Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

NEUTROPENIA AT PATIENTS WITH CHRONIC HEPATITIS C, WHO ARE RECEIVING COMBINED ANTI-VIRUS THERAPY. THE SYMPTOMS, AND THE FEATURES OF PATHOGENESIS

Dontsov D.V. 1 Ambalov Yu.M. 1 Mamedova N.I. 1
1 Rostov state medical university
Purpose: to study some features of neutropenia pathogenesis at patients with chronic hepatitis C, who receives combined anti-virus therapy. Materials and methods: in this research we had 228 patients, who were receiving combined anti-virus therapy of chronic hepatitis C. We executed special researches: automatic hematological analysis, electronic microscopy of blood cells, studying of neutrophils migratory activity and skins рН, definition of level auto-antibodies сANCA and рANCA, concentration of human G-CSF, and the frequency of gene R to G-CSF mutations. Results: it has been established, that at patients with a chronic hepatitis C during combined anti-virus therapies occur changes of endocellular structure neutrophils, their migratory activity, skins рН and G-CSF concentration. High frequency of a mutation "G/С" G911С (rs201991840) is determined too. Summary: these results we plan to use at the future for creation of method forecasting of development neutropenia at patients with chronic hepatitis C, who receives combined anti-virus therapy.
chronic hepatitis C
anti-virus therapy
neutropenia
Хронический гепатит С (ХГС) является одним из наиболее распространенных инфекционных заболеваний человека [7]. Применение современной комбинированной противовирусной терапии (КПТ) ХГС позволяет добиться у многих пациентов полной элиминации возбудителя [4-6], однако актуальной проблемой при этом остается развитие нежелательных явлений (НЯ), среди которых особое место занимают гематологические осложнения [1; 2]. Одним из наиболее серьезных гематологических синдромов у больных ХГС является КПТ-ассоциированная нейтропения, развитие которой значительно увеличивает риск возникновения состояний, угрожающих жизни пациентов [3]. К сожалению, многие стороны патогенеза данного НЯ этиотропного лечения хронической HCV-инфекции остаются практически не изученными.

Цель исследования - детально изучить патогенез и клинические проявления КПТ-ассоциированной нейтропении у больных ХГС.

Материал и методы исследования

В исследование было включено 228 больных ХГС, имевших показания к КПТ. Генотип HCV 1a встречался у 3,5%, 1b - 51,3%, 3а - 28,9% и 2а - 16,2 % человек. Уровень вирусной нагрузки (ВН) у 30,3% пациентов составил <3×105 МЕ/мл, у 46,1% - 3×105-6×105 МЕ/мл и у 23,7% >6×105 МЕ/мл. Всем испытуемым согласно международным стандартам была назначена КПТ: 51,3% пациентов получали рибавирин в сочетании с пегилированными α-интерферонами (пег-ИНФ-α), а 48,7% - в сочетании с «короткими» ИНФ-α. В ходе работы наблюдаемым лицам был выполнен ряд высокоспециализированных исследований. Определение содержания лейкоцитов в крови (WBC) и абсолютного числа нейтрофилов (АЧН) проводилось методом автоматического гематологического анализа непосредственно перед началом КПТ, через 4, 8, 12, 24 и 48 (лица, инфицированные 1-м генотипом HCV) недель КПТ. Внутриклеточная ультраструктура нейтрофилов изучалась с помощью трансмиссионной электронной микроскопии на электронном микроскопе «Tecnai G2 Spirit BioTWIN» (Philips, Нидерланды). Исследование миграционной активности нейтрофилов проводилось путем создания на ладонной поверхности кожи правого предплечья (КПП) зоны асептического воспаления методом кожного «окна» по Rebuck (1955). рН-метрия на ладонной поверхности КПП осуществлялась по методу С.В. Фе­доровича (1976). Наличие антител к компонентам цитоплазматических гранул нейтрофилов человека - anti-Neutrophil Cytoplasmic Antibodies (ANCA), определяли в сыворотке крови методом постановки реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ), с использованием диагностических наборов Granulocyte Mosaic (IMMCO Diagnostics, США-Канада). С помощью флуоресцентного микроскопа Olympus СХ41 (Япония) образовавшиеся иммунные комплексы выявляли в виде диффузного цитоплазматического (сANCA) или перинуклеарного (рANCA) свечения. Уровень человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF) исследовали методом твердофазного ИФА с использованием тест-систем «G-CSF-ИФА-БЕСТ» (ЗАО «Вектор-бест», РФ). Перечисленные выше методы проводились дважды: перед началом и сразу после завершения или вынужденного прекращения КПТ. Помимо этого, у испытуемых лиц методом «ПЦР в реальном времени» была изучена частота точковых мутаций Т931С (rs201890478), Т1259С (rs201403199) и G911С (rs201991840) гена рецептора (R) к G-CSF (SNP-Скрин-Синтол, РФ).

