 и О-192/03-5) с последующим введением в их геномы Wx-A1b- и (или) Wx-D1b-аллелей путем скрещивания с соответствующими донорами нуль-аллелей по локусам Waxy-генов пшеницы.
Таблица 2
Молекулярно-генетическая оценка Triticum aestivum L селекции ТатНИИСХ по генам Waxy и HMW-GS
№ п. п. |
Сорт/линия |
Waxy |
HMW-GS |
№ п. п. |
Сорт/линия |
Waxy |
HMW-GS |
||||||||||||||||||||
A1 |
B1 |
D1 |
A1 |
D1 |
A1 |
B1 |
D1 |
A1 |
D1 |
||||||||||||||||||
a |
b |
g |
a |
b |
e |
a |
b |
Ax1 |
Ax2* |
5+10 |
2+12 |
a |
b |
g |
a |
b |
e |
a |
b |
Ax1 |
Ax2* |
5+10 |
2+12 |
||||
1 |
Казанская Юбилейная |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
+ |
36 |
Казанская Юбилейная (неполег.) |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
+ |
2 |
К-109/02-5 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
+ |
37 |
К-23/00-3 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
+ |
– |
3 |
Экада 97 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
+ |
38 |
К-414/01-1 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
+ |
– |
+ |
– |
4 |
К-100/03-2 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
+ |
– |
39 |
К-21/00 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
+ |
– |
5 |
К-18/03-8 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
+ |
– |
40 |
К-58/01-2 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
+ |
– |
6 |
К-68/04-5 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
+ |
– |
41 |
K-48/04-2 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
+ |
– |
7 |
К-130/04-10 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
+ |
– |
42 |
K-106/01-2 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
+ |
8 |
Злата |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
+ |
– |
43 |
K-101/04-3 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
+ |
– |
9 |
К-88/02-19 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
+ |
– |
44 |
K-112/04-2 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
+ |
– |
+ |
– |
10 |
К-6/01-2 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
+ |
– |
45 |
K-134/04-19 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
+ |
– |
+ |
– |
11 |
К-5/03-6 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
+ |
46 |
К-51/00-3 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
+ |
– |
+ |
– |
12 |
К-48/03 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
+ |
– |
+ |
– |
47 |
K-133/05-5 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
+ |
– |
13 |
К-100/03-8 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
+ |
48 |
K-57/05-6 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
+ |
– |
+ |
– |
14 |
К-21/02-5 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
+ |
49 |
К-117/04-4 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
+ |
– |
15 |
К-46/04-9 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
+ |
– |
50 |
К-12/04 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
+ |
16 |
К-68/04-1 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
+ |
– |
51 |
К-99/05-2 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
+ |
17 |
К-23/04-1 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
+ |
– |
52 |
Кк-8/06-1 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
+ |
18 |
К-49/04 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
+ |
– |
+ |
– |
53 |
Кк-71/06-3 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
+ |
– |
19 |
К-7/04-2 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
+ |
– |
54 |
Кк-8/06-6 |
+ |
– |
– |
– |
+ |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
+ |
20 |
Экада 113 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
+ |
55 |
Кк-75/06-3 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
+ |
– |
21 |
Экада 109 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
+ |
– |
56 |
Кк-11/06-11 |
– |
– |
+ |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
+ |
– |
22 |
К-93/05-2 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
+ |
– |
+ |
– |
57 |
Кк-11/06-10 |
– |
– |
+ |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
+ |
– |
23 |
К-29/02-5 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
+ |
– |
+ |
– |
58 |
Кк-69/06-4 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
+ |
24 |
К-109/02-13 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
|
+ |
59 |
Кк-6/07-2 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
+ |
– |
25 |
К-20/02-2 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
+ |
– |
60 |
Кк-69/06-1 |
– |
– |
+ |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
+ |
26 |
К-73/03-4 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
+ |
– |
61 |
Кк-71/06-8 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
+ |
– |
27 |
К-68/04-4 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
+ |
– |
62 |
Кк-75/06-5 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
+ |
28 |
К-100/03-9 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
+ |
63 |
О-192/03-5 |
+ |
– |
– |
– |
+ |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
+ |
29 |
К-7/04-1 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
+ |
64 |
О-25/05-2 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
|
+ |
– |
+ |
30 |
К-65/05-2 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
+ |
– |
+ |
– |
65 |
О-206/05-2, |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
+ |
– |
+ |
– |
31 |
К-11/04-8 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
+ |
66 |
О-186/04-1 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
+ |
– |
32 |
Экада 66 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
+ |
– |
67 |
О-464/02-2 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
+ |
33 |
К-27/00-2 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
+ |
– |
68 |
О-513/00-21 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
+ |
– |
– |
+ |
34 |
К-65/05-1 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
+ |
– |
+ |
– |
69 |
Эр.255/00-3-1 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
+ |
35 |
Симбирцит |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
+ |
– |
70 |
О-28/05-2 |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
– |
+ |
– |
+ |
Примечание: |
+ |
– наличие соответствующего аллеля |
– |
– отсутствие соответствующего аллеля |
Следующим этапом исследования являлась апробация разработанного нами способа проведения ПЦР-ПДРФ для идентификации аллельных вариантов Glu-A1- и Glu-D1-локусов HMW субъединиц глютенинов пшеницы, ближайшим аналогом которого послужил способ генотипирования, предложенный Лиу с соавт. в 2008 г. [4].
