Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,006

RESEARCH OF ABILITY OF LISTERIA MONOCYTOGENES TO FORM BIOFILMS IN CONSORTIUM WITH SAPROPHYTIC BACTERIA

Bogatyrenko E.A. 1, 2 Buzoleva L.S. 2, 1 Berdasova A.S. 1
1 Far Eastern Federal University
2 Research institute of epidemiology and microbiology n.a. G.P. Somov
For research of ability of pathogenic bacteria to form biofilms in interaction with saprophytic microorganisms the strains of Listeria monocytogenes and strains of saprophytes isolated from various food were used. The work was carried out with the modified method based on a photometric estimation of quantity of 1% solution of the crystal violet joined with a biofilm. Experiment was carried out at 5 ºС, 22ºС and 37ºС. It is shown that at 37ºС L. monocytogenes effectively formed biofilms in a monoculture, however at 5ºС and 22ºС this ability was lost. Presence of saprophytes in medium with L. monocytogenes had ambiguous effect on biofilm formation process. So, at 37ºС saprophytes rendered the action both stimulating and inhibiting on formation of biofilms. However, at temperatures of 5ºС and 22ºС all studied saprophytic microorganisms positively influenced formation of biofilms with pathogenic bacteria. It is established that the most effective formation of biofilms of L. monocytogenes and saprophytes was observed at 22 ºС.
Listeria monocytogenes
biofilm
saprophytic bacteria
temperature
communities

В настоящее время рядом авторов доказана и широко освещена ведущая роль в распространении листериозной инфекции таких пищевых продуктов как молоко, сыры, сливочное масло, колбасы, мясные полуфабрикаты [3, 5]. Но, в литературе представлены, в основном, эпидемиологические данные, которые не дают представлений о ключевых факторах, оказывающих влияние на изменение биологических свойств патогенных бактерий. Рассматривая пищевые продукты, как экологическую нишу, занимаемую листериями, как правило, основное внимание исследователей уделяется изучению динамики численности патогенных бактерий под влиянием абиотических факторов [1, 6]. Но, помимо абиотических, на свойства возбудителей могут оказывать влияние и биотические факторы среды, так как листерии входят в состав биоценозов с сапрофитными микроорганизмами, контаминирующими продукты питания. Кроме того, известно, важнейшим механизмом адаптации L. monocytogenes является их способность к существованию и размножению в составе биопленок. На формирование биопленок листериями также могут оказывать влияние сапрофитные микроорганизмы, обсеменяющие пищевые продукты, что необходимо учитывать при эколого-эпидемиологических исследованиях [4, 7]. Вероятно, что биотические взаимодействия наравне с абиотическими факторами играют определенную роль в реализации адаптационных механизмов L. monocytogenes, однако, характер этих взаимодействий мало изучен.

Цель работы – изучить способность L. monocytogenes формировать биопленки в консорциуме с сапрофитными бактериями, выделенными с продуктов питания, при действии различных температур.

Материал и методы исследования

Для изучения способности Listeria monocytogenes образовывать биоплёнки при взаимодействии с сапрофитными микроорганизмами использовали штаммы L. monocytogenes 5642/6 и 9156/2 из коллекции НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова СО РАМН. В качестве тест-культур сапрофитных бактерий были выбраны 8 штаммов, выделенных из различных продуктов питания.

Опыт проводили на плоскодонных иммунологических планшетах при культивировании микроорганизмов на бульоне КД с добавлением 1% глюкозы при температурах 5 ОС, 22 ОС и 37ОС в течение 3 суток. Для каждой изучаемой комбинации в лунки вносили по 1 мл суспензий листерий и 1 мл суспензий сапрофитных бактерий в концентрации 107 КОЕ/мл. Интенсивность биопленкообразования определяли на третьи сутки эксперимента по модифицированному методу, основанному на спектрофотометрической оценке количества связанного с биопленкой 1%-ого раствора кристаллического фиолетового [2]. В качестве контроля служили значения оптической плотности элюатов, полученные для биопленок листерий без сапрофитов. Каждый опыт повторяли трижды.

Результаты исследования и их обсуждение

В ходе работы было установлено, что при температуре 37ºС оптическая плотность элюатов с поверхности лунок, содержащих только клетки листерий составила для штамма 5642/6 - 0,223, для штамма 9156/2 - 0,088 (табл.1). Для дальнейшего изучения способности листерий образовывать биопленки совместно с сапрофитными микроорганизмами были поставлены опыты с использованием 8 штаммов бактерий, выделенных с продуктов питания. Полученные данные представлены в таблице 1.

Как видно из приведенных материалов, при температуре 37ºС присутствие в среде с листериями тест-культур под номерами 4-1, 1-4 и 7-3488/3/1 положительно влияло на образование биопленок обоих штаммов листерий. Указанные сапрофитные бактерии усиливали процесс биопленкообазования на 18 – 150% по сравнению с контролем. При этом наибольший стимулирующий эффект оказывал штамм 4-1, выделенный с рубленой колбасы.