Результаты исследования

В результате проведенного лечения устойчивый вирусологический ответ (УВО) в общей сложности был достигнут у 155 (68,0%) пациентов, из них 64 (41,3%) были инфицированы 1-м; 34 (21,9%) - 2-м и 57 (36,8%) - 3-м генотипами HCV. Среди получавших пег-ИФН-α (n=117) частота УВО составила 54,7% (n=64); получавших «короткие» ИФН-α (n=111) - 82,0% (n=91). У больных, инфицированных 1-м генотипом HCV (n=125), УВО отмечался в 51,2% (n=64) случаев; у инфицированных 2-м (n=37) и 3-м (n=66) генотипами HCV - в 91,9% (n=34) и 86,4% (n=57) случаев соответственно. Проведение КПТ прекращалось при отсутствии через 12 недель лечения раннего вирусологического ответа (РВО) и/или развитии у пациентов тяжелых НЯ противовирусной терапии. В итоге из 228 больных ХГС полностью закончили курс КПТ 163 человека (71,5%). У 8 пациентов (3,5%) терапия была отменена уже через 8 недель лечения исключительно по причине развития тяжелых гематологических осложнений КПТ. У 57 больных ХГС (25,0%) было зафиксировано отсутствие РВО, причем у 9 из них (3,9%) параллельно наблюдалось развитие к 12-й неделе КПТ тяжелых осложнений со стороны системы крови, также требовавших отмены терапии.

В ходе работы мы использовали общепринятую классификацию [1], согласно которой выделяют легкую (WBC 2,0-2,5×109/л; АЧН 1,0-1,3×109/л), умеренную (WBC 1,5-1,99×109/л; АЧН 0,75-0,99×109/л), тяжелую (WBC 1,0-1,49×109/л; АЧН 0,5-0,74×109/л) и крайне тяжелую (WBC <1,0×109/л; АЧН <0,5×109/л) степени лейко- и нейтропении. Развитие КПТ-ассоциированной нейтропении у наблюдавшихся нами лиц было отмечено в общей сложности у 110 (48,3%) больных ХГС, при этом у 29 (12,7%) их них нейтропения была легкой; у 40 (17,5%) - умеренной, у 33 (14,5%) - тяжелой и у 8 (3,5%) - крайне тяжелой степени.

Единственным клиническим проявлением легкой и умеренной нейтропении явилась субфебрильная лихорадка, длившаяся в течение нескольких дней после приема противовирусных препаратов. При снижении уровня АЧН от 0,75×109/л до 0,5×109/л у 23 (69,7%) пациентов была обнаружена гнойничковая сыпь на коже, у 19 (57,6%) - отмечались воспалительные заболевания полости рта (афтозный стоматит, гингивит), а у 16 (48,5%) и 13 (39,4%) - ангинозный и катаральный синдромы. У лиц с крайне тяжелой степенью нейтропении, помимо перечисленных выше объективных признаков, наблюдались также очаговая пневмония - 5 (62,5%) человек и инфекции мочевыводящих путей - 4 (50,0%) человека.

Развитие легкой степени нейтропении впервые было зафиксировано через 4 недели КПТ у 14,5% больных ХГС. Начиная с 8-й и вплоть до 48-й недели терапии удельный вес пациентов с уровнем АЧН 1,3-1,0×109/л находился в пределах 28,5-33,3%. Через 24 недели после завершения/прекращения КПТ АЧН достигло исходного уровня у всех участников исследования. Умеренная нейтропения развилась через 8 недель КПТ у 2,2% больных ХГС. Максимальный удельный вес пациентов с АЧН 0,99-0,75×109/л отмечался через 12 недель лечения, составил в итоге 16,4%. Все лица с тяжелой и крайне тяжелой формами нейтропении были выявлены в период с 8-й по 12-ю недели этиотропного лечения ХГС.

