Материалы и методы
В работе были использованы 22 самца крыс линии Вистар массой 200-220 г. Исследования проводили в соответствии с международными правилами «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals». Индивидуальную эмоциональную реактивность крыс определяли в тесте "открытое поле" с расчетом индекса двигательной активности (ИА) как отношения суммы пересеченных периферических и центральных секторов к сумме латентных периодов первого движения и выхода в центр. К прогностически устойчивым к стрессу (активным) особям были отнесены 9 животных со значением ИА более 1.5, к предрасположенным (пассивным) - 10 крыс с ИА менее 0.8 [1]. Была также определена группа из 3 амбивалентных крыс со средними значениями коэффициента - от 0.8 до 1.5.
Забор ЦСЖ осуществляли под анестезией хлоралгидратом из большой цистерны головного мозга двукратно с интервалом в 10 дней по известной методике [2]. При этом вторую пункцию проводили после иммобилизационного ЭС (фиксация за четыре конечности в течение 2.5 часов). ЦСЖ доводили физиологическим раствором до объема 400 мкл, а затем проводили выделение вкДНК фенольным методом. Концентрацию вкДНК определяли на флуориметре EnspireTM 2300 (Perkin Elmer) по флуоресценции Picogreen (Invitrogen, США) при длинах волн возбуждения 480 нм и эмиссии 520 нм. Статистический анализ полученных данных осуществляли с помощью программного пакета Statistica 6.0 . Для проверки гипотезы о различии независимых выборок использовали U-тест Манна-Уитни. Результаты представляли в виде медианы значений и межквартильного интервала Ме [25%; 75%]. Для исследования связи признаков использовали непараметрический анализ по Спирмену.
Результаты исследования
В таблице 1 представлены медианы концентраций вкДНК в ликворе предрасположенных, устойчивых к стрессу и амбивалентных животных. Они составили 27, 68 и 20 нг/мл соответственно (табл. 1). В группе устойчивых к стрессу животных наблюдалась тенденция к большему уровню вкДНК по сравнению с остальными двумя. Объем ликвора, который в норме удавалось отобрать, был примерно одинаков для всех групп животных.
Таблица 1
Уровень вкДНК и объем ликвора в большой цистерне мозга у крыс с различной эмоциональной резистентностью в норме и ЭС
|
|
Группы животных |
|||||
|
предрасположенные к стрессу n=10 |
устойчивые к стрессу n=9 |
амбивалентные n=3 |
||||
|
контроль |
стресс |
контроль |
стресс |
контроль |
стресс |
|
|
концентрация вкДНК, нг/мл |
27 [23;56] |
32 [24;73] |
68 [25;80] |
46 [28;60] |
20 [20;22] |
23 [23;26] |
|
объем ЦСЖ, мкл |
86 [81;90] |
86 [81;87] |
88 [76;89] |
84 [78;139] |
93 [93;107] |
91 [74;100] |
|
общее количество ДНК в пробе, нг |
2.1 [2.0;6.3] |
2.7 [2.0;6.4] |
6.1 [2.2;6.5] |
6.2 [2.1;6.8] |
2.1 [1.9;2.1] |
2.1 [1.9;2.3] |
Медианы концентраций вкДНК в ликворе предрасположенных, устойчивых к стрессу и амбивалентных животных после иммобилизационного стресса составили 32, 46 и 23 нг/мл соответственно. Как следует из оценки соответствующих верхних границ межквартильных интервалов, после ЭС концентрация вкДНК в ЦСЖ устойчивых к стрессу животных демонстрировала тенденцию к снижению, а у предрасположенных - наоборот, к повышению.
