Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,813

THE DETERMINATION OF VERAPAMIL IN THE GEL BY THE METHOD OF PLANAR CHROMATOGRAPHY

Mezenova T.D. 1 Ushakova L.S. 1 Leonova V.N. 1 Zhidkova Yu.Yu. 2 Penevskaya N.A. 2
1 Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - the branch of the Volgograd State Medical University
2 Omsk state medical Academy
Разработана методика идентификации и количественного определения верапамила в геле. Использовали метод тонкослойной хроматографии с видеоденситометрической регистрацией аналитического сигнала. Для хроматографирования использовали пластинки марки «Sorbfil ПТСХ-АФ-В-УФ» размером 10х15 см. Подвижная фаза - система растворителей «ацетон - вода очищенная» (8:2). Детектирующий реагент – реактив Бушарда. На жёлтом фоне реактива появляются пятна коричневого цвета с Rf 0,55±0,01. Предел обнаружения реагента 0,4 мкг. Валидация методики количественного анализа проведена по следующим критериям: чувствительность, линейность, правильность и сходимость результатов. Градуировочный график описывается уравнением S = 1,69.104 m; коэффициент корреляции r = 0,995 в интервале концентраций 0,5–2 мкг/мкл. Правильность методики определяли методом «введено-найдено» на 5 уровнях концентраций стандартного образца (RSD = 3,73%). Предел обнаружения количественного определения - 1,2 мкг. Сходимость оценивали по результатам повторного определения содержания верапамила в разных растворах и на разных пластинках. Данным методом определено 0,93±0,057 г верапамила в 100 г геля (RSD = 5,9%). Полученные данные свидетельствуют, что методика специфична, имеет достаточно высокую чувствительность и эффективность. Методика количественного определения отвечает необходимым требованиям по показателям чувствительность, линейность, правильность и сходимость.
The technique of identification and quantitative determination of verapamil in the gel has been developed. The analytical signal was used the method of thin-layer chromatography with videodensitometric registration. The plate marks «Sorbfil PTSH-AF-V-UV» size 10x15 cm was used out for the chromatography. The mobile phase is the solvent system of acetone-purified water (8:2). The reagent of Bouchard is the detecting reagent. Brown spots with Rf of 0,55±0,01 appear on a yellow background reagent. The limit of detection reagent is 0,4 mcg. The validation of methods of quantitative analysis has been carried out according to the following criteria: sensitivity, linearity, accuracy and precision of results. The calibration curve is described by the equation S = 1,69∙104 m; the correlation coefficient of by the r = 0,995 in the concentration range of 0,5 - 2 mcg/mcl. The accuracy of the technique was determined by the method «input – found» on the 5 levels of concentration of standard sample (RSD = 3,73%). The detection limit of quantitative determination is 1,2 mcg. Convergence was assessed by the results of the second content determination of verapamil in different solutions and different plates. is 0,93±0,057 g of verapamil in 100 g of gel has been defined by this method (RSD = 5,9%). The data obtained indicate that the technique is specific, has a sufficiently high sensitivity and efficiency. Technique for quantitative determination meet the standards in terms of sensitivity, linearity, accuracy and precision.
quantitative determination
identification
videodensitometry
thin layer chromatography
verapamil
Одним из способов лечения рубцов и шрамов является использование различных кремов, мазей и гелей, содержащих вещества антирубцового действия. Верапамил даёт положительный результат при лечении и профилактике образования келоидных и гипертрофированных рубцов [4]. Компоненты геля, содержащего верапамил, имеют близкие максимумы светопоглощения в УФ-области, поэтому непосредственно каждое лекарственное вещество методом УФ-спектрофотометрии идентифицировать и количественно определить не представлялось возможным. В связи с этим нами была разработана методика идентификации и количественного определения верапамила методом тонкослойной хроматографии с денситометрической регистрацией аналитического сигнала.

Цель работы. Разработать методику идентификации и количественного определения верапамила в геле, в 100 г которого содержится 1 г данного вещества.

Материал и методы исследования. В качестве растворителя геля был выбран ацетон. При растворении в ацетоне образуется прозрачный бесцветный раствор. Для хроматографирования использовали пластинки марки «Sorbfil ПТСХ-АФ-В-УФ» для высокоэффективной тонкослойной хроматографии размером 10х15 см. Подвижной фазой служила система растворителей «ацетон - вода очищенная» (8:2) [2]. Хроматографирование проводили в стеклянной камере, насыщенной парами растворителя. Для приготовления стандартного образца (СО) 0,0125 г верапамила (ФС 42-0224-07) (точная навеска) помещали в мерную колбу вместимостью 25,0 мл, растворяли в ацетоне и доводили ацетоном раствор до метки. Концентрация СО верапамила составила 0,5 мкг/мкл.

Приготовление раствора геля: около 1,25 г (точная навеска) геля помещали в мерную колбу вместимостью 25,0 мл, растворяли в ацетоне и доводили ацетоном раствор до метки.

