Нарушения метаболизма в миокарде при сахарном диабете приводят к развитию диабетической кардиомиопатии, существенно нарушающей функцию миокарда [9]. Резкие перепады уровня гликемии, изменения секреции контринсулярных гормонов, нарушения регуляторных воздействий могут в значительной степени модифицировать метаболический ответ на гипогликемию при сахарном диабете [5, 7].
Целью настоящего исследования являлось изучение особенностей энергообеспечения миокарда при инсулиновой гипогликемии у крыс с экспериментальным сахарным диабетом.
Материалы и методы исследования
Опыты выполнены на белых беспородных крысах самцах массой 200-240 г. Все животные содержались на стандартном пищевом рационе и перед каждым обследованием были лишены пищи в течение 18-24 часов; воду получали без ограничения. Экспериментальный сахарный диабет вызывали однократным внутрибрюшинным введением аллоксана (135 мг на кг массы тела). Развитие сахарного диабета контролировали, определяя наличие кетоновых тел и глюкозы в моче. Гипогликемическую кому (развитие судорожного синдрома с последующей утратой постуральных рефлексов) вызывали внутримышечной инъекцией инсулина в дозе 40 ЕД на кг массы [5]. Животные были разделены на 4 группы: 1-я группа - интактные животные (контроль), 2-я - животные, обследованные на 15-й день после введения аллоксана; 3-я - крысы, находящиеся в состоянии гипогликемической комы; 4-я - животные с 15-суточным экспериментальным сахарным диабетом в состоянии гипогликемической комы.
В сыворотке крови определяли концентрацию глюкозы, мочевой кислоты, мочевины, свободных жирных кислот (СЖК), лактата и триацилглицеролов (ТАГ), и суммарную концентрацию свободных аминокислот [2], в миокарде определяли содержание гликогена и ТАГ [3]. В гомогенате печени и миокарда (оба желудочка) исследовали активность глутаматдегидрогеназы (ГДГ, КФ 1.4.1.3), аланиновой аминотрансферазы (АлАТ, КФ 2.6.1.2), аспарагиновой аминотрансферазы (АсАТ, КФ 2.6.1.1), НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы (НАД-ИЦДГ, КФ 1.1.1.41), лактатдегидрогеназы (ЛДГ, КФ 1.1.1.27), сукцинатдегидрогеназы (СДГ, КФ 1.3.99.1) [3], АМФ-дезаминазы (АМФ-Д, КФ 3.5.4.6) [5]. Активность АсАТ, АлАТ, ГДГ, ЛДГ, НАД-ИЦДГ и СДГ выражали в мкмоль в минуту на г ткани, активность АМФ-Д - в нмоль в минуту на г ткани. Интенсивность гликолиза и гликогенолиза в гомогенате миокарда определяли по скорости накопления лактата в инкубационной среде, используя в качестве субстратов глюкозу, глюкозо-6-фосфат (Г-6-Ф) и гликоген [4]. Количество белка определяли по Лоури. Статистическую обработку проводили с использованием t критерия Стьюдента.
Результаты исследования и их обсуждение
На 15-е сутки у крыс с экспериментальным аллоксановым диабетом, кроме гипергликемии, обнаружено увеличение концентрации мочевины в крови (таблица 1) и повышение активности АлАТ, АсАТ и ГДГ в печени (таблица 2). Такие изменения азотистого обмена характерны для экспериментального сахарного диабета [1] и свидетельствуют об увеличении катаболизма аминокислот. Других изменений активности ферментов не обнаружено.