Прототип заявленного способа генотипирования, предусматривающий идентификацию аллельных вариантов HMW субъединиц глютенинов пшеницы с тремя наборами праймеров: UMN19F + UMN19R (Ax1/Axnull- и Ax2*-аллели), UMN25F + UMN25R (Dx2- и Dx5-аллели) и UMN26F + UMN26R (Dy10- и Dy12-аллели), в основном был рассчитан авторами на детекцию полученных результатов ПЦР преимущественно методами капиллярного или вертикального гель-электрофореза в ПААГ [4].
Отличительным признаком предложенного нами способа генотипирования от вышесказанного прототипа являлось, как введение дополнительного этапа ПДРФ-анализа с эндонуклеазным расщеплением ампликонов рестриктазой HaeIII, так и последующая детекция результатов анализа методом горизонтального электрофореза в агарозном геле.
В результате же практических исследований, направленных на апробацию разработанного нами способа проведения ПЦР-ПДРФ, был получен технический результат, обеспечивавший эффективную идентификацию аллельных вариантов HMW субъединиц глютенинов пшеницы, благодаря корректной интерпретации генерируемых ПЦР-ПДРФ-фрагментов при их электрофорезной детекции в агарозном геле (рис. 4-6),
Следует отметить, что результаты генотипирования визуально были сопоставимы с расчетными данными, полученными, в свою очередь, исходя из анализа выравниваний соответствующих нуклеотидных последовательностей с HaeIII-рестрикционным картированием и расчета генерируемых ПЦР- и HaeIII-ПЦР-ПДРФ-профилей.
Рис. 4. Электрофореграмма результата ПЦР-анализа и предложенного способа проведения ПЦР-ПДРФ для идентификации аллельных вариантов Ax1/Axnull и Ax2* Glu-A1-локуса HMW-GS пшеницы (праймеры UMN19F + UMN19R)
Обозначения: 1-4) ПЦР-анализ (прототип): 1-2) Axl-/Axnull-аллели (362 bp); 3-4) Ax2*-аллель (344 bp). 5-8) HaeIII-ПЦР-ПДРФ-анализ (предложенный способ): 5-6) Ax1-/Axnull-аллели (172/171/19 bp); 7-8) Ax2*-аллель (172/153/19 bp). М) ДНК-маркеры 100 bp (СибЭнзим)
Так, в результате апробации разработанного нами способа проведения ПЦР-ПДРФ с первым набором праймеров UMN19F + UMN19R и эндонуклеазным расщеплением рестриктазой HaeIII, регистрировались ПЦР-ПДРФ-профили, характерные как для аллельных вариантов Ax1/Axnull (172/171/19 bp), так и для Ax2*-аллеля (172/153/19 bp) Glu-A1-локуса HMW субъединиц глютеиинов пшеницы (рис. 4, треки 5-8), запечатленные вместе с цельными ПЦР-продуктами (рис. 4, треки 1-4) на соответствующей электрофореграмме.
А в результате апробации предложенного способа проведения ПЦР-ПДРФ со вторым набором праймеров UMN25F + UMN25R и эндонуклеазным расщеплением HaeIII визуализировались ПЦР-ПДРФ-профили аллельных вариантов Dx2 (171/109/19 bp) и Dx5 (171/91/19 bp) Glu-D1-локуса HMW субъединиц глютеиинов пшеницы (рис. 5, треки 5-8), тоже запечатленные вместе с неразрезанными ПЦР-продуктами данных аллелей (рис. 5, треки 1-4) на соответствующей электрофореграмме.