Через 8 недель КПТ у 12 больных ХГС, имевших АЧН 0,75-0,5×109/л, согласно существующим рекомендациям доза пег-ИФН-α была снижена до 135 мкг/нед. Надо отметить, что к 12-й неделе лечения РВО у данных пациентов получен не был, вследствие чего антивирусную терапию у них пришлось прекратить. В остальных же случаях при снижении АЧН до 0,75-0,5×109/л коррекция КПТ-ассоциированной нейтропении не проводилась, поскольку у 5 пациентов параллельно было зафиксировано снижение уровня Hb <8,0 г/дл, а у 16 - отсутствие РВО, что в обеих ситуациях явилось прямым показанием к отмене терапии. Снижение АЧН <0,5×109/л явилось прямым показанием к отмене приема противовирусных препаратов у 3 (1,3%) на 8-й и у 5 (2,3%) больных ХГС на 12-й неделе КПТ.

Все участники исследования в зависимости от минимальной величины АЧН (АЧНmin,), зафиксированной у каждого пациента за весь период КПТ, были разделены на три группы. В 1-ю группу (n=118) вошли лица, у которых АЧНmin на протяжении КПТ оставался в пределах допустимой нормы, т.е. >1,3×109/л. 2-ю группу (n=69) составили больные с легкой и умеренной степенью КПТ-ассоциированной нейтропении (АЧНmin 0,75-1,3×109/л). И, наконец, в 3-ю группу (n=41) вошли пациенты с тяжелой и крайне тяжелой степенью КПТ-ассоциированной нейтропении (АЧНmin <0,75×109/л). В 1-й группе больных ХГС показатель АЧНmin составил в среднем 2,02±0,05×109/л, во 2-й - 1,05±0,03×109/л и в 3-й - 0,66±0,02×109/л.

При сравнении исходных клинико-лабораторных характеристик наблюдавшихся пациентов было установлено, что среди больных ХГС с тяжелой и крайне тяжелой КПТ-ассоциированной нейтропенией достоверно чаще встречались лица старше 39 лет, имевшие гепатомегалию, инфицированные 1b генотипом HCV, с ВН >6×105 МЕ/мл и ИФ F2-3, а также получавшие в дальнейшем препараты пег-ИФН-α. Пациенты же 1-й и 2-й группы не имели между собой каких-либо статистически значимых отличий (р>0,05).

Для оценки влияния развившейся нейтропении на эффективность КПТ нами был выполнен сравнительный статистический анализ частоты УВО в 1-й, 2-й и 3-й группе. Полученные результаты показали, что удельный вес пациентов с положительным УВО оказался максимальным во 2-й группе больных ХГС, составив в среднем 94,2±2,8%. У лиц же со значением АЧНmin <0,75×109/л частота УВО оказалась минимальной и составила всего лишь 2,44±2,39%.

Перед началом антивирусной терапии средние показатели WBC и АЧН в 1-й группе пациентов были значительно выше чем во 2-й и 3-й (во всех случаях р<0,001). Минимальные же значения данных показателей отмечались в 3-й группе больных ХГС (во всех случаях р<0,001). В ходе проведения КПТ у всех пациентов наблюдалось снижение средних значений WBC и АЧН с максимальной степенью выраженности в период с 12-й по 24-ю неделю КПТ. Несмотря на общую направленность, средний уровень всех вышеуказанных показателей продолжал оставаться самым низким в 3-й группе больных ХГС.

