Возможность передачи возбудителя от сельскохозяйственных и домашних животных людям и перемещения очага из природных в антропургические зоны имеет крайне важное эпизоотологическое и эпидемиологическое значение [1-23].
С 90-х годов прошлого века во многих странах мира ежегодно регистрируют массовые вспышки бордетеллёза животных. Установить точный уровень распространения инфекции достаточно сложно, так как чаще массово болеют и являются носителями уличные животные [1-23].
Ареал распространения бактерий данного вида, по-видимому, повсеместен. Однако строгий учет вспышек инфекции среди животных ведется только в странах Западной Европы и США [1-23].
В России отсутствуют официальные статистические данные по распространению бордетеллёза животных и бронхосептикоза людей. Неизвестность истинной заболеваемости обусловлена недооценкой патогенности возбудителя и отсутствием эффективных мер его детекции [1-23].
Согласно традиционной схеме для учета штаммов B. bronchiseptica используют бактериологический метод с иммунологическим подтверждением в реакции агглютинации. Данные методы имеют ряд существенных недостатков. Бактериологическая детекция занимает неделю, при этом её эффективность редко превышает 20-40%. Долгосрочность исследований и низкая высеваемость возбудителя связаны со слабой устойчивостью бордетелл во внешней среде, их медленным ростом, несвоевременным и неполным обследованием животных и людей с затяжным кашлем, нарушением правил забора и транспортировки материала, несовершенной рецептурой питательных сред, в частности неудовлетворительным выбором селективных компонентов [1-23].
Серологическая диагностика не является высокоспецифичной, даёт нарастание титров антител в поздние сроки заболевания, неинформативна для молодняка первого года жизни [6; 7].
Следовательно, бактериологические методы недостаточно чувствительны, а серологические - слабо специфичны. В клинической практике неэффективность и длительность диагностики инфекции отражается в том, что большинство заболевших не может своевременно пройти курс антибактериальной терапии, которая эффективна только в начальный период [5; 9].
Новые возможности детекции бордетелл появились в последние годы в связи с внедрением современных методов: полимеразной цепной реакции (ПЦР), иммуноферментного анализа, фагодиагнстики [1-23].
Многие исследователи отмечают перспективность использования молекулярно-генетических методов, которые позволяют провести раннюю и более точную детекцию возудител по сравнению с фенотипическими методами [23]. Однако в настоящее время широкое применение ПЦР для идентификации B. bronchiseptica ограничено в связи с отсутствием стандартизированных праймерных систем, позволяющих проводить точную внутривидовую диагностику. В связи с этим перспективным направлением является разработка методических приемов постановки ПЦР в моно- и мультиплексном формате, а также ПЦР с регистрацией в режиме «реального времени» для идентификации бактерий В. bronchiseptica [4; 7; 9; 12; 13; 15; 22].
На сегодняшний день выделено и охарактеризовано более 10 фагов бактерий В. bronchiseptica. Однако их практическое применение не описано, несмотря на то что фагодиагностика позволяет быстро и точно провести индикацию и идентификацию искомых бактерий при минимальных затратах [6-8; 16; 18; 19].
Для медицинской практики важна внутриродовая дифференцировка B. bronchiseptica, B. рertussis и B. parapertussis [22].
Таким образом, на сегодняшний день крайне актуальными остаются совершенствование классических и разработка современных методов детекции бактерий вида B. bronchiseptica, обладающих высокой чувствительностью, специфичностью и экономической эффективностью [1-23].
В связи с этим целью наших исследований явилось изучение аналитической чувствительности и диагностической эффективности тест-системы индикации и идентификации B. bronchiseptica (ТСИИ ББР), включающей бактериологический, иммунологический, молекулярно-генетический и фаговый компоненты.
Материалы и методы. Работа проводилась на базе научно-исследовательского центра микробиологии и биотехнологии кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ.
