Материалы и методы
В исследованиях было использовано 140 взрослых особей большой ложноконской пиявки H. sanguisuga. Для изучения географических особенностей аминокислотного обмена использованы пиявки из 11-ти водных объектов различных регионов России, Украины и Казахстана: оз. Горелое и р. Уды (Харьковская обл.), оз. Глубокое (Луганская обл.), р. Лесной Воронеж (Тамбовская обл.), ерик Судомойка (Волгоградская обл.), р. Челбас (Краснодарский край), р. Бобровка и р. Сысерть (Свердловская обл.), оз. Еловое (Челябинская обл.), р. Нура и оз. Боровое (Акмолинская обл.). При сравнительной оценке аминокислотного спектра тканей пиявок, обитающих в водных экосистемах различных природно-климатических зон, использовали условные термины: европейская форма H. sanguisuga (регионы восточной части Украины и европейской территории России, где среднегодовая температура находится в диапазоне от +6.1єС до +11.9єС) и азиатская форма (Урал и северная часть Казахстана - регионы со среднегодовой температурой от +2.3єС до +3.2єС). Сезонную динамику концентраций свободных аминокислот (АК) в тканях пиявок оценивали у особей, отловленных в разные сезоны года в Белоярском водохранилище (Свердловская обл.): весной (I-я декада мая), летом (I-я декада августа) и осенью (III-я декада октября). Содержание пиявок, доставленных в лабораторию, осуществляли в соответствии с правилами, принятыми Европейской Конвенцией по защите животных, используемых для экспериментальных и научных целей [1].
Пул свободных аминокислот в тканях пиявок определяли методом ионообменной хроматографии с помощью автоматического анализатора ААА-339М фирмы Mikrotechna (Chechia). Подготовлено 140 проб, проведено 3220 элементо-определений.
Экспериментальные данные обрабатывали с использованием пакета лицензионных прикладных программ «Statistica for Windows 6.0.». Различия между сравниваемыми выборками считали статистически значимыми при p < 0.05; p < 0.01 - 0.001.
Результаты и обсуждение
Показано, что независимо от региона исследования, качественный состав аминокислотного спектра тканей H. sanguisuga постоянен, а его количественная структура претерпевает существенные изменения (табл.).
У европейской формы пиявок суммарный фонд свободных АК в тканях подвержен географической изменчивости (p < 0.001). Наибольшая дисперсия характерна для тканевых концентраций глутаминовой кислоты, пролина, аланина, цистеина, γ-аминомасляной кислоты, гистидина и аргинина (p = 0.000); наименьшая изменчивость выявлена для содержания фенилаланина (p = 0.020) (табл.).
У особей азиатской формы H. sanguisuga, в отличие от европейских пиявок, не выявлено географической изменчивости, как для суммарного фонда АК, так и для паттернов незаменимых (НАК) и заменимых (ЗАК) аминокислот (p > 0.05) (табл.). Уровень содержания аланина и валина, которым принадлежит ключевая роль в энергетическом гомеостазе и синтезе глюкозы, в тканях азиатской формы большой ложноконской пиявки, как показал дисперсионный анализ, подвержен наименьшей изменчивости (p = 0.001). Для концентраций остальных свободных АК, содержащихся в тканях пиявок азиатских популяций, выявлена достаточно высокая дисперсия (p < 0.000). Наибольшей внутривидовой изменчивости подвержены тканевые концентрации цистеиновой кислоты, пролина, цистеина, метионина, γ-аминомасляной кислоты, аргинина (p = 0.000) (табл.).