Выявленные у наблюдавшихся нами лиц дефекты поверхностной мембраны нейтрофилов характеризовались такими изменениями, как наличие участков ее локального истончения, разрыхления, фрагментации и разрывов, а также микро- и макровезикулообразованием. Среди структурных признаков дезорганизации стромы нейтрофилов у пациентов всех сравниваемых групп были обнаружены: формирование множественных полостей и эндовезикул, токсическая зернистость цитоплазмы, отек/набухание митохондрий и, наконец, гиперсегментация ядра. На старте специфической антивирусной терапии удельный вес пациентов с участками локальных разрывов и фрагментации, а также микро- и макровезикулообразованием плазмолеммы нейтрофилов оказался наиболее низким в 1-й, а наиболее высоким - в 3-й группе больных ХГС. Аналогичное соотношение отмечалось и при сравнении частоты встречаемости таких структурных дефектов, как формирование множественных полостей и эндовезикул, токсическая зернистость цитоплазмы, отек/набухание митохондрий. После завершения/вынужденного прекращения КПТ у пациентов 1-й группы наблюдался достоверный рост удельного веса лиц с гиперсегментацией ядра и уменьшение - с токсической зернистостью цитоплазмы. У больных ХГС 2-й группы увеличение удельного веса лиц с гиперсегментацией ядра было гораздо более выраженным (р<0,001), также отмечалось достоверное снижение частоты встречаемости множественных полостей и эндовезикул цитоплазмы, токсической зернистости, и отека/набухания митохондрий. Прочие патологические изменения имели тенденцию к снижению своего удельного веса. И, наконец, в 3-й группе пациентов лица с гиперсегментацией ядра, наоборот, отсутствовали (р<0,001), прочие же нарушения морфологии нейтрофилов не претерпевали существенных изменений.

Качественный состав мазков-отпечатков в кожном «окне» КПП у наших пациентов был представлен нейтрофилами, макрофагами и лимфоцитами. Перед началом КПТ статистически значимых отличий в частоте встречаемости нейтрофилов, равно как макрофагов и лимфоцитов, между пациентами сравниваемых групп выявлено не было. Однако после завершения/вынужденного прекращения терапии мы обнаружили, что удельный вес нейтрофилов в мазках-отпечатках КПП у больных ХГС с легкой и умеренной степенью КПТ-ассоциированнной нейтропении повысился в среднем на 16,0%, оказавшись при этом достоверно выше, чем у пациентов 1-й и 3-й группы. В 1-й же группе лиц данный показатель увеличился лишь на 8,2%, а в 3-й, наоборот, снизился на 14,2%.

На старте терапии средний показатель рН КПП в 1-й группе пациентов составил 5,23±0,04, во 2-й - 5,19±0,06 и в 3-й - 4,98±0,05. При сравнении полученных результатов было установлено, что уровень кислотности КПП у больных ХГС 3-й группы оказался в среднем значительно выше, чем у лиц 1-й (р<0,001) и 2-й группы (р<0,01). После завершения/вынужденного прекращения КПТ средний показатель рН кожи достоверно увеличился в 1-й (р<0,05), но особо значимо - в 3-й (р<0,001) группе больных ХГС. У пациентов же 2-й группы уровень кислотности КПП не претерпевал каких-либо существенных изменений (р>0,05). В итоге по окончании исследования оказалось, что средние показатели рН кожи у лиц 1-й и 3-й группы уже не имели между собой существенных отличий (р>0,05), в то время как у больных ХГС 2-й группы данный показатель стал достоверно ниже, чем у пациентов с тяжелой и крайне тяжелой степенью КПТ-ассоциированной нейтропении (р<0,01).

При постановке РНИФ перед началом КПТ во всех сравниваемых группах преобладали лица с отсутствием сANCA, составив в 1-й группе 85,0±5,6%, во 2-й - 100% и в 3-й - 65,6±8,4%. Также у больных ХГС 1-й и 3-й группы были выявлены пациенты с диагностическими титрами сANCA 1:10 и 1:32, удельный вес которых при этом не имел между данными группами статистически значимых отличий (во всех случаях р>0,05). Лица с титром 1:100 были обнаружены лишь в 3-й группе пациентов - 21,9±7,3%. После завершения/вынужденного прекращения этиотропного лечения хронической HCV-инфекции ни в одной из сравниваемых нами групп каких-либо существенных изменений частоты встречаемости выявленных ранее диагностических титров сANCA обнаружено не было (во всех случаях р>0,05). Практически идентичная ситуация наблюдалась у больных ХГС и с частотой обнаружения антител перинуклеарного флуоресцентного окрашивания - рANCA.

