Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,791

THE ANALYSIS OF SENSITIVITY AND DIAGNOSTIC EFFICACY OF THE TEST SYSTEM OF INDICATION AND IDENTIFICATION OF BACTERIA B. BRONCHISEPTICA

Vasileva Yu.B. 1 Mastilenko A.V. 1 Vasilev D.A. 1 Badaev R.R. 2 Merchina S.V. 1 Shvidenko I.G. 3 Skorik A.S. 1
1 FSBEI HPE "Ulyanovsk state agricultural Academy named after P.A. Stolypin"
2 Research financial law University
3 FSBEI HPE "Saratov agrarian University named after N.I. Vavilov"
В работе приводятся результаты изучения аналитической чувствительности и диагностической эффективности тeст-cистемы индикации и идентификации бактерий B. bronchiseptica (ТСИИ ББР). ТСИИ ББР включает бактериологический, иммунологический, молекулярно-генетический и фаговый компоненты, обеспечивает раннюю и точную диагностику бордетеллёза. Аналитическая чувствительность бактериологического и иммунологического компонентов тест-системы составляет не менее 104 м.к. в мл, молекулярно-генетического и фагового - не менее 103 м.к. в мл. Бактериологический, иммунологический, фаговый компоненты следует использовать на ранних сроках заболевания (не позднее третьей недели), до начала терапии антибактериальными препаратами. В более поздние сроки и на фоне антибиотикотерапии высеваемость резко снижается. ПЦР эффективнее в более поздние сроки заболевания и на фоне лечения антибиотиками, но максимальная эффективность метода приходится на 1-3 неделю от начала заболевания. Прием антибиотиков может привести к ложноотрицательному результату анализа. Срок проведения лабораторной диагностики с помощью тeст-cистемы индикации и идентификации бактерий B. bronchiseptica составляет от 1 до 4 суток.
The paper presents results of a study of analytical sensitivity and diagnostic efficacy of the test system of indication and identification of bacteria B.bronchiseptica (TSII BBR). TSII BBR includes bacteriological, immunological, molecular genetics and phage components, provides early and accurate diagnosis of Bordetella. The analytical sensitivity of bacteriological and immunological components of the test system is not less than 104 microbial cells in ml, molecular genetics and phage - not less than 103 microbial cells in ml. Bacteriological, immunological, phage components should be used in the early stages of the disease (not later than the third week), before treatment with antibacterial drugs. At a later date and on the background of antibiotic therapy inoculation significantly reduced. PCR is more effective in the later stages of the disease and on treatment with antibiotics, but the maximum efficiency of the method on 1 - 3 week from the onset of the disease. Antibiotics may lead to false-negative result of the analysis. The term laboratory tests using the test system of indication and identification of bacteria B.bronchiseptica is from 1 to 4 days.
Bordetella
diagnosis
detection of the pathogen
infection of cats and dogs
pets allowed
Несмотря на то что микроорганизм B. bronchiseptica был открыт в начале XX века, многие вопросы, связанные с патогенностью, методами индикации и идентификации возбудителя, остаются недостаточно изученными. Опасность усугубляется чрезвычайной распространённостью возбудителя в природе. Фактически все теплокровные животные являются носителями или восприимчивы к инфицированию бронхисептикозными бактериями. В литературе описано более 100 случаев инфицирования людей. Анамнестические данные показывают, что во многих случаях наблюдался предварительный контакт зараженных людей с больными собаками, кроликами, свиньями, кошками [1-23].

Возможность передачи возбудителя от сельскохозяйственных и домашних животных людям и перемещения очага из природных в антропургические зоны имеет крайне важное эпизоотологическое и эпидемиологическое значение [1-23].

С 90-х годов прошлого века во многих странах мира ежегодно регистрируют массовые вспышки бордетеллёза животных. Установить точный уровень распространения инфекции достаточно сложно, так как чаще массово болеют и являются носителями уличные животные [1-23].

Ареал распространения бактерий данного вида, по-видимому, повсеместен. Однако строгий учет вспышек инфекции среди животных ведется только в странах Западной Европы и США [1-23].

В России отсутствуют официальные статистические данные по распространению бордетеллёза животных и бронхосептикоза людей. Неизвестность истинной заболеваемости обусловлена недооценкой патогенности возбудителя и отсутствием эффективных мер его детекции [1-23].

Согласно традиционной схеме для учета штаммов B. bronchiseptica используют бактериологический метод с иммунологическим подтверждением в реакции агглютинации. Данные методы имеют ряд существенных недостатков. Бактериологическая детекция занимает неделю, при этом её эффективность редко превышает 20-40%. Долгосрочность исследований и низкая высеваемость возбудителя связаны со слабой устойчивостью бордетелл во внешней среде, их медленным ростом, несвоевременным и неполным обследованием животных и людей с затяжным кашлем, нарушением правил забора и транспортировки материала, несовершенной рецептурой питательных сред, в частности неудовлетворительным выбором селективных компонентов [1-23].

Серологическая диагностика не является высокоспецифичной, даёт нарастание титров антител в поздние сроки заболевания, неинформативна для молодняка первого года жизни [6; 7].

Следовательно, бактериологические методы недостаточно чувствительны, а серологические - слабо специфичны. В клинической практике неэффективность и длительность диагностики инфекции отражается в том, что большинство заболевших не может своевременно пройти курс антибактериальной терапии, которая эффективна только в начальный период [5; 9].

