Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Общепризнано, что одним из основных этиологических факторов развития воспалительных заболеваний пародонта (ВЗП) у человека являются анаэробные и микроаэрофильные микроорганизмы [9]. Поэтому ключевым компонентом в лечении ВЗП традиционно остаются антимикробные химиотерапевтические препараты. Однако, как показала медицинская практика, регулярное и длительное использование антибиотиков сопровождается синхронным появлением устойчивых к ним штаммов микроорганизмов, а также развитием многочисленных побочных эффектов [5, 8]. Кроме того, воспаление тканей пародонта может быть вызвано не бактериальной, а вирусной или грибковой инфекцией, перед которой антибиотики в большинстве случаев оказываются бессильны.

В настоящее время на мировом фармацевтическом рынке широко представлены препараты элементарного, кластерного и коллоидного наносеребра, которые уже сейчас нашли применение в различных областях медицины, в том числе и в стоматологии [1]. Особенностью данных препаратов является то, что механизм их действия кардинально отличается от механизма действия антибиотиков и связан с комплексообразующим и каталитическим взаимодействием серебра с отдельными мембранными структурами, белками, ферментами [3, 6, 7]. Кроме того, как было установлено, многие серебросодержащие препараты обладают противовирусной, фунгицидной и иммунномодулирующей активностями, что может оказаться особенно важным при лечении ВЗП смешанной этиологии. Однако в доступной научной литературе отсутствует описание каких-либо исследований, направленных на определение четких критериев дифференцированного выбора серебросодержащих препаратов для лечения заболеваний пародонта в зависимости от характера и тяжести патологии, а также их применения на этапе поддерживающей терапии.

Данная работа посвящена сравнению антибактериальной активности ряда серебросодержащих препаратов и антисептика хлоргексидина биглюконата, который достаточно широко применяется в схеме лечения ВЗП.

Материалы и методы

Антибактериальную активность препаратов определяли методом диффузии в агар в модификации Есипова С.Е. с соавторами [2]. В качестве бактериальной модели использовали суточные культуры референтных штаммов Staphylococcus aureus 209 P и Escherichia coli 113-13.

В 500 мл расплавленной и охлажденной до 60-65 ^оС питательной агаровой среды ГРМ вносили 1,5 мл взвеси суточной культуры (1 млрд/мл по стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича) и разливали в чашки Петри по 20 мл. После застывания чашки подсушивали в течение 30 мин и специальным стерильным приспособлением на расстоянии 28-30 мм от центра по окружности чашки делали шесть лунок диаметром 8 мм. Контрольный раствор (стандарт) - 0,02%-ный раствор хлоргексидина биглюконата - вносили автоматической пипеткой по 0,1 мл в три лунки чашки (через одну). В другие три лунки вносили по 0,1 мл растворов испытуемого серебросодержащего препарата в трех концентрациях: 100%-ный, 50%-ный и 25%-ный (Рис. 1).

Рис. 1. Зоны подавления роста колоний тест-штамма Staphylococcus aureus 209 P растворами препарата «Colloidal Silver» («Nature's Sunshine Products», США), взятыми в концентрациях: 100% (1), 50% (2) и 25% (3), и стандартом - 0,02%-ным раствором хлоргексидина биглюконата (ОАО «Фармация, г. Пенза, РФ).

В качестве растворителя использовали стерильную дистиллированную воду с рН 6,8-7,0. Испытывали: препарат коллоидного серебра «Colloidal Silver» (компания «Nature's Sunshine Products», США); препарат кластерного серебра «Витаргол» (ООО НПЦ Вектор-Вита, Новосибирск, РФ); препарат кластерного серебра в геле полиэтиленоксида «Аргогель» (ООО НПЦ Вектор-Вита, Новосибирск, РФ); серебросодержащее средство «Аргакол» (ООО «Сирена», Санкт-Петербург, РФ).