Ингибирующее влияние на образование биопленок оказали штаммы 9-2, 7с, 3-3492/3/3 и 5557/1, при этом интенсивность процесса снижалась на 22-78%. Интересно отметить, что штамм 2-3 по-разному влиял на биопленки штаммов L. monocytogenes. Для штамма 5642/6 наблюдалось усиление процесса на 16%, для 9156/2 – наоборот, отмечалось ухудшение формирования биопленки на 69%.

При понижении температуры эксперимента до 22ºС обнаружена потеря способности исследуемых штаммов листерий образовывать биопленки в монокультуре. Однако, при добавлении в среду сапрофитов наблюдалось их стимулирующее действие на этот процесс. Все тест-культуры сапрофитов в разной степени стимулировали биопленкообразование: оптическая плотность смывов возрастала до 0,026 - 0,579. Наибольший положительный эффект для обоих штаммов листерий оказал штамм 7-3488/3/1, выделенный с мясных полуфабрикатов.

Стоит отметить, что при более низкой температуре 5ºC листерии также не образовывали биопленок, но в присутствии сапрофитных бактерий эта способность вновь появлялась. Как и в случае культивирования при температуре 22ºC, все исследуемые тест-культуры оказывали положительное влияние на формирование листериями биопленок. Оптическая плотность смывов возрастала до 0,040 – 0,286. Наибольший стимулирующий эффект оказали штаммы 7-3488/3/1 и 7с, выделенные с мясных полуфабрикатов и сыра соответственно.

Таким образом, установлено, что самое эффективное образование биопленок листерий и сапрофитов наблюдалось при 22ºС, что, вероятно, связано с тем, что такая температура является наиболее оптимальной для интенсивного развития сапрофитной микрофлоры, с которой листерии вступают в симбиотические отношения. Утрата листериями способности образовывать биопленки в монокультуре при температурах ниже 37ºС компенсируется способностью образовывать биопленки во взаимодействии с сапрофитами, что является важным адаптационным механизмом выживания и размножения листерий вне теплокровных организмов.

Таблица 1

Количественная оценка интенсивности образования биопленок L. monocytogenes и сапрофитных бактерий

Сочетание штаммов (источник выделения сапрофита)

Оптическая плотность, t=37ºC

Оптическая плотность, t=22ºC

Оптическая плотность, t=5ºC

L. monocytogenes 5642/6 + № 9-2 (замороженная говядина)

0,050

0,007

0,058

L. monocytogenes 5642/6 + № 4-1 (колбаса рубленая)

0,347

0,248

0,079

L. monocytogenes 5642/6 + № 2-3 (сосиски)

0,259

0,026

0,109

L. monocytogenes 5642/6 + № 1-4 (колбаса полукопченая)

0,263

0,106

0,061

L. monocytogenes 5642/6 + № 7c (сыр)

0,071

0,291

0,209

L. monocytogenes 5642/6 + № 7-3488/3/1 (п/ф колбаски для жарки)

0,270

0,405

0,240

L. monocytogenes 5642/6 + № 3-3492/3/3 (пельмени)

0,173

0,379

0,095

L. monocytogenes 5642/6 + № 5557/1 (пресервы из сельди)

0,151

0,363

0,082

L. monocytogenes 9156/2 + № 9-2 (замороженная говядина)

0,036

0,065

0,060

L. monocytogenes 9156/2 + № 4-1 (колбаса рубленая)

0,220

0,344

0,040

L. monocytogenes 9156/2 + № 2-3 (сосиски)

0,027

0,110

0,153

L. monocytogenes 9156/2 + № 1-4 (колбаса полукопченая)

0,130

0,219

0,050

L. monocytogenes 9156/2 + № 7c (сыр)

0,042

0,212

0,233

L. monocytogenes 9156/2 + № 7-3488/3/1 (п/ф колбаски для жарки)

0,118

0,579

0,286

L. monocytogenes 9156/2 + № 3-3492/3/3 (пельмени)

0,031

0,316

0,061

L. monocytogenes 9156/2 + № 5557/1 (пресервы из сельди)

0,042

0,115

0,070

Контроль, L. monocytogenes 5642/6

0,223

0,000

0,000

Контроль, L. monocytogenes 9156/2

0,088

0,000

0,000

Контроль, стерильная среда

0,000

0,000

0,000

Заключение

Показано, что L. monocytogenes способны формировать биопленки в монокультуре при 37ºС, однако, эта способность утрачивается ими при понижении температуры до комнатной или температуры холодильника. Тем не менее, сопутствующая пищевым продуктам микробиота способна стимулировать процесс совместного образования биопленки. Таким образом, отмечено влияние как абиотических, так и биотических факторов на биологию возбудителя листериоза. Кроме того, в проведенной нами работе не было установлено четкой зависимости интенсивности образования биопленки листериями от источника выделения сапрофитных бактерий, что свидетельствует о необходимости уделять особое внимание изучению взаимодействия листерий и сапрофитных бактерий, контаминирующих пищевые продукты, при проведении эколого-эпидемиологических исследований.

Рецензенты:

Крылова Н.В., д.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории фавивирусных инфекций ФГБУ НИИЭМ им. Г.П. Сомова СО РАМН, г. Владивосток;

Пивненко Т.Н., д.б.н., профессор, главный научный сотрудник НИЦ «Морские биотехнологии» ФГБОУ ВПО «Дальрыбвтуз», г. Владивосток.