Новые возможности детекции бордетелл появились в последние годы в связи с внедрением современных методов: полимеразной цепной реакции (ПЦР), иммуноферментного анализа, фагодиагнстики [1-23].

Многие исследователи отмечают перспективность использования молекулярно-генетических методов, которые позволяют провести раннюю и более точную детекцию возудител по сравнению с фенотипическими методами [23]. Однако в настоящее время широкое применение ПЦР для идентификации B. bronchiseptica ограничено в связи с отсутствием стандартизированных праймерных систем, позволяющих проводить точную внутривидовую диагностику. В связи с этим перспективным направлением является разработка методических приемов постановки ПЦР в моно- и мультиплексном формате, а также ПЦР с регистрацией в режиме «реального времени» для идентификации бактерий В. bronchiseptica [4; 7; 9; 12; 13; 15; 22].

На сегодняшний день выделено и охарактеризовано более 10 фагов бактерий В. bronchiseptica. Однако их практическое применение не описано, несмотря на то что фагодиагностика позволяет быстро и точно провести индикацию и идентификацию искомых бактерий при минимальных затратах [6-8; 16; 18; 19].

Для медицинской практики важна внутриродовая дифференцировка B. bronchiseptica, B. рertussis и B. parapertussis [22].

 Таким образом, на сегодняшний день крайне актуальными остаются совершенствование классических и разработка современных методов детекции бактерий вида B. bronchiseptica, обладающих высокой чувствительностью, специфичностью и экономической эффективностью [1-23].

В связи с этим целью наших исследований явилось изучение аналитической чувствительности и диагностической эффективности тест-системы индикации и идентификации B. bronchiseptica (ТСИИ ББР), включающей бактериологический, иммунологический, молекулярно-генетический и фаговый компоненты.

Материалы и методы. Работа проводилась на базе научно-исследовательского центра микробиологии и биотехнологии кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ.

Компоненты тест-системы мы апробировали на искусственно контаминированных мазках из носоглотки животных.

Мазки со слизистой носоглотки брали сухими стерильными назофарингеальными тампонами на пластиковом аппликаторе. Материал проверяли на отсутствие бактерий B. bronchiseptica бактериологическим методом.

Для искусственной контаминации проб использовали суточные культуры B. bronchiseptica в концентрации от 109 до 102 м.к./мл. Исходная концентрация культуры была определена по стандарту мутности. Последовательные разведения высевали на селективный агар для учета бактериологического компонента. Далее проводили реакцию агглютинации на стекле (иммунологический компонент). Для проверки молекулярно-генетического компонента ставили ПЦР в мультиплексном формате с детекцией в электрофорезе и ПЦР в режиме «реального времени». Фаговый компонент тестировали в РНФ и СПОТ-тесте.

Результаты исследований чувствительности компонентов тест-системы приведены в таблице 1.

Таблица 1

Чувствительность компонентов ТСИИ ББР при исследовании искусственно контаминированных культурой B. bronchiseptica проб

Количество м.к./мл

Результаты детекции B. bronchiseptica компонентами ТСИИ ББР

бактериологический (селективный агар)

иммунологический

(РА на стекле)

молекулярно-генетический (ПЦР)

фаговый (РНФ)

1

109

сплошной рост

+

+

+

2

108

сплошной рост

+

+

+

3

107

сплошной рост

+

+

+

4

106

тесно расположенные колонии

+

+

+

5

105

тесно расположенные колонии

+

+

+

6

104

изолированные колонии

+

+

+

7

103

отсутствие видимого роста

-

+

+

8

102

отсутствие видимого роста

-

+

-

Оценка аналитической чувствительности компонентов тест-системы показала высокий уровень чувствительности молекулярно-генетического и фагового компонентов с выявлением бактерий в концентрациях 103 м.к./мл и выше и допустимый диагностический уровень бактериологического и иммунологического компонентов - 104 м.к./мл и выше.

Диагностическую эффективность компонентов ТСИИ ББР оценивали в зависимости от сроков заболевания, наличия или отсутствия антибиотикотерапии (таблица 2).

Таблица 2

Эффективность компонентов ТСИИ ББР

Компоненты ТСИИ ББР

1-2 недели от начала заболевания

3-4 недели от начала заболевания

Более 4 недель

без лечения АБ

на фоне АБ

без лечения АБ

на фоне АБ

без лечения или с ним

Б

+

+

+

-

-

И

+

+

+

-

-

М-Г

+

+

+

+

+

Ф

+

+

+

-

-

Примечание. Компоненты тест-системы: Б - бактериологический, И - иммунологический, М-Г - молекулярно-генетический, Ф - фаговый.

Результаты исследований показали, что бактериологический, иммунологический, фаговый компоненты следует использовать на ранних сроках заболевания (не позднее третьей недели), до начала терапии антибактериальными препаратами. В более поздние сроки и на фоне антибиотикотерапии высеваемость резко снижается.

Обследование методом ПЦР нередко оказывается эффективнее бактериологического метода в более поздние сроки заболевания и на фоне лечения антибиотиками, однако максимальная эффективность метода приходится на ранние сроки (1-3 недели от начала заболевания), прием антибиотиков может привести к ложноотрицательному результату анализа.

Рецензенты:

Золотухин С.Н., д.б.н., профессор кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина», г. Ульяновск.

Нафеев А.А., д.м.н., заведующий отделением особо опасных инфекций, природно-очаговых инфекций и профилактики туберкулеза ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Ульяновской области», г. Ульяновск.