Рис. 5. Электрофореграмма результата ПЦР-анализа и предложенного способа проведения ПЦР-ПДРФ для идентификации аллельных вариантов Dx2 и Dx5 Glu-D1-локуса HMW-GS пшеницы (праймеры UMN25F + UMN25R)
Обозначения: 1-4) ПЦР-анализ (прототип): 1-2) Dx5-аллель (281 bp); 3-4).Dx2-аллель (299 bp). 5-8) HaeIII-ПЦР-ПДРФ-анализ (предложенный способ): 5-6) Dx5-аллель (171/91/19 bp); 7-8) Dx2-аллель (171/109/19 bp). М) ДНК-маркеры 100 bp (СибЭнзим)
В результате же постановки ПЦР-ПДРФ с третьим набором праймеров UMN26F + UMN26R и рестрикцией ферментом HaeIII, нами также были зарегистрированы аллельспецифичные профили (Dy10 = 223/174 bp; Dy12 = 241/174 bp) Glu-D1-локуса HMW-GS (рис. 6, треки 5-8), репрезентативно визуализированные вместе с соответствующими цельными ПЦР-продуктами (рис. 6, треки 1-4) на представленной ниже электрофореграмме.
Рис. 6. Электрофореграмма результата ПЦР-анализа и предложенного способа проведения ПЦР-ПДРФ для идентификации аллельных вариантов Dy10 и Dy12 Glu-D1-локуса HMW-GS пшеницы (праймеры UMN26F + UMN26R)
Обозначения: 1-4) ПЦР-анализ (прототип): 1-2) Dy10-аллель (397 bp); 3-4) Dy12-аллель (415 bp). 5-8) HaeIII-ПЦР-ПДРФ-анализ (предложенный способ): 5-6) Dy10-аллель (223/174 bp); 7-8) Dy12-аллель (241/174 bp). М) ДНК-маркеры 100 bp (СибЭнзим).
Так, именно введением дополнительного этапа ПДРФ-анализа с HaeIII-эндонуклеазным расщеплением амплифицируемых ПЦР-продуктов, инциируемых тремя различными парами праймеров (UMN19F + UMN19R, UMN25F + UMN25R и UMN26F + UMN26R), удалось адаптировать детекцию результатов анализа методом горизонтального электрофореза в агарозном геле.
Низко-дискретные цельные ПЦР-продукты, практически также можно анализировать методом горизонтального электрофореза в агарозном геле, однако, ввиду высокого риска негативного влияния эффекта «улыбки» с геометрическим искажением электрофорезной картины, все же для этой цели предпочтительней использовать методы капиллярного или вертикального гель-электрофореза в ПААГ, как ранее и было предусмотрено авторами данных протоколов генотипирования [4].
Для обоснования достоверности заключения ДНК-тестов, также в ходе исследования были дополнительно протестированы и другие общепринятые способы ПЦР-идентификации: Axnull Glu-A1-локуса c праймерами Axnull-F + Axnull-R [3], Dx5 и Dx2 Glu-D1-локуса с праймерами Dx5-1 + Dx5-2 [1], Dy10 и Dy12 Glu-D1-локуса HMW-GS с праймерами Dy10/12-F + Dy10/12-R [6].
Молекулярно-генетической оценкой генотипов пшеницы по аллельным вариантам HMW субъединиц глютенинов выяснено, что по Glu-A1-локусу HMW-GS подавляющее большинство растений (57 образцов, 81,4 %) имели субъединицу Ax2*, кодируемую аллельным вариантом Glu-A1b (Ax2*-аллель), а остальные 13 генотипов (18,6 %) – субъединицу Ax1, кодируемую аллельным вариантом Glu-A1a (Ax1-аллель); по Glu-D1-локусу HMW-GS 44 растения (62,9 %) являлись носителями комбинации субъединиц Dx5 и Dy10 (5+10), кодируемой аллельным вариантом Glu-D1d (Dx5- и Dy10-аллели), а 26 образцов (37,1 %) характеризовались наличием комбинации субъединиц Dx2 и Dy12 (2+12), кодируемой аллельным вариантом GluD1a (Dx2- и Dy12-аллели) (табл. 2). При оценке же распределения происследованных генотипов Triticum aestivum L. по совокупной комбинации Glu-A1/D1-локусов HMW субъединиц глютенинов (Ax1/5+10 = 12 (17,1 %); Ax1/2+12 = 1 (1,4 %); Ax2*/5+10 = 32 (45,7 %); Ax2*/2+12 = 25 (35,7 %)) нами было установлено преобладание желаемой для селекции на мукомольно-хлебопекарные качества зерна комбинации субъединиц Ax2*/5+10.
Заключение
Таким образом, разработанные и апробированные нами способы генотипирования Triticum aestivum L. по аллельным вариантам Waxy-генов и HMW субъединиц глютенинов обеспечили эффективное проведение корректной молекулярно-генетической оценки 70 исследуемых образцов (62 линий и 8 сортов) яровой пшеницы селекции ТатНИИСХ.
Рецензенты:Гайнуллина М.К., д.с.-х.н., профессор, зав. кафедрой технологии производства и переработки сельскохозяйственной продукции Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н. Э. Баумана, г. Казань;
Якупов Т.Р., д.в.н., доцент кафедры биологической и неорганической химии Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н. Э. Баумана, г. Казань.