Для получения статистически значимого результата на каждый испытуемый препарат брали по три чашки. После нанесения анализируемых растворов чашки выдерживали 1 час при комнатной температуре для диффузии образцов в агар и затем помещали в термостат на 18-20 ч. Через указанное время измеряли зоны задержки роста тест-штамма. О наличии линейной зависимости между диаметром зон подавления роста и логарифмом дозы препарата [по уравнению (1)] судили по значению коэффициента корреляции r_i (2):

d_n = a_i + b_i · lg P_n (1)

r_i² = [∑lgP_n · d_n - (∑lgP_n · ∑d_n)/n]² / [∑(lgP_n)² - (∑lgP_n)²/n] · [∑d_n² - (∑d_n)²/n] (2)

где d_n - среднее значение диаметра зон подавления роста при соответствующем разведении (d₁, d₂,..., d_n); P_n - доза материала в анализируемой пробе, выраженная в единицах разведения (P₁, P₂,..., P_n); a_i и b_i, - коэффициенты в уравнении, характеризующие индивидуальную зависимость d_n от lgP_n для i-того анализируемого образца.

Считали, что если коэффициент корреляции имеет величину не менее 0,99, то зависимость выполняется и концентрация вещества в анализируемом образце будет определена по уравнению (3) с относительной ошибкой не более 5% [8]. Значения коэффициента b_i устанавливали по уравнению (4):

lgc_n = lgc_st + (d_n - d_st(nj))/b_i; antilgc_n = c_n (3)

b_i = [∑lgP_n · d_n - (∑lgP_n · ∑d_n)/n]/[∑(lgP_n)² - (∑lgP_n)²/n] (4)

где c₁,c₂,..., c_n - экспериментально определенные концентрации препарата в n (трех) разведениях анализируемого образца относительно концентрации контрольного стандартного раствора (c_st); d_st(nj) - среднее значение диаметра зон подавления роста контрольным стандартным раствором для n_j (девяти) измерений.

Антибактериальную активность анализируемых образцов рассчитывали по уравнению (5) и выражали в единицах опорной концентрации стандарта, для которого делали допущение, что он ведет себя на чашке как анализируемый образец:

А_i = [(k₁·c₁ + k₂·c₂ + k₃·c₃)/3] ·100% (5)

где А_i - биологическая активность i-того образца относительно стандартного раствора, выраженная в процентах; k₁, k₂, k₃ - кратность разведения образца препарата.

Все вычисления проводили с помощью программы Microsoft Excel (пакет ПО Microsoft Office 2010).

Результаты и обсуждение

К преимуществам антимикробных средств местного назначения (мази, гели, растворы для аппликаций, и т. д.) можно отнести их способность создавать высокую локальную концентрацию биоцидных веществ в области воспаления без значительного повышения их уровня в системной циркуляции, в результате чего снижается риск развития таких нежелательных эффектов, как дисбактериоз кишечника, гепатотоксикоз и др. В данном исследовании в качестве препарата сравнения (стандарта) был выбран антисептический препарат для наружного применения хлоргексидин биглюконат, который широко используется в стоматологии благодаря его высокой активности в отношении многих пародонтопатогенных бактерий, грибов (в том числе, в отношении Candida albicans), простейших (род Trichomonas) и некоторых вирусов [4]. В соответствии с инструкцией по применению этого антисептика для полоскания полости рта и обработки зубодесневых карманов, свищей, полостей абсцессов, рекомендуется использовать 0,05% раствор. Однако, как видно из рисунка 2, диаметр зоны подавления роста тест-штамма S. aureus 209 P 0,05%-ым раствором оказался слишком велик. Чтобы избежать перекрытия зон при постановке эксперимента, в качестве стандарта был взят раствор хлоргексидина биглюконата в концентрации 0,02%.

Рис. 1. Зоны подавления роста колоний тест-штамма Staphylococcus aureus 209 P растворами препарата «Colloidal Silver» («Nature's Sunshine Products», США), взятыми в концентрациях: 100% (1), 50% (2) и 25% (3), и стандартом - 0,02%-ным раствором хлоргексидина биглюконата (ОАО «Фармация, г. Пенза, РФ).

