Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

CHARACTERISTICS AND TRANSFECTION EFFICAСY OF DNA-LOADED BIOCOMPOSITE NANOPARTICLES

Samimi M. 1 Alimova F.K. 1 Abtahi B. 2 Validov S.Z. 1
1 Institute of Basic Medicine and Biology, Kazan Federal University
2 Shahid Beheshti University
DNA incapsulated nanoparticles comprising of chitosan, chitosan-algenate, and chitosan- algenate-dextran sulfate were prepared using ionotropic gelation and complex coacervation methods. Particle size in all three preparations varied from 174.3 to 196.3 nm with polydispersity index lower than 0.2, which is an indication for the low size variation of the particles within the samples. Zeta potential of the nanoparticles was positive and varied within the range from 26.8 to 36.1. No cytotoxic influence was revealed when nanoparticles of all three types were incubated with cells of HEK298 line. In the same time 38.49%, 35.04% and 16.67% of cells were expressing GFP when nanoparticles comprised of chitosan-algenate, and chitosan-algenate-dextran sulfate were used for transfection. Appropriate transfection efficacy and absence of cytotoxicity allow to recommend the nanoparticles studied for design of gene carriers to use in vivo.
biocomposite nanoparticles
transfection
cytotoxicity
DNA carrier
chitosan
alginate
dextran sulfate
Генная терапия является многообещающим направлением медицины, которое предлагает лечение ряда наследственных и приобретенных заболеваний. Поскольку введение терапевтических генов в виде нативной ДНК не эффективно из-за действия нуклеаз, низкой частоты трансфекции и отсутствия адресности доставки, разработка носителей ДНК на основе наночастиц из нетоксичных полимеров может быть эффективным решением проблемы доставки ДНК in vitro, так и in vivo [3, 9, 17].

Хитозан [α (1-4) 2-амино 2-деокси β-D глюкан] является естественным линейным полисахаридом с гидрофильными свойствами, который получают из хитина. Хитин является основой экзоскелета членистоногих, но также обнаруживается у грибов [16]. Благодаря своим биологическим свойствам, таким как возможность биоразложения, актимикробная активность, инертность, высокая прочность, хитозан активно изучается для биомедицинского применения [13, 18, 19].

Катионные полимеры, содержащие несколько аминогрупп в своем скелете, могут быть использованы в качестве носителей ДНК для невирусной доставки генов: фосфатный скелет ДНК взаимодействует с аминогруппами хитозана при низких значениях рН что ведет к образованию комплекса ДНК-хитозан, в данном комплексе ДНК защищена от деградации нуклеазами и показывает большую эффективность трансфекции, чем нативная ДНК [7].

Альгинат является анионным полисахаридом с линейными цепями, которые состоят из α-L-глюкоуроновой и β-D-маннуроновой кислот. Важной особенностью альгината является способность к ионотропному гелеобразованию, которое позволяет инкапсулировать биоагенты, такие как белковые комплексы и клетки [14]. Легкая деградация, отсутствие токсичности, сорбционные способности делают альгинат удобным биополимером для приготовления нанокапсул [11].

Альгинат-хитозановые полиионные комплексы образуются благодаря ионотропному гелеобразования благодаря взаимодействию между карбоксильными группами альгината и аминогруппами хитозана. Получающийся комплекс биосовместим и легко подвергается биодеградации, а также защищает инкапсулированное вещество [24].

Декстран, как биосовместимый и легко разлагающийся полиионный полимер часто используется в качестве средства доставки лекарств [15]. Декстран-хитозановые наночастицы образуются за счет электростатического взаимодействия остовов хитозана и декстран сульфата [1]. Кроме того, сочетание декстран сульфата и хитозана в оптимальных соотношениях, для формулирования, может действовать синергически для включения, защиты и высвобождения терапевтических молекул [21].

Целью настоящей работы является разработка носителей ДНК на основе наночастиц, состоящих из хитозана, альгината и декстран сульфата, сравнение их физикохимических свойств, эффективности инкапсулирования ДНК, оценка цитотоксичности и эффективности трансфекции этих наночастиц. В данной работе впервые сообщается об использовании в качестве носителей ДНК наночастиц, содержащих хитозан, альгинат и декстран сульфат.

Материалы и методы

Материалы, штаммы бактерий, ДНК, культуры клеток использованные в данной работе и условия их культивирования.

Хитозан с низкой молекулярной массой (Mw=50 kDa, DD> 75%), натриевая соль декстран сульфата с молекулярной массой >500 kDa, альгинат натрия, 3-(4,5-диметилтиазол-2-)-2,5 - дифенил тетразолиум бромид (MTT) и хлорид кальция были произведены Sigma-Aldrich (США).