На линию старта хроматографической пластинки длиной 15 см наносили раствор СО с содержанием верапамила 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5; 1,75 мкг в пятне. На этой же пластинке обозначали линии контрольных треков, на которые наносили ацетоновый раствор геля объемом 3,0 мкл. Пробы наносили при помощи микрошприца МШ-10. Пластинки помещали в камеру для хроматографирования объемом 2000 см3, насыщенную парами растворителя. После подъема растворителя на необходимый уровень пластинки вынимали, высушивали в вытяжном шкафу при комнатной температуре до удаления паров растворителя. Длина пробега растворителя около 8 см. Детектирующий реагент - реактив Бушарда. На жёлтом фоне реактива появляются пятна коричневого цвета с Rf 0,58±0,01.

Необходимо учитывать, что пятна очень неустойчивы и после высыхания пластинки обесцвечиваются. Поэтому сразу после проявления в мокром виде пластинки сканировали при помощи планшетного сканера «HP Scanjet 3670» (разрешение 100 dpi) и далее осуществляли ее цифровую обработку с помощью компьютерной программы «Видеоденситометр Sorbfil» (г. Краснодар).

Количественное определение проводили методом абсолютной калибровки (внешнего стандарта), по градуировочному графику зависимости «масса вещества - площадь пика» (линейная аппроксимация). Статистическая обработка результатов проводилась в соответствии с ОФС «Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологических испытаний» [1].

Результаты исследования и их обсуждение

Определение хроматографических характеристик.

Чувствительность детектирующего реагента устанавливали по величине предела обнаружения (ПО), который рассчитывали с учётом стандартного отклонения сигнала и углового коэффициента градуировочного графика. ПО составляет 0,4 мкг. Специфичность определяли по величине Rf пятна контрольного трека, которая должно соответствовать Rf пятен стандартного образца (0,58±0,01). На треках контрольного образца визуально обнаруживалось пятно коричневого цвета с Rf, соответствующей стандартным образцам (рис. 1, 2).

Рис. 1. Хроматограмма СО верапамила.

Рис. 2. Хроматограмма ацетонового раствора геля (2 - верапамил).

Эффективность пластинки около 800 теоретических тарелок.

Валидация методики количественного анализа проведена по следующим критериям: чувствительность количественного определения, линейность, правильность и сходимость результатов [5].

Линейность устанавливали по градуировочным графикам, полученным при компьютерной обработке хроматограмм в координатах площадь пика (S) - масса (m, мкг). Под площадью пика в видеоденситометрии понимается интегральная характеристика, включающая собственно площадь пятна, его объём в пространстве и интенсивность его окраски [3]. По данным градуировочных графиков рассчитывали статистические характеристики и коэффициент корреляции. Методом наименьших квадратов определяли значимость свободного члена линейной зависимости (а), углового коэффициента (b) и чувствительность количественного определения. Расчеты проводили с помощью программы Microsoft Excel. В диапазоне концентраций 0,5-2,0 мкг в пятне наблюдается прямолинейная зависимость. Градуировочный график описывается уравнением S=1,69.104 m, коэффициент корреляции r = 0,995 (рис. 3).

Рис. 3. Градуировочный график верапамила.

Предел количественного определения (quantitation limit), рассчитанный по величине стандартного отклонения сигнала и углового коэффициента градуировочного графика, составляет 1,2 мкг.

Правильность методики определяли методом «введено-найдено». По уравнению градуировочного графика рассчитывали содержание верапамила на 5 уровнях концентраций СО и определяли метрологические характеристики (табл. 1).

Таблица 1

Оценка правильности определения верапамила

Уровень

Взято, мкг

Найдено, мкг

Открываемость, %

Метрологические

характеристики

1

1,0

1,03

103

 

Хср = 101

SD = 1,67

ΔX=3,77

RSD = 5,22%

Е% =3,73%

1

1,0

1,12

112

2

1,5

1.52

101

2

1,5

1,41

94

3

2,0

1,90

95

3

2,0

2,04

102

4

2,5

2,50

100

4

2,5

2,38

98

5

3,0

3,18

106

5

3,0

2,97

99

Сходимость методики оценивали по результатам повторного определения содержания верапамила в геле. Результаты и метрологические характеристики представлены в таблице 2.

Таблица 2

Результаты определения верапамила в геле. Оценка сходимости

Содержание верапамила в геле, г/100 г

Метрологические характеристики

0,90

Хср = 0,925

DХ = 0,057

SD = 0,055

RSD% = 5,9%

Е% = 6,2%

 

1,01

0,94

0,85

0,9

0,95

Выводы. В результате проведённых исследований разработана методика идентификации и количественного определения верапамила в геле методом планарной хроматографии на пластинках марки ПТСХ-П-В-УФ. Полученные данные свидетельствуют, что методика специфична, имеет достаточно высокую чувствительность и эффективность. Методика количественного определения отвечает необходимым требованиям по показателям чувствительность, линейность, правильность и сходимость.

Рецензенты:

Коновалов Д.А., д.ф.н., профессор кафедры фармакогнозии Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала ГБОУ ВПО «Волг ГМУ», г. Пятигорск;

Компанцева Е.В., д.ф.н., профессор кафедры фармацевтической химии и токсикологии Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала ГБОУ ВПО «Волг ГМУ», г. Пятигорск.