Одним из перспективных направлений в области функционального питания является разработка биопродуктов на основе консорциумов пробиотических бактерий, которые обладают большей устойчивостью к неблагоприятным факторам среды и более высокой биохимической активностью по сравнению с заквасками, приготовленными с использованием чистых культур [1, 2].
Целью исследований настоящей работы являлось изучение биотехнологических свойств биопродукта «Целебный» для функционального питания.
Материалы и методы исследований
Объектами исследований являлись заквасочные культуры молочнокислых бактерий и бактериальных концентратов Барнаульской биофабрики, ЗАО "Вектор-БиАльгам", созданный микробный консорциум, полученные в ходе выполнения исследований, разработанные биопродукты после выработки и в процессе хранения. При выполнении экспериментальной части работы использовались современные приборы и методы, а также стандартные и общепринятые методы определения физико-химических, микробиологических и органолептических показателей. Антагонистическую активность по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам изучаемых заквасок молочнокислых бактерий и микробного консорциума, определяли методом последовательных разведений и развивающихся смешанных популяций в сравнении с ростом тест-культур в жидкой питательной среде, с последующим высевом на плотные среды. В качестве тест-микроорганизмов использовали: E.coli, S.aureus, Pr.vulgaris, Ps.mirabilis, Kl.pheumoniae, Sh.flexneri, Sh.sonnei, S.сottbus. Резистентность к антибиотикам микроорганизмов заквасок определяли по методу серийных разведений в жидкой питательной среде. Количество экзополисахаридов определяли антроновым методом. Математическую обработку экспериментальных данных по результатам 3-5 повторностей проводили по стандартным программам [1, 3, 5, 6, 7].
Результаты исследований и их обсуждение
Для исследований были выбраны отечественные закваски молочнокислых бактерий: L-1, L-2, L-4 и БК-Алтай-Снж, адаптированные для россиян, с высоким содержанием жизнеспособных клеток, не менее 109 КОЕ/см3, и доказанными позитивными эффектами, направленными на поддержание и восстановление здоровья (таблица 1).
Таблица 1
Биотехнологический потенциал заквасочных культур
|
Наименование заквасочных культур (ассоциатов) |
Видовой состав микрофлоры ассоциатов |
Оптим. температура развития, ºC |
Продолжительность сквашивания, ч |
Количество клеток, КОЕ в 1 см3 |
|
БК-Алтай-Снж |
Lactococcus lactis subsp.lactis Lactococcus lactis subsp.сremoris Lactococcus lactis subsp.diacetilactis Streptococcus salivarius thermophilus |
33±1
|
10±0,2 |
1011 |
|
L-2 |
Lactobacillus casei |
39±1 |
7±0,2 |
109 |
|
L-1 |
Lactobacillus acidophilus |
40±1 |
7±0,2 |
109 |
|
L-4 |
Lactobacillus delbrukii subsp. bulgaricus |
41±1 |
7±0,2 |
109 |
Проведенные исследования показали, что выбранные заквасочные культуры имеют высокий биотехнологический потенциал. На основе этих заквасок был создан микробный консорциум, который использовался при производстве нового биопродукта «Целебный». При изучении биотехнологических биопродуктов, была изучена антагонистическая активность микрофлоры биопродуктов, приготовленных на исходных заквасках, а также с использованием созданного микробного консорциума путем подсчета lg количества клеток тест-культур в 1 см3 среды (рис. 1).
Рис.1. Антагонистическая активность биопродуктов ассоциатов и их консорциума по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам.
1 – E.coli, 2 – S.aureus, 3 – Pr. vulgaris, 4 – Ps. mirabilis, 5 – Kl.pheumonia, 6 – Sh.flexneri, 7 – Sh.sonnei, 8 – S.cottbus
Как показывают данные рисунка 1, антимикробная активность созданного консорциума по эффективности действия на патогенные и условно-патогенные микроорганизмы значительно выше, чем у исходных заквасок. Высокая антагонистическая активность микробного консорциума, вероятно, обусловлена способностью бактерий выделять антимикробные субстанции.
Из литературных источников [1, 3, 4] известно, что L.acidophilus выделяют лактоцины B, F,G, M; L.bulgaricus – булгарицин; Lactococcus lactis – низин, Streptococcus salivarius subsp. thermophilus синтезируют ацетоин; Lactococcus cremoris – диплоцин, Lactobacillus casei – бактериоцины, синтез которых усиливается при симбиотических взаимоотношениях.
Кроме того, в процессе метаболизма большинство используемых микроорганизмов продуцируют L-молочную кислоту и увеличивают антимикробную активность, т.к. по литературным данным L-молочная кислота и ее соли-лактаты натрия и кальция характеризуются достаточно высокой антимикробной активностью и способствуют увеличению сроков годности биопродуктов. Немаловажное значение при разработке нового биопродукта на основе микробного консорциума придается устойчивости микроорганизмов к антибиотикам – важному пробиотическому свойству микроорганизмов. При производстве молочных биопродуктов, обладающих лечебно-профилактических действием, этому свойству придается большое значение.