Штамм Escherichia coli Nova Blue(Novagen, США), содержащий вектор pEGFP-N2 (Invitrogene, США) выращивали в среде LB (Sigma-Aldrich, США), содержащей 100 мкг/мл ампицилина (ПанЭко, РФ) при 37ОС и интенсивной аэрации. Для приготовления всех трех типов наночастиц использовалась ДНК pEGFP-N2.

Трансфецирующий агент липофектамин - LipofectamineTM 2000 был приобретен в компании Invitrogen Inc. (США).

Для разведения наночастиц и липофектамина была использована среда DMEM (ПанЭко, РФ).

Линия эмбриональных клеток почек (HEK293) была получена из Altogen (США). Клетки HEK293 культивировали в свежей полноценной среде, которую готовили на основе DMEM с добавлением 10% об/об эмбриональной телячей сыворотки, 2mM L-глутамина, пенициллина (50 ед/мл) и стрептомицина (50 мкг/мл) (Life technologies Inc., Великобритания) при 37°C в увлажненной атмосфере с содержанием углекислого газа 5 % в инкубаторе Esco CelCulture CO2 incubater (Scimetrics Inc., США).

Клетки выращивали до конфлюента, после чего обрабатывали 0,25% раствором трипсина (Gibco, Великобритания) при 37°C в течение 5 минут (трипсинизация).

Выделение плазмидной ДНК

Для выделения ДНК использовали штамм Escherichia coli NovaBlue (Novagen, Германия) содержащий вектор pEGFP-N2. Выделение и очистку ДНК производили методом щелочного лизиса. Качество выделенной ДНК и степень очистки определяли с помощью электрофореза в 1% агарозном геле в буфере TBE. Количество ДНК и степень очистки препарата pEGFP-N2 определяли спектрофотометрически с помощью NanoDrop UV-Vis (Thermo Scientific, США).

Приготовление наночастиц с инкапсулированной ДНК

Для приготовления ДНК-содержащих наночастиц на основе альгината и хитозана использовали ДНК вектора pEGFP-N2. Оптимальными условиями были соотношение альгината к хитозану 1:1. Соотношение CaCl2/альгинат было 0.2% и соотношение N/P равнялось 5 при pH 5.3. [2]. Биополимерные наночастицы готовили, комбинируя процесс ионотропного гелеобразования и осаждения за счет взаимодействия между карбоксильными группами альгината и аминогруппами хитозана. Двухступенчатый процесс включает сшивку альгината натрия в присутствии хлорида кальция, затем альгинатная частица покрывается хитозаном для стабилизации. Для этого со скоростью 30 мл/ч 1мл разведенного раствора CaCl2 (0.00006%) добавляли по каплям через инсулиновую иглу к 3 мл альгината натрия, после чего была добавлена плазмидная ДНК также по каплям при постоянном перемешивании. В соответствии с соотношением компонентов 4 мл раствора хитозана были добавленны к смеси альгината, хлорида кальция и ДНК. Смесь перемешивали в течение 30 минут для окончания формирования наночастиц. После чего наночастицы были отделены от раствора центрифугированием при 20 000 об/мин в течение 20 минут. Процедура приготовления наночастиц с добавлением декстран сульфата была проведена в тех же условиях что и описанный выше процесс, различие заключалось в добавлении декстран сульфата до конечной концентрации 0.001% вес/объём в раствор альгината натрия. Хитозановые наночастицы с инкапсулированной ДНК были приготовлены методом комплексной коацервации [13].

Размер частиц, индекс полидисперсности и зета-потенциал

Определение размеров наночастиц было произведено с помощью динамического рассеяния света (ДРС) Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, Великобритания). Индекс полидисперсности (ИП) измеряли для каждого образца как индикатор разброса размеров частиц. Зета потенциал был определен с помощью Zetasizer Nano ZS по модели Смолуховского.

Оценка эффективности инкапсуляции ДНК

Эффективность инкапсуляции определяли как разницу между количеством ДНК, использованной для приготовления частиц и количеством ДНК оставшейся в супернатанте после осаждения наночастиц [13].

Оценка цитотоксического влияния наночастиц

Цитотоксичность наночастиц с инкапсулированной ДНК оценивали с помощью МТТ теста на цитотоксичность, согласно [5]. Относительную жизнеспособность (%) высчитывали на основе измерений при 555 нм и 700 нм в лунках планшета с помощью TECAN infinite® M200-PRO (Швейцария).