Рис. 1. Концентрация вкДНК в ЦСЖ у крыс до и после ЭС. Черные столбики- активные животные, серые-пассивные
Рис. 2. Объемы аликвот отобранного ликвора у крыс до и после ЭС. Черные столбики- активные животные, серые-пассивные
После стрессорной нагрузки изменения содержания вкДНК были выявлены у 5 из 9 устойчивых к эмоциональному стрессу животных (рис.1). При этом у 4 крыс уменьшение концентрации вкДНК сопровождалось увеличением объема аликвот отбираемого ликвора. У 5-ой активной особи концентрация вкДНК увеличивалась, а объем ЦСЖ снижался. Среди пассивных животных изменения концентрации вкДНК в ЦСЖ после стрессорной нагрузки были выявлены у 6 животных из 10: у четырех из них увеличение концентрации вкДНК сопровождалось снижением объема ликвора, у двух наблюдалось уменьшение концентрации вкДНК, причем в одном случае объем ликвора после стресса возрастал, а в другом - не изменялся. У амбивалентных животных концентрация и объем отбираемого ликвора до и после ЭС оставалась на том же уровне.
Как в группе устойчивых, так и в группе предрасположенных к ЭС животных, нами была выявлена обратная корреляционная зависимость между изменением объема аликвот ликвора, которые удавалось отобрать до и после ЭС, и изменением концентрации вкДНК в данных аликвотах. Коэффициент корреляции Спирмена (R) составил -0.73 и -0.78 при р<0.05 для предрасположенных (n=10) и устойчивых (n=9) животных соответственно.
Интересно отметить, что все изучаемые животные как в норме, так и после ЭС статистически достоверно (р<0.005, U-тест) разделялись на 2 группы - с повышенным 6.5 [6.2;7] (n=9) и низким 2.1 [2;2.1] (n=13) общим количеством вкДНК (в нг) в пробе. При этом в контрольной группе среди устойчивых к ЭС крыс всего 33% животных имели низкое количество вкДНК в ЦСЖ, в то время, как доля таких животных среди предрасположенных к стрессу составила 70% (рис.1). Низкое количество вкДНК в ЦСЖ было обнаружено и у всех изучаемых амбивалентных животных. После ЭС эта закономерность сохранялась. В группе устойчивых к стрессу крыс общее количество вкДНК в пробе оставалось постоянным до и после ЭС у 8-ми из 9 животных. Среди предрасположенных к стрессу животных постоянство общего количества вкДНК было отмечено у 8 из 10 животных (рис. 1).
Обсуждение результатов
По общему количеству ДНК в образцах все животные статистически достоверно разделялись на 2 группы - с низким и высоким общим количеством вкДНК в ЦСЖ. Причем, в группе устойчивых к стрессу животных преобладали особи с высоким общим количеством вкДНК в ликворе, а среди предрасположенных и амбивалентных к стрессу - наоборот, с низким.
Выявленная нами тенденция к большему уровню вкДНК у группы устойчивых к стрессу животных согласуется с результатами, полученными ранее при исследовании вкДНК в плазме крови крыс с разной индивидуальной эмоциональной устойчивостью [7]. Концентрация вкДНК в плазме крови устойчивых к стрессу животных также превышала таковую у предрасположенных, но в крови это различие было выражено более явно. Поскольку определение концентрации вкДНК в плазме крови крыс проводилось тем же методом, что и в данном исследовании, интересным представлялось провести сравнительную оценку концентраций вкДНК в крови и ЦСЖ в норме у крыс с различной эмоциональной резистентностью. Значения концентраций вкДНК в плазме крови предрасположенных и устойчивых к стрессу животных составили соответственно 60[52;69] (n=17) и 155[134;174] (n=11) нг/мл. Очевидно, что концентрация вкДНК в ЦСЖ крыс была ниже, чем в плазме крови в 2.1 и 3.0 раза для предрасположенных и устойчивых к стрессу животных соответственно. Рассчитанные соотношения имеют один порядок с ранее полученными результатами на людях - концентрация вкДНК в ЦСЖ пациентов с болезнью Паркинсона оказалась в 3.3 ниже, чем в плазме крови.
Источниками вкДНК, циркулирующей в биологических жидкостях, являются некротические и апоптотические клетки, а также процессы активной секреции из жизнеспособных клеток [10]. Известно, что ЭС индуцирует неспецифический окислительный стресс (ОС) в организме, сопровождающийся массовой гибелью клеток, что в свою очередь приводит к изменению концентрации и свойств вкДНК, циркулирующей в крови. В мозге стрессовые воздействия индуцируют эксайтотоксичность и нейровоспаления, также приводящие к клеточной гибели, а, следовательно, к выбросу вкДНК в экстраклеточное пространство. Кроме того, ранее в работе Строуна и Анкера была показана возможность проникновения вкДНК в мозг через гематоэнцефалический барьер [5]. Поэтому, в данной работе нам представлялось интересным проверить, происходят ли изменения концентрации вкДНК, циркулирующей в ЦСЖ при ЭС.
