Синдром системного воспалительного ответа (ССВО) - воспалительный ответ на уровне целостного организма, в основе его развития при неинфекционной патологии лежит значительный рост концентрации провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНО-α) в системной циркуляции, происходящий при повреждении тканей [1].При этом практически отсутствуют исследования посвященные комплексной оценке показателей опиоидергической системы и уровня провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ФНО-α, ИЛ-6) в динамике экспериментального ИИ у крыс.Учитывая вышесказанное целью работы былакомплексная оценка динамики(на 1, 3, 7 и 14 сутки)содержания β-эндорфина,провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНО-α) и размеров очага инфаркта мозгау крыс с экспериментальнымИИ.
Материалы и методы. Исследование выполнено в лаборатории кафедры общей и клинической патофизиологии КубГМУ. Иммуноферментные исследования (ИФА) проводились на базе ЦНИЛ ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России. Эксперименты проведены на 60 белых нелинейных самцах крыс средней массой - 200±25 гр. Содержание животных и постановка экспериментов проводилась в соответствии с требованиями приказов № 1179 МЗ СССР от 11.10.1983 года и № 267 МЗ РФ от 19.06.2003 года, а также международными правилами «GuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimals».
Животные были разделены на 2 группы:
- 1 группа (n=20) - контрольная - интактные животные подвергались эвтаназии без оперативного вмешательства.
- 2 группа (n=40) - животные с моделированием ИИ. Выведение животных из эксперимента производили по 10 животных на 1, 3, 7 и 14 сутки после моделирования ИИ.
Все потенциально болезненные вмешательства в проводимых экспериментах, а также эвтаназия осуществлялись под комбинированным инъекционным наркозом: золетил 0,3 мг в/м («Virbac» Франция), ксиланит 0,8 мг в/м (ЗАО «НИТА-ФАРМ, Россия, г. Саратов), атропина сульфат 0,1% раствор - 0.01 мл п/к из расчета на 100 гр. массы тела животного [3, 4].
Моделирование ИИ осуществляли путем создания у крыс острой локальной церебральной ишемии путем коагуляции правой средней мозговой артерии (ПСМА) [3].Эвтаназию крыс выполняли с соблюдением правил проведения работ при использовании экспериментальных животных, путем декапитации под стандартным наркозом. Непосредственно перед эвтаназией проводили забор крови путем венесекции общей яремной вены у крыс. После наступления летального исхода для последующего гистологического исследования производили изъятие ГМ.
Определение уровня β-эндорфина в плазме крови количественно проводили иммуноферментным методом с помощью набора «ElabscienceBiotechnologyCo., Ltd», (Китай). Определение уровняИЛ-1β в плазме крови проводили иммуноферментным методом с помощью набора «RayBiotech, Inc.» (Германия). Определение уровня ИЛ-6 в плазме крови проводили иммуноферментным методом с помощью набора «CusabioBiotechCo., Ltd» (Китай). Определение уровняФНО-α в плазме крови проводили иммуноферментным методом с помощью набора «RayBiotech, Inc.», (Германия). Учет реакции, построение калибровочных графиков и определение концентрации показателей проводили на фотометревертикального сканирования «ANTHOS 2010» (Австрия) с помощью программного обеспечения «Auswerte-Softwere anthos labtec», версия 2.3.0.7.
ГМ подвергался двукратной промывке в охлажденном растворе 0,9% хлорида натрия, с последующей его заморозкой и хранением при -350С. Размер очага церебральной ишемии определяли тетразолиевым методом на макросрезах [5].
Показатель «удельный объем инфаркта мозга» определяли как соотношение объема очага инфаркта мозга к объему всего мозга.
Статистическую обработку полученных данных осуществляли методами непараметрической статистики с использованием программного обеспечения «Statistika 6.0 forWindows» фирмы «StatSoftInc.». Полученные результаты исследуемых групп после статистической обработки выражали в виде средних значений (M) и ошибки среднего (m). Сравнение выборок проводилось по непараметрическому критерию Манна-Уитни, с установлением уровня значимости *p≤0,05. Величины средних значений в таблицах указаны в границах M±m.
Результаты исследования и их обсуждение. При ИИ происходит переход воспалительного ответа на системный уровень, что проявлялось в виде развития синдрома системного воспалительного ответа (ССВО) [1].
Главная роль в развитии патологических изменений при развитии ССВО отводится провоспалительным цитокинам (ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНО-α)[1].
Синтез ИЛ-1 микроглией в ответ на развитие церебральной ишемии является активирующим сигналом для запуска образования других провоспалительных цитокинов (ИЛ-6 и ФНО-α), а также стимуляции астроцитов к продукции потенциальных нейротоксичных веществ, провоспалительные цитокины, АФК и метаболиты арахидоновой кислоты [1].
У крыс группы 2 на 1 сутки после моделирования ИИ содержание ИЛ-1β в плазме крови достоверно (р≤0,05) выросло на 93,34% по сравнению с интактными животными группы №1. К 3 суткам уровень ИЛ-1β достоверно (р≤0,05) увеличился еще на 74,17% (табл.1). На 7 сутки после моделирования ИИ содержание ИЛ-1β достоверно (р≤0,05) снизилось на 65,36% по сравнению с 3 сутками.