Жизнеспособность клеток в контрольном варианте опыта (клетки инкубированные в полноценной среде) принимали за 100%. Относительная жизнеспособность клеток высчитывали по формуле [жизнеспособные клетки] образец/ [жизнеспособные клетки] контроль × 100. Эксперимент был проделан в трех повторах.

Трансфекция in-vitro

Для проведения транфекции клетки HEK293 инокулировали в 500 мкл свежей полноценной среды в 24-луночный планшет (NunclonTM, Дания) при плотности 5×104 кл/лунку и выращивали в течение 24 часов при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO2. После достижения 80% конфлюэнта клетки считали готовыми для трансфекции. После разведения наночастиц в DMEM наночастицы с содержанием ДНК 1 мкг вносили к клеткам и инкубировали еще 48 часов в тех же условиях. Клетки без добавления каких-либо веществ и клетки с добавлением чистой плазмидной ДНК (отрицательные контроли), так же комплекс Lipofectamine/ДНК (положительный контроль) инкубировали в тех же условиях, как и образцы с наночастицами.

Экспрессия EGFP была визуализирована с помощью флюоресцентного микроскопа Axio Observer S 100 (Zeiss, Германия). Все эксперименты были повторены трижды.

Результаты и обсуждение

Размер частиц, индекс полидисперсности и зета-потенциал

Средний размер частиц, распределение размеров частиц, ИП, зета потенциал и эффективность инкапсуляции для созданных наночастиц приведены в табл. 1. Данные приведены в виде средних значений (±стандартное отклонение) по результатам трех экспериментов.

Размер наночастиц является одна из важных характеристик, которая может влиять на эффективность трансфекции. Согласно данным, приведенным в табл. 1 средний гидродинамический диаметр для этих трех различных наночастиц составил от 147.3 нм до 196.3 нм. Наиболее компактными были наночастицы, состоящие из хитозана и альгината. Частицы, состоящие из альгината, декстран сульфата и хитозана были наиболее крупными. Введение альгината и декстран сульфата не обязательно приводит к увеличению размеров частиц, вероятно на размер больше влияет способ и условия приготовления частиц: ионотропное гелеобразование или комплексная коацервация.

Таблица 1

Размер частиц, распределение размеров, индекс полидисперсности (ИП), зета потенциал и эффективность инкапсуляции плазмидной ДНК в наночастицы разного состава

Образец

Средний ИП

 

Средний размер частиц (нм) ± s

 

Средний зета потенциал (mV)

± s

Средняя эффективность инкапсуляции (%)± s

Распределение размеров наночастиц по интенсивности (нм) ± s (100% наночастиц)

Распределение размеров наночастиц по объему интенсивности (нм) ± s.

(100% наночастиц)

Распределение размеров наночастиц по количеству (нм) ± s.

(100% наночастиц)

Хитозан

0.135±0.001

182.7±9.48

36.1±1.82

83.07±2.34

203.4±6.102

222±6.66

127±3.81

Хитозан/
альгинат

0.161±0.005

147.3±6.22

28.9±1.24

91.33±1.63

187.1±14.96

196±15.68

108±8.64

Хитозан/
альгинат/
декстран сульфат

0.146±0.002

196.3±11.29

26.8±1.04

94.71±2.03

224.9±13.23

234.1±15.11

154.7±8.60

При этом размер наночастиц состава ДНК/хитозан/альгинат был меньше чем таковой у частиц ДНК/хитозан. Разница в размерах частиц объясняется образованием сшивок между ДНК и альгинатом с участием поливалентных катионов, таких как Ca2+, что приводит к образованию частиц меньшего размера, чем наночастицы состоящие из хитозана и ДНК [4]. В присутствии декстран сульфата средний размер частиц увеличивался, аналогично тому как сообщалось ранее [8]. Распределение размеров частиц характеризуется ИП, который является мерой гомогенности в дисперсной системе и может изменятся в интервале от 0 до 1. Гомогенность частиц в образце характеризуется значениями ИП близкими к нулю, тогда как ИП более 0,3 указывает на гетерогенность образца [27]. Как это видно из табл. 1 приготовленные наночастицы имели ИП меньше чем 0.2.

Зета потенциал наночастиц с инкапсулированной ДНК вариировал в пределах от 26.8 до 36.1 мВ (при pH 5.3). Позитивно заряженные частицы могут облегчить адгезию к клеточной мембране, индуцировать и увеличивать поглощение частиц клетками [5]. Кроме того, положительно заряженные частицы указывают, что в них ДНК полностью связана с хитозаном [10]. Было показано, что стабильность частиц выше, если зета-потенциал либо высоко негативен (<-30 mV) либо высоко позитивен (>+30 mV) [12], из чего можно сделать вывод, что стабильность наночастиц хитозан/ДНК была выше чем у наночастиц с включением других биополимеров. На это указывает, также, большая склонность наночастиц хитозан/альгинат и хитозан/альгинат-декстран сульфат к аггрегированию, чем это было отмечено для наночастиц, состоящих исключительно из хитозана.