Мы не выявили статистически достоверных изменений концентрации вкДНК в ЦСЖ после ЭС, индуцированного 2.5ч иммобилизацией за 4 конечности, в группах предрасположенных, устойчивых и амбивалентных к стрессу животных. Также не удалось установить связь между резистентностью животных к ЭС и изменением концентрации вкДНК в ЦСЖ после стресса. Полученный нами результат может быть объяснен несколькими причинами. Возможно, значительное изменение уровня вкДНК в ЦСЖ происходит лишь в случае развития хронических патологий мозга - болезней Паркинсона, Альцгеймера, злокачественных новообразований. Острые расстройства, такие как ЭС, могут не вызывать существенных изменений, поскольку вкДНК, выделяемая при гибели клеток мозга, может поглощаться соседними клетками и расщепляться внеклеточными эндонуклеазами, не успевая попасть в желудочки. Другими возможными причинами отсутствия достоверных различий могут служить малый объем выборок животных, сравнительно небольшая длительность стрессорного воздействия, а также наложение процессов расщепления, появления свежей вкДНК в ЦСЖ и изменения скорости локального мозгового кровотока после стресса.
Содержание вкДНК в ЦСЖ отдельных крыс в пределах групп предрасположенных и устойчивых к стрессу животных изменялось не одинаково. Данный факт может быть связан с тем, что тестирование поведения в открытом поле позволяет лишь прогностически оценить степень устойчивости к стрессорным нагрузкам, которая наиболее ярко проявляется в популяционной совокупности животных. При этом индивидуальная устойчивость отдельной особи в группе устойчивых или предрасположенных может варьировать в широких пределах.
Полученный нами результат свидетельствует о том, что вкДНК, циркулирующая в биологических жидкостях, в перспективе может быть использована в качестве уникального показателя предрасположенности животного к стрессорным воздействиям.
Выявленная нами обратная корреляционная зависимость между изменениями объема аликвот ликвора и концентрации в них вкДНК при ЭС как у предрасположенных, так и у устойчивых к стрессу животных, при сохранении общего количества вкДНК в пробе постоянным может свидетельствовать существовании неизвестного механизма регуляции уровня вкДНК в желудочках мозга. Он может являться одной из форм адаптации организма и, в частности, мозга к стрессовым воздействиям. В настоящее время неясно, несет ли выявленный нами феномен постоянства общего количества вкДНК в аликвотах ликвора какую-либо физиологическую функцию. Для ответа на этот вопрос необходимы дальнейшие исследования.
Заключение
Полученные нами данные свидетельствуют о том, что среди устойчивых крыс преобладают особи с высоким уровнем вкДНК в ликворе, среди предрасположенных и амбивалентных - с низким. При ЭС у устойчивых и предрасположенных к стрессу крыс происходят изменения объема отбираемых аликвот ликвора и уровня вкДНК в них и, возможно, активируются механизмы, препятствующие изменению общего количества ДНК в ликворе. Выявленные нами закономерности могут являться частью механизма адаптации мозга к стрессорным воздействиям и требуют дальнейшего более тщательного исследования [3]. Данные, полученные в настоящей работе, свидетельствуют о перспективности исследования вкДНК в ЦСЖ животных с различной эмоциональной резистентностью и позволяют надеяться, что вкДНК, циркулирующая в биологических жидкостях, в перспективе может быть использована в качестве уникального показателя предрасположенности животных к стрессорным воздействиям.
Рецензенты:
Вагин Ю.Е., д.м.н., профессор кафедры нормальной физиологии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова, г.Москва.
Джебраилова Т.Д., д.б.н., профессор кафедры нормальной физиологии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова, г.Москва.