На 14 сутки после моделирования ИИ уровень ИЛ-1β в плазме крови животных группы 2 вернулся к уровню 1 суток. Однако оставался достоверно (р≤0,05) выше на 93,34 % по сравнению с интактными животными (табл. 1).
Таблица 1
Динамика уровня ИЛ-1β у животных с экспериментальным
ишемическим инсультом
|
Показатель |
Контроль |
1 сутки |
3 сутки |
7 сутки |
14 сутки |
|
ИЛ- 1β М |
30,93 |
464,60 |
1798,99 |
623,08 |
407,73 |
|
±m |
7,90 |
127,43 |
586,25 |
56,97 |
125,34 |
|
р |
|
<0,05 |
<0,05 |
<0,05 |
<0,05 |
|
р* |
|
|
<0,05 |
<0,05 |
>0,05 |
|
р** |
|
|
|
<0,05 |
<0,05 |
|
р*** |
|
|
|
|
<0,05 |
Примечание:ИЛ-1β - интерлейкин-1β; р - достоверность различия по отношению исходному показателю; р*- достоверность различия по отношению показателя 1 суток после моделирования ишемического инсульта; р**- достоверность различия по отношению показателя 3 суток после моделирования ишемического инсульта; р***- достоверность различия по отношению показателя 7 суток после моделирования ишемического инсульта.
ИЛ-6 синтезируется многими типами клеток, обеспечивающими запуск и регуляцию воспаления и иммунного ответа. ИЛ-6 активирует экспрессию молекул адгезии и хемотаксис лейкоцитов, а также является важнейшим индуктором острофазного ответа [1].
Показано, что ИЛ-1 и ФНО-α являются мощными индукторами ИЛ-6-синтетазы в астроцитах: быстрое увеличение содержания микроглиального ИЛ-1β в первые 1-2 ч церебральной ишемии вызывает усиленный синтез ИЛ-6 [1].
У животных группы 2 уровень ИЛ-6 повышался в 1 сутки и достигал максимума к 3 суткам. В дальнейшем имело место стойкое значительное повышение уровня ИЛ-6 в течение всего периода наблюдения (табл. 2).
Таблица 2
Динамика уровня ИЛ-6 у животных с экспериментальным
ишемическим инсультом
|
Показатель |
Контроль |
1 сутки |
3 сутки |
7 сутки |
14 сутки |
|
ИЛ-6 М |
0,43 |
6,87 |
10,37 |
11,52 |
10,20 |
|
±m |
0,16 |
1,93 |
1,91 |
2,73 |
2,83 |
|
р |
|
<0,05 |
<0,05 |
<0,05 |
<0,05 |
|
р* |
|
|
<0,05 |
<0,05 |
<0,05 |
|
р** |
|
|
|
>0,05 |
>0,05 |
|
р*** |
|
|
|
|
>0,05 |
Примечание:ИЛ-6 - интерлейкин-6;р - достоверность различия по отношению исходному показателю; р*- достоверность различия по отношению показателя 1 суток после моделирования ишемического инсульта; р**- достоверность различия по отношению показателя 3 суток после моделирования ишемического инсульта; р***- достоверность различия по отношению показателя 7 суток после моделирования ишемического инсульта.
ФНО-α оказывает токсическое действие на нейроны путем активации системы генерации активных форм кислорода (АФК), что резко индуцирует процессы перекисного окисления липидов, в том числе, за счет взаимодействия с сигнальной системой сфингомиелинового цикла [2]. ФНО-α помимо токсического влияния, в низкой (физиологической) концентрации, оказывает защитный эффект на нейроны, путем увеличения экспрессии факторов антиоксидантной системы [2]. ФНО-α наряду с ИЛ-1β и ИЛ-6 является ключевыми медиатором микроглиальных нейроиммунных функций [1]. Таким образом, изменение его содержания влияет на степень повреждения ткани мозга. После моделирования ИИ уровень ФНО-α у животных группы №2 возрастал и оставался достоверно (р≤0,05) повышенным (более чем на 50%) без существенной динамики с 1 до 14 суток, что объясняет большую активность процессов свободно-радикальногоокисления у крыс с данной моделью патологии [6-9] (табл. 3).
Таблица 3
Динамика уровня ФНО-α у животных с экспериментальным
ишемическим инсультом
|
Показатель |
Контроль |
1 сутки |
3 сутки |
7 сутки |
14 сутки |
|
ФНО-α М |
8,41 |
17,82 |
18,36 |
17,82 |
21,01 |
|
±m |
2,53 |
6,31 |
7,20 |
3,79 |
8,06 |
|
р |
|
<0,05 |
<0,05 |
<0,05 |
<0,05 |
|
р* |
|
|
>0,05 |
>0,05 |
>0,05 |
|
р** |
|
|
|
>0,05 |
>0,05 |
|
р*** |
|
|
|
|
>0,05 |
Примечание: ФНО-α - фактор некроза опухоли-α; р - достоверность различия по отношению исходному показателю; р*- достоверность различия по отношению показателя 1 суток после моделирования ишемического инсульта; р**- достоверность различия по отношению показателя 3 суток после моделирования ишемического инсульта; р***- достоверность различия по отношению показателя 7 суток после моделирования ишемического инсульта.