Таблица 1
Концентрация метаболитов в крови крыс при аллоксановом диабете и инсулиновой гипогликемии
|
Показатель |
|
Группа |
|||
|
1-я |
2-я |
3-я |
4-я |
||
|
Глюкоза |
M±m |
5,3±0,1 (20) |
7,9±0,7 (7)** |
1,7±0,1 (7)** |
2,1±0,2 (7)** |
|
СЖК |
M±m |
402±19 (22) |
360±41 (7) |
316±33 (7)** |
202±20 (7) ** |
|
Лактат |
M±m |
2.14±0.11 (19) |
2.10±0.18 (8) |
1.30±0.10 (8)* |
1.90±0.16 (8) |
|
ТАГ |
M±m |
1,12±0,07 (19) |
1,34±0,20 (7) |
0,94±0,08 (7) |
0,88±0,05 (7)** |
|
Мочевина |
M±m |
6,8±0.3 (20) |
13,6±3,2 (6)* |
2,3±0,2 (7)** |
22,0±3,8 (7)* |
|
Мочевая кислота |
M±m |
213±7 (20) |
242±14 (7) |
226±11 (7) |
270±16 (8)* |
|
Аминокислоты |
M±m |
7,1±0,2 (20) |
7,7±0,2 (7) |
6.3±0,2 (7)** |
3,8±0,3 (7)** |
Примечания: 1) концентрация глюкозы, мочевины, лактата, ТАГ и аминокислот в крови выражены в ммоль/л, концентрация мочевой кислоты и СЖК в крови - в мкмоль/л; 2) здесь и в таблицах 2, 3, 4, 5 - * - Р<0,05; ** - Р<0,01; 3) в скобках указано количество животных в группе.
Таблица 2
Активность ферментов азотистого обмена в печени крыс при аллоксановом диабете и инсулиновой гипогликемии
|
Показатель |
|
Группа |
|||
|
1-я |
2-я |
3-я |
4-я |
||
|
АсАТ |
M±m |
15.7±0.4 (24) |
18.7±0.6 (7)** |
14.1±0.4 (7) |
21.3±1.4 (7)** |
|
АлАТ |
M±m |
24.3±0.6 (24) |
28.5± 0.6 (7)** |
22.5±0.7 (7) |
30.5±1.5 (7)** |
|
ГДГ |
M±m |
0.61±0.03 (20) |
0.80±0.05 (7)* |
0.58±0.03 (7) |
0.66±0.02 (7) |
|
АМФ-Д |
M±m |
92±9 (20) |
79±8 (6) |
83±14 (6) |
161±15 (6)** |
Гипогликемия (в том числе инсулиновая) во всех случаях вызывает повышенную секрецию глюкокортикоидов, глюкагона и катехоламинов, а метаболические изменения, наблюдаемые у животных, находящихся в состоянии инсулиновой комы, являются результатом противоположно направленных гормональных влияний [1].
У крыс 3-ей группы в крови снижалось содержание субстратов, которые могут служить источниками энергии для миокарда (СЖК, глюкозы, лактата, ТАГ). Кроме того, обнаруживалось значительное уменьшение концентрации свободных аминокислот и мочевины в крови (таблица 1). Существенных изменений активности окислительных ферментов и ферментов азотистого обмена в печени не обнаружено. Оценивая в целом обнаруженные изменения, можно утверждать, что у животных этой группы катаболизм аминокислот в печени существенно не увеличивался.
У животных 4-ой группы активность исследованных ферментов азотистого обмена в печени была увеличена (таблица 2). Следует подчеркнуть, что повышенная активность АМФ-Д наблюдалась только в состоянии гипогликемической комы у крыс с сахарным диабетом. Реакция, катализируемая АМФ-Д, участвует не только в процессах пуринового обмена, она играет существенную роль в непрямом дезаминировании аминокислот в тканях. Поэтому увеличение активности АМФ-Д одновременно с нарастанием концентрации мочевой кислоты и мочевины в крови указывает на повышение катаболизма как пуриновых нуклеотидов, так и аминокислот [5]. В результате у крыс 4-ой группы значительно уменьшалась концентрация свободных аминокислот в крови. Увеличение распада аминокислот в печени может нарушать субстратное обеспечение синтеза белка. Таким образом, гипогликемия, возникающая при сахарном диабете, способна усугублять нарушения азотистого обмена, характерные для данного заболевания.