Компоненты тест-системы мы апробировали на искусственно контаминированных мазках из носоглотки животных.
Мазки со слизистой носоглотки брали сухими стерильными назофарингеальными тампонами на пластиковом аппликаторе. Материал проверяли на отсутствие бактерий B. bronchiseptica бактериологическим методом.
Для искусственной контаминации проб использовали суточные культуры B. bronchiseptica в концентрации от 109 до 102 м.к./мл. Исходная концентрация культуры была определена по стандарту мутности. Последовательные разведения высевали на селективный агар для учета бактериологического компонента. Далее проводили реакцию агглютинации на стекле (иммунологический компонент). Для проверки молекулярно-генетического компонента ставили ПЦР в мультиплексном формате с детекцией в электрофорезе и ПЦР в режиме «реального времени». Фаговый компонент тестировали в РНФ и СПОТ-тесте.
Результаты исследований чувствительности компонентов тест-системы приведены в таблице 1.
Таблица 1
Чувствительность компонентов ТСИИ ББР при исследовании искусственно контаминированных культурой B. bronchiseptica проб
|
№ |
Количество м.к./мл |
Результаты детекции B. bronchiseptica компонентами ТСИИ ББР |
|||
|
бактериологический (селективный агар) |
иммунологический (РА на стекле) |
молекулярно-генетический (ПЦР) |
фаговый (РНФ) |
||
|
1 |
109 |
сплошной рост |
+ |
+ |
+ |
|
2 |
108 |
сплошной рост |
+ |
+ |
+ |
|
3 |
107 |
сплошной рост |
+ |
+ |
+ |
|
4 |
106 |
тесно расположенные колонии |
+ |
+ |
+ |
|
5 |
105 |
тесно расположенные колонии |
+ |
+ |
+ |
|
6 |
104 |
изолированные колонии |
+ |
+ |
+ |
|
7 |
103 |
отсутствие видимого роста |
- |
+ |
+ |
|
8 |
102 |
отсутствие видимого роста |
- |
+ |
- |
Оценка аналитической чувствительности компонентов тест-системы показала высокий уровень чувствительности молекулярно-генетического и фагового компонентов с выявлением бактерий в концентрациях 103 м.к./мл и выше и допустимый диагностический уровень бактериологического и иммунологического компонентов - 104 м.к./мл и выше.
Диагностическую эффективность компонентов ТСИИ ББР оценивали в зависимости от сроков заболевания, наличия или отсутствия антибиотикотерапии (таблица 2).
Таблица 2
Эффективность компонентов ТСИИ ББР
|
Компоненты ТСИИ ББР |
1-2 недели от начала заболевания |
3-4 недели от начала заболевания |
Более 4 недель |
||
|
без лечения АБ |
на фоне АБ |
без лечения АБ |
на фоне АБ |
без лечения или с ним |
|
|
Б |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
|
И |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
|
М-Г |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
Ф |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
Примечание. Компоненты тест-системы: Б - бактериологический, И - иммунологический, М-Г - молекулярно-генетический, Ф - фаговый.
Результаты исследований показали, что бактериологический, иммунологический, фаговый компоненты следует использовать на ранних сроках заболевания (не позднее третьей недели), до начала терапии антибактериальными препаратами. В более поздние сроки и на фоне антибиотикотерапии высеваемость резко снижается.
Обследование методом ПЦР нередко оказывается эффективнее бактериологического метода в более поздние сроки заболевания и на фоне лечения антибиотиками, однако максимальная эффективность метода приходится на ранние сроки (1-3 недели от начала заболевания), прием антибиотиков может привести к ложноотрицательному результату анализа.
Рецензенты:
Золотухин С.Н., д.б.н., профессор кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина», г. Ульяновск.
Нафеев А.А., д.м.н., заведующий отделением особо опасных инфекций, природно-очаговых инфекций и профилактики туберкулеза ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Ульяновской области», г. Ульяновск.