Диапазоны процентного содержания свободных аминокислот (min-max) и дисперсия их концентраций (Н-критерий Краскела - Уоллеса) в тканях H. sanguisuga различных географических популяций
|
АК, %
|
H. sanguisuga |
|||||
|
Европейская форма n = 60 |
Азиатская форма n = 50 |
|||||
|
min-max |
H5; 60 |
p |
min-max |
H4; 50 |
p |
|
|
Cysteic Acid Aspartic Acid Threonine Serine Glutamic Acid + Gln Proline Glycine Alanine Valine Cystine Methionine Isoleucine Leucine Tyrosine Phenylalanine GAВA Ornithine Lysine Histidine Arginine |
0.56 - 1.33 5.93 - 10.7 3.51 - 5.89 4.55 - 8.36 24.6 - 29.3 0.66 - 3.55 6.29 - 7.94 14.1 - 19.4 5.87 - 7.19 0.21 - 1.08 0.94 - 1.80 1.74 - 3.56 2.60 - 6.01 0.84 - 1.92 1.56 - 2.66 0.32 - 0.94 1.2 - 2.26 2.74 - 5.55 0.39 - 1.48 0.30 - 0.89 |
48.8 42.4 36.2 49.6 54.0 51.1 37.0 52.8 46.1 50.7 26.8 45.2 32.9 30.1 13.4 51.0 38.7 46.3 50.8 55.8 |
0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.020 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 |
0.56 - 2.59 8.17 - 14.3 4.28 - 6.68 5.05 - 6.75 17.1 - 25.5 0.30 - 0.72 6.15 - 8.43 14.6 - 17.9 5.47 - 7.70 0.31 - 0.67 1.77 - 3.83 2.47 - 3.47 4.16 - 5.88 1.40 - 2.19 1.79 - 2.69 0.13 - 0.87 1.24 - 2.52 3.95 - 5.72 1.21 - 2.15 0.68 - 1.72 |
40.1 37.9 22.1 20.3 25.1 43.5 26.3 18.7 18.7 44.1 42.7 20.9 33.0 22.6 25.4 45.5 35.9 33.2 35.9 43.0 |
0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.001 0.001 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 |
|
Фонд АК, мкмоль/100г НАК ЗАК |
1512 - 2311 23.5 - 30.3 66.1 - 72.7 |
34.9 22.2 46.3 |
0.000 0.005 0.000 |
2112 - 2559 31.5 - 33.6 63.0 - 66.0 |
7.42 7.42 6.29 |
0.115 0.115 0.178 |
Основным критерием аминокислотного баланса в организме являются показатели антитоксического индекса Фишера (ИФ) - соотношение концентраций аминокислот с разветвленной углеродной цепью (валин, изолейцин, лейцин) к ароматическим АК (тирозин, фенилаланин), составляющее в норме 0.3 ± 0.5. По нашим данным, значения ИФ у европейской формы пиявок лежат в диапазоне 3.23-4.43, а азиатской - от 3.22 до 3.94, что несколько отклонено от нормы, но не критично, и связано, скорее всего, с экологическими особенностями мест обитания.
Сравнительный анализ показал, что у особей H. sanguisuga, обитающих в водных экосистемах Урала и Северного Казахстана, по сравнению европейскими особями, более высокий уровень суммарных концентраций свободных АК тканей (p < 0.05) (табл.). В тканях азиатских пиявок повышено процентное содержание цистеиновой кислоты, аспарагиновой кислоты, треонина, глицина, метионина, тирозина, гистидина и аргинина, но понижено - серина, глутамата и глутамина, пролина, аланина и цистеина. Обнаружено, что обитание пиявок в условиях короткого безморозного периода и холодной продолжительной зимы сопровождается значительным повышением пула НАК.
Установлено, что физиологические процессы, связанные с сезонными особенностями биологического цикла гирудинид, обусловливают качественные и количественные изменения аминокислотного спектра в их тканях. Суммарные концентрации свободных АК в тканях H.sanguisuga значимо изменяются по сезонам: осень > весна > лето (p < 0.05) (рис.).
Сезонная динамика концентраций основных метаболических групп аминокислот в тканях больших ложноконских пиявок
Дисперсионный анализ выявил очень высокую сезонную изменчивость аминокислотного фонда ложноконской пиявки (H2; 30 = 26.7; p = 0.000). Максимальные концентрации свободных АК (3058.6 ± 139.3 мкмоль/100 г) выявлены в тканях осенних особей (p < 0.05) (рис.). Аминокислотный пул, уходящих в анабиоз пиявок, повышен за счет кратного роста концентраций цистеиновой кислоты, глутаминовой кислоты и глутамина. Наиболее примечательными отличиями этой сезонной группы пиявок являются полная утилизация пролина, метионина и γ-аминомасляной кислоты, и присутствие в их тканях цитруллина и незаменимой аминокислоты триптофана, которые в летних и весенних биопробах H. sanguisuga не выявлялись.