Средний показатель концентрации G-CSF перед началом КПТ в 1-й группе наблюдавшихся нами лиц оказался равен 28,91±2,34 пг/мл, а во 2-й - 29,63±2,41 пг/мл, т.е. статистически значимых отличий между данными группами не наблюдалось (р>0,05). В 3-й группе больных ХГС средний уровень G-CSF составил 41,26±3,82 пг/мл, достоверно превысив таковой у пациентов первых двух групп. После окончания КПТ содержание эндогенного G-CSF в 1-й и во 2-й группе снизилось в среднем в 1,3 раза (в обоих случаях р<0,05). У больных ХГС 3-й группы средний показатель концентрации G-CSF не претерпевал при этом существенных изменений и в итоге составил 49,67±4,16 пг/мл (р>0,05), что по-прежнему оставалось значительно выше, чем у пациентов 1-й и 2-й группы.

Проведенные молекулярно-генетические исследования показали, что ни в одной из наблюдаемых нами групп не было выявлено ни одного пациента, имевшего мутантные гомозиготные «С/С» варианты мутаций Т931С (rs201890478), Т1259С (rs201403199) и G911С (rs201991840). Однако при изучении гетерозиготных вариантов было установлено, что удельный вес больных ХГС с «Т/С» вариантом однонуклеотидной мутации Т931С (rs201890478) в 1-й группе в среднем составил 10,8±5,1%, во 2-й - 6,1±4,2% и в 3-й - 0%. Относительное число лиц, имевших гетерозиготный «Т/С» вариант мутации Т1259С (rs201403199), у пациентов 1-й группы оказался равен 8,1±4,5%, а у пациентов 2-й и 3-й - 9,1±5,0% и 0% соответственно. Что же касается «G/С» варианта точковой мутации G911С (rs201991840), то здесь, в 1-й группе больных ХГС данный вариант был обнаружен у 16,2±6,1%, во 2-й - у 9,1±5,0% и наконец в 3-й - у 61,3±8,7%, лиц, что оказалось значительно выше чем в первых двух группах (в обоих случаях, р<0,001).

Выводы

  1. Степень выраженности КПТ-ассоциированной нейтропении у больных ХГС определена целым рядом факторов, среди которых можно выделить как непосредственное действие HCV, так и индивидуальные характеристики самого пациента.
  2. Перед началом противовирусного лечения у больных ХГС имеются разнообразные ультраструктурные дефекты мембраны и стромы нейтрофилов, которые, вполне возможно, могут играть важную роль в развитии КПТ-ассоциированной нейтропении.
  3. У лиц с легкой и умеренной степенью КПТ-ассоциированной нейтропении снижение количества нейтрофилов в крови, прежде всего, связано с усилением их миграционной активности в периферические ткани.
  4. Уровень рН кожи является объективным показателем, отражающим как миграционную активность нейтрофилов, так и степень КПТ-ассоциированной нейтропении в целом.
  5. Изменение уровня антител к компонентам цитоплазматических гранул нейтрофилов - ANCA не играет существенной роли в патогенезе КПТ-ассоциированной нейтропении.
  6. Развитие легкой и умеренной степени КПТ-ассоциированной нейтропении сопровождается выраженным снижением концентрации эндогенного G-CSF. В то время как при тяжелой и крайне тяжелой степени КПТ-ассоциированной нейтропении существенных изменений его уровня не происходит.
  7. Развитие у больных ХГС тяжелой и крайне тяжелой степени КПТ-ассоциированной нейтропении ассоциируется с высокой частотой «G/С» варианта точковой мутации G911С (rs201991840) в структуре гена, ответственного за синтез R к эндогенному G-CSF.

В заключение хочется отметить, что данное исследование проводилось нами не только с научной, но и с практической целью, поскольку полученные результаты мы планируем использовать в дальнейшем для разработки способа прогноза развития нейтропении у больных хроническим гепатитом С, получающих специфическую антивирусную терапию.

Рецензенты:

Николаев Б.Ф., д.м.н., МЛПУЗ «ГБ № 1 им. Н.А. Семашко», г.Ростов-на-Дону.

Яговкин Э.А., д.м.н., Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии Министерства здравоохранения РФ, г.Ростов-на-Дону.