Серебросодержащие препараты «Аргогель», «Аргакол» и «Витаргол» и «Colloidal Silver NSP», по информации производителей и распространителей этих БАДов, активны в отношении широкого спектра анаэробных и аэробных бактерий и проявляют вирулицидную и фунгицидную активности. Однако в их составе содержатся разные количества коллоидных частиц серебра, стабилизированных различными белками и полимерами медицинского назначения. Поэтому представляло интерес сравнение антибактериальной активности этих серебросодержащих препаратов в сопоставимых условиях.

В таблице 1 представлены результаты определения биоцидного действия препаратов на колонии тест-штамма S. aureus 209 P, рассчитанные относительно 0,02%-го раствора хлоргексидина биглюконата.

Таблица 1

Значения антибактериальной активности (А, %) серебросодержащих препаратов в отношении культуры S. aureus 209 P, рассчитанные относительно стандарта (0,02% хлоргексидина биглюконата)

Из данных, приведенных в таблице 1, видно, что препараты серебра по своей активности в отношении культуры золотистого стафилококка отличаются как между собой, так и в сравнении с 0,02%-ым раствором хлоргексидина биглюконата. Наиболее активными оказались отечественные препараты «Аргогель», «Аргакол» и «Витаргол». Статистически значимых различий в значениях их антибактериальной активности установлено не было (р ≥ 0,05). Однако они были в 2-2,5 раза более активны, чем импортный препарат «Colloidal Silver» (р ≤ 0,05). Антисептик хлоргексидина биглюконат в виде 0,02 %-го раствора значительно превосходил по своей антимикробной активности все протестированные препараты серебра (р ≤ 0,05).

В таблице 2 приведены данные тестирования антимикробной активности серебросодержащих препаратов на модели тест-штамма E. coli 113-13. Снижение дозы стандарта и анализируемых образцов с 0,1 мл до 0,07 мл не отразилось на выполнении линейной зависимости между логарифмом дозы препарата и диаметром зон подавления, что свидетельствовало в пользу того, что выбранные дозы попадают в диапазон концентраций, оптимальных для определения биологической активности [8]. Наибольшую активность в отношении E. coli 113-13 проявил препарат «Витаргол». Он был в 2,1 раз активнее, чем препараты «Аргакол» и «Colloidal Silver» (р ≤ 0,05), и в 1,3 раза активнее, чем «Аргогель» (р ≤ 0,05). По сравнению с 0,02%-м раствором хлоргексидина биглюконата активность «Витаргола» была ниже на 39,3% (р ≤ 0,05), «Аргогеля» - на 54,8% (р ≤ 0,05), а «Аргакола» и «Colloidal Silver» - на 70,6-71,1% (р ≤ 0,05).

Таблица 2

Значения антибактериальной активности (А, %) серебросодержащих препаратов в отношении культуры E. coli 113-13, рассчитанные относительно стандарта (0,02% хлоргексидина биглюконата)

Таким образом, проведенное микробиологическое исследование выявило наличие штаммовых различий в антимикробной активности серебросодержащих препаратов. Лучшие результаты продемонстрировали препараты кластерного серебра «Витаргол» и «Аргогель» (ООО НПЦ Вектор-Вита, Новосибирск, РФ), однако все протестированные препараты существенно уступали в активности 0,02%-му раствору хлоргексидина биглюконата. Благодаря тому, что данные препараты, помимо биоцидной активности, обладают еще и противовоспалительным и ранозаживляющим эффектами, они могут быть рекомендованы к применению в качестве средств профилактики и вспомогательных местных препаратов на этапе поддерживающей терапии ВЗП с целью скорейшего купирования воспалительных процессов в тканях пародонта.

Примененный в данной работе математический аппарат для обработки данных метода диффузии в агар, предложенный С.Е. Есиповым с соавторами (1998), оказался весьма эффективным и позволил существенно сократить объем экспериментального материала для получения статистически значимых результатов сравнения антибактериальной активности препаратов серебра.

Рецензенты:

Скуридин П.И., д.м.н., главный врач ГАУЗ ПО «Городская стоматологическая поликлиника», г. Пенза.

Еремина Н.В., д.м.н., заведующая кафедрой стоматологии общей практики и стоматологии терапевтической ГБОУ ДПО «Пензенский институт усовершенствования врачей» Минздрава России, г. Пенза.