У весенних пиявок, вышедших из зимнего анабиоза, суммарный фонд АК в тканях по сравнению с осенними особями снижен в 1.2 раза (2570.1 ± 222.9 мкмоль/100г) (p < 0.05) (рис.). Аминокислотный пул весенних пиявок за зимний сезон полностью утилизировал цитруллин и триптофан, а также потерял существенные количества цистеиновой кислоты и глутаминовой кислоты и глутамина, их содержание снизилось в 4.6 и 4.7 раза соответственно, однако концентрации остальных АК значимо повысились, что обусловлено активацией обменных процессов H. sanguisuga (p < 0.05).
Летний период, наиболее благоприятный в биологическом цикле гирудинид, когда происходит интенсивное наращивание мышечной массы и основная репродуктивная деятельность, характеризуется пониженным уровнем аминокислотного обмена H. sanguisuga. Суммарные концентрации АК в тканях летних особей (927.6 ± 73.4 мкмоль/100г) ниже, чем у весенних и осенних пиявок в 2.8 и в 3.3 раза соответственно (p < 0.01) (рис.). В тканях этой сезонной группы H. sanguisuga отмечены минимальные концентрации всех свободных АК, за исключением пролина, участвующего в синтезе коллагена (p < 0.05). Наибольший обвал концентраций свободных АК в тканях летних особей, по сравнению с весенними, отмечен для цистеиновой кислоты, аспарагиновой кислоты, цистеина и для незаменимых АК: треонина, валина, метионина, изолейцина, лейцина, гистидина и аргинина (p < 0.01).
Отмечено, что суммарные концентрации пула незаменимых АК пиявок достаточно высоки и убывают в ряду весна < осень ≤ лето (рис.). В то же время низкий показатель соотношения НАК/ЗАК у осенних особей H. sanguisuga (0.10) указывает на аминокислотный дисбаланс в их тканях. О том, что у пиявок, уходящих в анабиоз, нарушен азотистый обмен, свидетельствует и высокое значение антитоксического индекса Фишера (ИФ=8.26). Пул заменимых АК в тканях осенних особей H. sanguisuga составляет 82.2 % от суммарного фонда, при этом на долю глутаминовой кислоты и глутамина приходится 67.0 %. Глутаминовая кислота поддерживает энергетический, медиаторный и пластический обмены в организме. Она служит предшественником при синтезе белков, ряда биологически активных соединений, обеспечивает синтез заменимых АК. При стрессовом напряжении организма (в нашем случае - околонулевая температура воды) глутамат служит естественным поставщиком кетоглутарата и янтарной кислоты, являясь наиболее эффективным субстратом в энергообеспечении. У особей ложноконских пиявок других сезонных групп глутаминовая кислота содержится в гораздо меньшем количестве: у летних особей - 23.6 %, у весенних - 17.0 % от суммарного фонда АК. Таким образом, выявленный нами высокий уровень глутамата в тканях осенних пиявок является необходимым метаболическим условием для поддержания процессов жизнеобеспечения H. sanguisuga, переходящих в зимний продолжительный анабиоз.
Заключение. Проведенные исследования установили общую закономерность внутривидовой изменчивости тканевого содержания пролина, цистеина, γ-аминомасляной кислоты и аргинина у обеих географических форм H. sanguisuga, что указывает на регулирующую роль данных АК в адаптации пиявок к экологическим особенностям изучаемых регионов. Обитание больших ложноконских пиявок в экстремальных климатических условиях сопровождается интенсификацией аминокислотного обмена и стабильно высокими концентрациями паттерна незаменимых аминокислот в тканях. Исследования сезонной изменчивости аминокислотного спектра в тканях пиявок H. sanguisuga показали, что наибольшее влияние на обменные процессы гирудинид оказывает осеннее понижение температуры. Высокая степень аминокислотного дисбаланса в тканях пиявок, уходящих в зимний анабиоз, по-нашему мнению, может способствовать развитию экологической пластичности метаболических процессов и выживанию не только в период зимнего анабиоза, но и формированию адаптивных стратегий при влиянии экстремальных факторов различного генеза.
Исследования проведены при поддержке Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине», грант №12-П-4-1049.
Рецензенты:
Хохуткин И.М., д.б.н., ведущий научный сотрудник Института экологии растений и животных, Уральское отделение Российской Академии наук, г. Екатеринбург;
Ковальчук Л.А., д.б.н., ведущий научный сотрудник Института экологии растений и животных, Уральское отделение Российской Академии наук, г. Екатеринбург.