Из литературных источников известно, что при лечении совместное применение антибиотиков и кисломолочных продуктов, заквашенных антибиотикоустойчивыми штаммами микроорганизмов, способствует эффективному восстановлению нормальной микрофлоры кишечника уже в процессе антибиотикотерапии.
В связи с этим была изучена природная устойчивость микроорганизмов биопродуктов, приготовленных на исходных заквасках, так и с использованием микробного консорциума к ряду антибиотиков, которые применяются для лечения различных заболеваний. Это бициллин, кларбат, спарфлоксацин, гентамицин, левомицетин, фурадонин, тетрациклин, олететрин, сульфадиметоксин, 5-Нок. Результаты исследований представлены в таблице 2.
Таблица 2
Изучение резистентности биопродуктов на основе исходных заквасок и их консорциума микроорганизмов к антибиотикам
|
Наименование антибиотика |
Ед. измерения активности антибиотика |
Изучаемые дозы антибиотиков |
Концентрация антибиотика, к которой устойчивы ассоциаты и их микробный консорциум |
||||
|
L-1 |
L-2 |
L-4 |
СНЖ |
К |
|||
|
Бициллин |
Ед/см3 |
100;10; 1; 0,1; 0,01 |
1 |
1 |
1 |
0,1 |
10 |
|
Кларбат |
Мкг/см3 |
1000; 100; 10; 1; 0,1 |
100 |
100 |
10 |
100 |
1000 |
|
Спарфлоксацин |
Мкг/см3 |
1000; 100; 10; 1; 0,1 |
1000 |
1000 |
1000 |
1000 |
1000 |
|
Гентамицин |
Мкг/см3 |
80; 40; 8; 4; 0,8 |
80 |
40 |
40 |
8 |
80 |
|
Левомицетин |
Мкг/см3 |
2500; 250; 25; 2,5; 1,25 |
250 |
250 |
25 |
25 |
2500 |
|
Фурадонин |
Мкг/см3 |
1000; 100; 10; 1; 0,1 |
1000 |
100 |
1000 |
1000 |
1000 |
|
Тетрациклин |
Мкг/см3 |
1000; 100; 10; 1; 0,1 |
1000 |
100 |
1000 |
100 |
1000 |
|
Олететрин |
Мкг/см3 |
250; 25; 2,5; 0,25; 0,025 |
2,5 |
2,5 |
25 |
250 |
250 |
|
Сульфадиметоксин |
Мкг/см3 |
1000; 100; 10; 1; 0,1 |
1000 |
1000 |
1000 |
1000 |
1000 |
|
5-Нок |
Мкг/см3 |
50; 25; 2,5; 0,25; 0,025 |
25 |
2,5 |
25 |
0,25 |
50 |
При изучении резистентности биопродуктов на основе исходных заквасок и консорциума к выбранным антибиотикам было установлено, что резистентность микрофлоры биопродукта на основе микробного консорциума ко всем исследуемым антибиотикам значительно возросла, по сравнению с биопродуктами на основе исходных заквасок. Это повышение вероятно, обусловлено приобретением новой генетической информации, которую несут клетки микроорганизмов консорциума за счет передачи плазмид в процессах трансдукции и конъюгации не только близкородственным видам, но и родам бактерий.
Из литературных источников известно, что мезофильные лактококки содержат от 3 до 7 плазмид, которые кодируют такие свойства, как продуцирование антибиотических веществ и сохранение устойчивости к антибиотикам. При изменении температуры культивирования, вероятно, происходит перестройка геномов бактериальных внехромосомных молекул ДНК (плазмид), которые характеризуются большей степенью нестабильности по сравнению с хромосомной ДНК и поэтому изменяется резистентность к антибиотикам.
Была изучена устойчивость микроорганизмов биопродуктов на основе заквасок и их консорциума к 0,4% фенола, 2%, 4% и 6,5% NaCl, 20%, 30% и 40% желчи и к щелочной реакции среды при pH 7,5; 8,3; 9,2 и 9,6 и установлено, что консорциум более устойчив ко всем исследуемым факторам, что может подтвердить его высокие пробиотические свойства и лучшую способность клеток бактерий, входящих в его состав приживаться в желудочно-кишечном тракте человека.
Известно, что внутри бактериальной популяции комплексной закваски протекают сложные процессы, клетки бактерий находятся в постоянном взаимодействии. С целью выяснения роли физиологических взаимодействий (агрегации и когезии) клеток исходных заквасок в микробном консорциуме, были исследованы колонии микроорганизмов в исходных заквасках и их консорциуме (рис.2 и 3). В результате исследований установлено, что в биопродукте на основе микробного консорциума наблюдаются более близкие межклеточные контакты молочнокислых палочек и стрептококков, что свидетельствует о когезии клеток в микробном консорциуме.