β-эндорфин важнейший представитель семейства ОП является агонистом µ и δ классических ОР [10]. Имеются данные свидетельствующие о нейропротекторном, противовоспалительном, антиоксидантном, нейротрофическом, антигипоксическом эффектах активации δ-опиоидных рецепторов [10].
Содержание β-эндорфина в плазме крови интактных животных составило 27,52±6,14 пг/мл (табл. 4).
Таблица 4
Содержание β-эндорфина у животных с экспериментальным
ишемическим инсультом
|
Показатель |
Контроль |
1 сутки |
3 сутки |
7 сутки |
14 сутки |
|
β-эндорфин, М |
27,51 |
13,95 |
11,10 |
9,63 |
9,62 |
|
±m |
6,13 |
1,88 |
1,33 |
2,65 |
3,02 |
|
р |
|
<0,05 |
<0,05 |
<0,05 |
<0,05 |
|
р* |
|
|
<0,05 |
<0,05 |
<0,05 |
|
р** |
|
|
|
>0,05 |
>0,05 |
|
р*** |
|
|
|
|
>0,05 |
Примечание:р - достоверность различия по отношению исходному показателю; р*- достоверность различия по отношению показателя 1 суток после моделирования ишемического инсульта; р**- достоверность различия по отношению показателя 3 суток после моделирования ишемического инсульта; р***- достоверность различия по отношению показателя 7 суток после моделирования ишемического инсульта.
В плазме крови животных из группы 2 на 1 сутки после моделирования ИИ уровень β-эндорфина составил 13,95±1,88 пг/мл, что достоверно (р≤0,05) меньше на 49,31 %, чем в плазме крови животных группы 1 (табл. 4).К 3 суткам после моделирования ИИ в плазме крови животных группы 2 уровень β-эндорфина по сравнению с 1 сутками стал достоверно (р≤0,05) меньше на 20,35% и составил 11,11±1,33 пг/мл. Это достоверно (р≤0,05) меньше на 59,62%, чем в плазме крови животных группы №1 (табл. 4).
На 7 сутки после моделирования ИИ в плазме крови животных группы 2 содержание β-эндорфина по сравнению с 1 сутками стало достоверно (р≤0,05) меньше на 30,89%. По сравнению с 3 сутками содержание β-эндорфина достоверно (р≥0,05) не изменилось и составило 9,64±2,66 пг/мл, что достоверно (р≤0,05) меньше на 64,97%, чем в плазме крови животных группы 1 (табл. 4).
К 14 суткам после моделирования ИИ в плазме крови животных группы 2 уровень β-эндорфина по сравнению с 3 и 7 сутками достоверно (р≥0,05) не изменился. По сравнению с 1 сутками он остался достоверно (р≤0,05) меньше на 30,96% и составил 9,63±3,02 пг/мл (табл. 4).
Итак, моделирование ИИ вызывало падение уровня β-эндорфина на 1 сутки. К 3 суткам содержания β-эндорфина достигало минимума и оставалось на этом уровне на 7 и 14 сутки.
Для оценки динамики объема очага инфаркта определяли показатель «удельный объем инфаркта мозга» путем подсчета соотношения объема очага инфаркта мозга к объему всего мозга.
На срезах мозга животных группы2,сделанных на 1 и 3 сутки, четко выявлялась область инфаркта мозга, локализованная в зоне кровоснабжения ПСМА с захватом неокортекса и небольшого участка каудопутамена. Удельный объем очага инфаркта мозга у крыс группы 2 на 1 сутки составил 0,108±0,003 у.е. На 3 сутки он достоверно (р≤0,05) возрастал на 18,3% и составлял 0,132±0,010 у.е.
Выводы.При моделировании ишемического инсульта у крыс путем коагуляции ПСМА нарушение кровотока приводит к развитию инфаркта мозга, который локализуется преимущественно в неокортексе и захватывает небольшую область каудопутамена. На 3сутки имеет место прирост его объема на 18,3%.
Моделирование ишемического инсульта сопровождается значительным ростом содержания провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНО-α) в периферической крови. Это явление сопровождается прогрессирующим снижением уровняβ-эндорфина, что указываетна депрессию эндогенной опиоидергической стресс-лимитирующей системы при экспериментальном ишемическом инсульте.
Рецензенты:Колесникова Н.В., д.б.н., профессор,заведующая ЦНИЛ Отдела клинической экспериментальной иммунологии и молекулярной биологии ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России, г. Краснодар;
АбушкевичВ.Г., д.м.н., профессор кафедры нормальной физиологии ГБОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет Минздрава России» г. Краснодар.