Содержание гликогена в миокарде у крыс с аллоксановым диабетом было понижено. В условиях гипогликемической комы концентрация полисахарида повышалась как у исходно здоровых животных, так и у крыс с диабетом (таблица 3). Концентрация ТАГ в миокарде уменьшалась у животных всех групп, изменения были наиболее значительными крыс 4-ой группы.
Таблица 3
Концентрация гликогена и триацилглицеролов в миокарде при аллоксановом диабете и инсулиновой гипогликемии
|
Показатель |
|
Группа |
|||
|
1-я |
2-я |
3-я |
4-я |
||
|
Гликоген, мг/г |
M±m |
2,48±0,10 (23) |
2,01±0,36 (7) |
4,31±0,59 (7) ** |
3,68±0,52 (7)* |
|
ТАГ, мкмоль/г |
M±m |
8,82±0,20 (23) |
4,22±0,46 (7)** |
7,60±0,42 (8)* |
2,77±0,36 (7)** |
У крыс с аллоксановым диабетом в миокарде не обнаружено изменений активности ЛДГ, НАД-ИЦДГ и СДГ, у крыс 3 группы, активность этих ферментов повышалась. При гипогликемии у животных с диабетом увеличивалась активность ферментов азотистого обмена (таблица 4).
Таблица 4
Активность ферментов в миокарде крыс при аллоксановом диабете и инсулиновой гипогликемии
|
Показатель |
|
Группа |
|||
|
1-я |
2-я |
3-я |
4-я |
||
|
ЛДГ |
M±m |
13,2±0,8 (16) |
14,9±1,1 (6) |
16,0±0,7 (8)* |
17,8±1,3 (8)* |
|
НАД-ИЦДГ |
M±m |
1,75±0,08 (18) |
1,59±0,08 (8) |
2,86±0,13 (8)** |
1,54±0,06 (8) |
|
СДГ |
M±m |
6,07±0,36 (16) |
5,80±0,20 (7) |
7,84±0,32 (5)* |
5,57±0,18 (7) |
|
АлАТ |
M±m |
1,19±0,06 (16) |
1,11±0,07 (8) |
1,30±0,06 (5) |
1,12±0,09 (8) |
|
АсАТ |
M±m |
7,98±0,28 (16) |
8,79±0,46 (8) |
9,02±0,41 (5) |
9,34±0,32 (8)** |
|
ГДГ |
M±m |
0,51±0,06 (14) |
0,44±0,03 (7) |
0,65±0,04 (7) |
1,61±0,17 (6)** |
|
АМФ-Д |
M±m |
741±30 (14) |
749±22 (7) |
689±22 (7) |
842±22 (6)* |
У крыс с аллоксановым диабетом (2-ая группа) скорость образования лактата в миокарде уменьшалась почти в 2 раза при использовании всех трех субстратов (таблица 5). Снижение дихотомического распада углеводов в миокарде при аллоксановом диабете является следствием дефицита инсулиновых эффектов [6]. Уменьшение скорости гликогенолиза в данном случае, по-видимому, обусловлено низкой активностью фосфофруктокиназы, которая в таких условиях становилась лимитирующим фактором. У животных 3-ей экспериментальной группы скорость образования лактата в миокарде при использовании в качестве исходных субстратов глюкозы и гликогена, а также активность окислительных ферментов в миокарде увеличивалась. У крыс 4-ей экспериментальной группы интенсивность дихотомического распада углеводов приближалась к нормальным значениям, т.е. была существенно повышена в сравнении с подопытными животными 2-ой группы (аллоксановый диабет), различия статистически достоверны.