Агрегация колоний микроорганизмов заквасок, входящих в микробный консорциум, демонстрирует их способность к многоклеточной организации, к прочным симбиотическим отношениям, к образованию единого полимерного матрикса, что характерно для бактерий в их естественных местах обитания, например, в желудочно-кишечном тракте человека.
Известно, что экзополисахариды (ЭПС), синтезируемые молочнокислыми бактериями, не только улучшают реологические свойства биопродуктов, но и способствуют адгезии полезных микроорганизмов на стенки кишечника. Из литературных источников известно, что экзополисахариды выполняют функции саморегуляторов процессов роста и размножения микроорганизмов. ЭПС защищают клетки от фагов, препятствуют высушиванию клеток, повреждениям при заморозке и денатурации белка, а некоторые экзополисахариды используются их продуцентами и в качестве источника углерода. Следует отметить, что ЭПС служат также барьером между клетками и окружающей средой, выполняя защитную роль против высушивания и замораживания, а также обеспечивают адаптацию в других экстремальных условиях. Именно эти свойства во многом и позволяют создавать глубокозамороженные, а также лиофилизированные закваски и биопродукты, с высокой биохимической активностью.
L-1 (Lactobacillus acidophilus)
L-4 (Lactobacillus delbrukii subsp. bulgaricus)
L-2(Lactobacillus casei)
БК-Алтай-СНЖ (Lactococcus lactis subsp.lactis, Lactococcus lactis subsp.сremoris, Lactococcus lactis subsp.diacetilactis, Streptococcus salivarius thermophilus)
Рис.2. Микроскопическая картина микрофлоры заквасок L-1, L-2, L-4, БК-Алтай-Снж (ув. х 1000)
Микробный консорциум (Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbrukii subsp. bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactococcus lactis subsp.lactis, Lactococcus lactis subsp.сremoris, Lactococcus lactis subsp.diacetilactis, Streptococcus salivarius thermophilus)
Рис. 3. Микроскопическая картина микрофлоры консорциума (ув. х 1000)
Более того, экзополисахариды, продуцируемые микроорганизмами, интенсифицируют процесс ферментации молока, сокращая время образования сгустка, а также стимулируют рост самих бактерий и синтез ими других полезных метаболитов (аминокислот, летучих жирных кислот, витаминов) [1, 4, 8]. Поэтому был изучен биосинтез экзополисахаридов биопродуктов на основе заквасок и их консорциума. Результаты исследований представлены в табл.3.
Таблица 3
Содержание экзополисахаридов в биопродуктах на основе заквасок и их микробном консорциуме
|
N п/п |
Исследуемые закваски и их микробный консорциум |
Состав исходных заквасок и их микробного консорциума |
Количество ЭПС из 100 г образца, г |
|
1. |
L-1 |
Lactobacillus acidophilus |
0,0337±0,0012 |
|
2. |
L-2 |
Lactobacillus casei |
0,0341±0,0011 |
|
3. |
L-4 |
Lactobacillus delbrukii subsp. bulgaricus |
0,0337±0,0011 |
|
4. |
БК-Алтай-Снж |
Lactococcus lactis subsp.lactis, Lactococcus lactis subsp.сremoris, Lactococcus lactis subsp.diacetilactis, Streptococcus salivarius thermophilus |
0,0325±0,0011 |
|
5. |
Микробный консорциум |
Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbrukii subsp. bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactococcus lactis subsp.lactis, Lactococcus lactis subsp.сremoris, Lactococcus lactis subsp.diacetilactis, Streptococcus salivarius thermophilus |
0,0375±0,0012 |
Данные, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что микроорганизмы все заквасок синтезируют экзополисахариды. Наибольшее количество экзополисахаридов среди исходных заквасок синтезируется в образцах с лактобациллами, наименьшее – с лактококками, среди лактобацилл наибольшее накопление ЭПС обнаружено в образце, приготовленном с использованием Lactobacillus casei. Важно отметить, что синтез экзополисахаридов более выражен у микробного консорциума по сравнению с исходными заквасками бактерий, входящими в его состав.
Заключение
Результаты исследований показали, что микрофлора биопродукта на основе микробного консорциум обладает широким спектром антагонистической активности по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам. Установлено, что антагонистическая активность микробного консорциума по отношению к патогенным и условно-патогенным бактериям, а также устойчивость к антибиотикам, желчи, фенолу, повышенным концентрациям хлористого натрия, изменениям рН среды, биосинтез экзополисахаридов микробного консорциума более выражены по сравнению с заквасками, входящих в его состав. Биопродукт «Целебный обладает хорошими органолептическими показателями, содержит 1010 КОЕ/см3 клеток пробиотических микроорганизмов и рекомендуется для восстановления нормальной микрофлоры кишечника человека.
Рецензенты:
Решетник Е.И., д.т.н., профессор, заведующий кафедрой «Технологии переработки продукции животноводства» ФГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный аграрный университет», г. Благовещенск;
Беспалова Т.А., д.в.н., профессор кафедры «Экологии и естественнонаучных дисциплин» АНО ВПО «Омский экономический институт», г. Омск.