Эффективность инкапсуляции (ЭИ)

Согласно табл. 1 ЭИ составляла от 83.07 до 94.71%. Присутствие декстран сульфата значительно увеличивало ЭИ. Увеличение ЭИ может происходить из-за усиления матрицы наночастицы по сравнению с частицами из хитозана или хитозана и альгината [20].

Цитотоксичность

Цитотоксичность наночастиц была определена с помощью МТТ теста. Нативная ДНК, ДНК с липофектамином были использованы в качестве контролей. Как видно из табл. 2, ни один из препаратов наночастиц не проявлял цитотоксичные свойства, тогда как только 60 % клеток выживали при обработке смесью липофектамин/ДНК. Более того, наночастицы увеличивали жизнеспособность клеток по сравнению с отрицательным контролем, где к клеткам была добавлена нативная векторная ДНК. Аналогичное повышение жизнеспособности наблюдалось при использовании наночастиц с альгинатом [20]. Частицы с декстраном показывали наибольшее увеличение жизнеспособности и это отличие было статистически достоверным.

Таблица 2

Жизнеспособность клеток и эффективность трансфекции

Образцы

Жизнеспособность клеток (% от контроля ± s)

Эффективность трансфекции (%± s)

Хитозан

113.45± 2.3

16.67± 0.73

Хитозан/альгинат

124.21± 1.7

35.04± 1.62

Хитозан/альгинат/декстран

143.21± 3.73

38.49± 1.43

ДНК/липофектамин

59.87± 4.7

55.39± 2.11

Плазмидная ДНК (контроль)

101.32± 1.5

0.23±0.01

Трансфекция in-vitro

Для определения эффективности трансфекции частицы с инкапсулированной ДНК вектора pEGFP-N2 были инкубированы с клетками линии HEK 293 в качестве положительного контроля использовали векторную ДНК смешанную с липофектамином, который является эффективным препаратом для трансформации культур клеток для исследовательских целей.

Анализ флюоресценции трансфецированных клеток с помощью проточной цитофлуорометрии выявил, 55.39%, 38.49%, 35.04% и 16.67% клеток экспрессировали GFP при использовании липофектамина, наночастиц состава хитозан/альгинат-декстран сульфат, хитозан/альгинат и хитозан соответственно. Липофектамин, использованный в данном эксперименте в качестве положительного контроля.

Наиболее эффективными в трансформации были частицы размером 196.3 нм. Частицы, состоящие из хитозана размером 182 нм были наименее эффективны. Согласно ранее проведенным исследованиям частицы размером более 250 нм не отличаются по эффективности трансфекции [25]. Для частиц размером менее 250 нм было показано, что наночастицы с меньшим размером более эффективны для трансфекции ДНК [20, 23].

Вероятно, причина отсутствия данного тренда в наших исследованиях может быть объяснена разным составом наночастиц.

Частицы без добавления альгината или декстран сульфата были наименее эффективны в трансфекции. Большую эффективность наночастиц с применением альгината может объяснить увеличение эндосомального высвобождения: альгинат действует как протонная губка при разрушении [26]. Кроме того, гидрофильная природа хитозана препятствует высвобождению ДНК внутри клеток [6]. Большая трансфекционная эффективность наночастиц, содержащих декстран сульфат, может объясняться большим набуханием частиц [22], что ведет к более эффективному высвобождению плазмидной ДНК в клетках по сравнению с наночастицами состоящими из альгината и хитозана [20]. Кроме того, альгинат и декстран сульфат могут уменьшить электростатическое взаимодействие между хитозаном и ДНК, что также может способствовать высвобождению векторной молекулы.

Заключение

Наши исследования показали, что наночастицы на основе хитозана, альгината и декстран сульфата являются наиболее эффективными носителями для трансфекции ДНК. Кроме того в отличие от Липофектамина данные частицы не токсичны и даже усиливают пролиферацию и размножение клеток после трансформации. Полученные результаты позволяют рекомендовать данные композитные наночастицы в качестве носителей для трансфекции ДНК in vivo.

Рецензенты:

Багаева Т.В., д.б.н., заведующий кафедрой биотехнологии Казанского (Приволжского) федерального университета, г. Казань;

Гоголев Ю.В., д.б.н., заведующий лабораторией молекулярной биологии, ФГБУН "Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра" Российской академии наук, г. Казань.