Таблица 5
Скорость накопления лактата (нмоль в минуту на мг белка), в миокарде крыс при аллоксановом диабете и инсулиновой гипогликемии
|
Субстрат |
|
Группа |
|||
|
1-я |
2-я |
3-я |
4-я |
||
|
Глюкоза |
M±m |
11,4±1,2 (21) |
6,3±1,2 (8)* |
19,9±1,2 (8)* |
12,4±1,7 (8) |
|
Г-6-Ф |
M±m |
32,1±1,3 (21) |
12,4±2,1 (8)* |
36,5±1,7 (8) |
29,6±2,7 (8) |
|
Гликоген |
M±m |
20,1±2,1 (21) |
12,7±2,6 (8)* |
26,7±0,9 (8)* |
23,4±3,6 (8) |
Повышение скорости образования лактата при использовании глюкозы и гликогена в качестве субстратов фактически отражает активацию гексокиназы и фосфорилазы. Это способствует увеличению образования фосфогексоз. Однако такие изменения ферментативной активности не обязательно приводят к реальной стимуляции катаболизма углеводов и повышению использования углеводов в энергообмене in vivo при гипогликемии. Скорость гликолиза при использовании Г-6-Ф в качестве субстрата не изменялась. Т.е. в сердце активность ключевого фермента дихотомического распада углеводов - фосфофруктокиназы, по-видимому, не увеличивалась. В то же время процессы синтеза гликогена стимулируются инсулином [8]. Поэтому можно предполагать, что под действием высокой дозы гормона, вызывающей в конечном итоге (через 3-4 часа после инъекции) глубокую гипогликемию, повышенное образование фосфогексоз в миокарде способствует увеличению синтеза гликогена, в результате чего концентрация полисахарида значительно нарастает (животные 3-ей и 4-ой группы). В начальный период после введения инсулина, возможно, имело место увеличение «кругооборота» гексоз в системе «Г-6-Ф - гликоген» с некоторым преобладанием синтеза гликогена. В конечном итоге это препятствует его эффективному использованию для покрытия энергозатрат миокарда. В условиях уже развившейся гипогликемии потенциально высокая скорость усвоения глюкозы крови мало влияет на энергообеспечение миокарда. При этом в крови уменьшается не только концентрация глюкозы, но и содержание кетоновых тел [5], СЖК и лактата, т.е. снижается обеспечение миокарда многими потенциально возможными исходными субстратами для окисления. В таких условиях, по-видимому, увеличивается распад эндогенных ТАГ сердца и ТАГ крови, в особенности в том случае, когда инсулиновая гипогликемия развивается на фоне сахарного диабета. Однако инсулин угнетает окисление высших жирных кислот в миокарде [6]. Таким образом, окисление жирных кислот, образующихся при гидролизе ТАГ, может быть затруднено. Поэтому при инсулиновой гипогликемии увеличение активности окислительных ферментов, которое, возможно, носит компенсаторный характер, оказывается малоэффективным.
У животных с гипогликемией, вызванной на фоне сахарного диабета, увеличение активности АсАТ, АМФ-Д и ГДГ в миокарде может свидетельствовать о повышении процессов трансаминирования и дезаминирования с последующим включением аминокислот в энергообмен. Не исключено, что аминокислоты становятся значимым источником энергии для миокарда. В сочетании с нарушениями азотистого обмена в печени это может приводить к снижению субстратного обеспечение протеиносинтеза в сердце.
Заключение
При инсулиновой гипогликемии в миокарде не обнаружено таких изменений активности окислительных ферментов, которые могли бы приводить к нарушению энергообмена. Снижение энергообеспечения может быть вызвано дефицитом исходных субстратов для окисления и нарушением катаболизма углеводов. Инсулиновая гипогликемия, вызываемая на фоне сахарного диабета, обусловливает заметное увеличение использования аминокислот для покрытия энергозатрат миокарда. Таким образом, нарушения функции миокарда при гипогликемии [9] могут быть обусловлены как дефицитом субстратов энергообмена и нарушением их утилизации, так и ограничением протеиносинтеза.
Рецензенты:
Михайлов В.П., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой патологической физиологии ГБОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия Минздрава России», г. Ярославль;
Муравьев А.В., д.б.н., профессор кафедры медико-биологических основ спорта, ФГБОУ ВПО «Ярославский государственный педагогический университет им. К.Д. Ушинского», г. Ярославль.