Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,791

DETERMINATION OF GAMMA-HYDROXYBUTYRIC ACID AND ITS PRECURSORS IN SOLUTIONS BY SPECTROPHOTOMETRY

Popova A.P. 1 Goncharov D.S. 1 Chernysheva O.V. 1 Luksha E.A. 1
1 Omsk State Medical Academy Russian Ministry of Health
Разработка недорогих, чувствительных экспресс-методов определения психотропных веществ в биологических жидкостях человека является актуальной задачей современного химико-токсикологического и судебно-химического анализа. На настоящий момент наблюдается рост числа отравлений гамма-гидроксимасляной кислотой (натрия оксибутиратом) и её прекурсорами. Разработана методика определения гамма-гидроксимасляной кислоты (натрия оксибутирата) и её прекурсоров в растворах спектрофотометрическим методом в видимом диапазоне на основе гидроксамовой реакции. Подобраны оптимальные условия спектрофотометрирования: рН, концентрации реактивов, температура и время реакции, обнаружен максимум поглощения на длине волны 521±2 нм. Для водных растворов в диапазоне концентраций 0,1 – 0,6 мг/мл обнаружена линейная зависимость оптической плотности от содержания натрия оксибутирата. Показано, что данная методика применима для анализа модельных растворов и может быть использована для целей химико-токсикологического и судебно-химического анализа.
Developing inexpensive, sensitive express methods for determining psychotropic substances in human body fluids is an important task of modern toxicological and forensic chemical analysis. At present, an increasing number of poisoning by gamma-hydroxybutyric acid (sodium salt) and its precursors is found out. The method of determination of gamma-hydroxybutyric acid (sodium salt) and its precursors in solutions by spectrophotometry in the visible range based hydroxamic reaction was presented. Optimal conditions spectrophotometry were found: pH, concentration of reagents, temperature and reaction time, absorption maximum at a wavelength of 521 ± 2 nm. For aqueous solutions in the concentration range 0.1 - 0.6 mg/ml, a linear dependence of optical density from the concentration of gamma-hydroxybutyrate sodium was shown. It is shown that this technique is applicable for the analysis of model solutions and can be used for the purposes of toxicological and forensic chemical analysis.
gamma-hydroxybutyric acid
gamma-hydroxybutyrate sodium
GHB
spectrophotometry
hydroxamic reaction

Введение

Гамма-гидроксимасляная кислота является естественным тормозным медиатором ЦНС, в анестезиологии, психиатрии, неврологии, офтальмологии и других областях медицины широко применяется её натриевая соль (натрия оксибутират). Благодаря уникальному для наркозных средств антигипоксическому эффекту этот препарат незаменим для многих стандартов лечения. Также натрия оксибутират находит применение в спортивной медицине в качестве снотворного, антиоксидантного и рекреационного средства. К сожалению, психотропный и рекреационный эффекты стали причинами немедицинского употребления натрия оксибутирата в качестве наркотического средства и допинг-препарата [1, 2, 3].

В начале XXI века резко возросло число случаев немедицинского употребления натрия оксибутирата и его прекурсоров за рубежом, как одного из «клубных наркотиков» [8, 10], рост немедицинского употребления натрия оксибутирата на территории РФ и, в частности, Омской области отмечается в основном с 2010-го года [4, 5]. Применение гамма-гидроксимасляной кислоты (натрия оксибутирата) и её прекурсоров (бутиролактона) с целью «кайфа» в токсических дозах вызывает угнетение ЦНС, кому и апноэ, что без своевременной квалифицированной помощи может привести к летальному исходу. Неспецифическая картина отравления депримирующими и психотропными средствами, характерная для отравлений натрия оксибутиратом, требует лабораторного подтверждения диагноза. При анализе литературных данных выявлено, что основной метод анализа натрия оксибутирата – газовая хроматография/масс-спектрометрия (ГХ/МС) [1].

Цель нашего исследования – разработка доступного экспресс-метода качественного и количественного определения натрия оксибутирата в биологических жидкостях человека и вещественных доказательствах.

Известны способы обнаружения и определения лекарственных препаратов фотоколориметрическим методом на основе гидроксамовой реакции, в том числе и натрия оксибутирата [9], однако данный метод является качественным. Итогом нашего исследования явилась разработка метода фотометрического количественного определения натрия оксибутирата в растворе для целей химико-токсикологического и судебно-химического анализа. Методика может быть использована в обычных лабораториях, исключает применение дорогостоящего оборудования, высокотоксичных и летучих реактивов.

Материалы и методы эксперимента

Исследуемые образцы с концентрациями 0,1, 0,2, 0,4, 0,5 и 0,6 мг/мл готовили с использованием лекарственного препарата « Натрия оксибат», раствор для внутривенного и внутримышечного введения 200 мг/мл; амп. 5 мл; «Московский эндокринный завод» (Россия), воды очищенной (водные растворы) и мочи (модельные растворы), полученной от здоровых лиц 25-30 лет обоих полов, не принимавших лекарственных препаратов в течение 24 часов.

Реактивы: 50% раствор кислоты серной, 1М раствор гидроксиламина гидрохлорида, 20% раствор натрия гидроксида, кислота хлористоводородная концентрированная, 15% раствор железа (III) хлорида (по ГФ РФ XII издания).

Оборудование: спектрофотометр СФ-2000.

Методика: в чистые сухие пробирки помещали по 1,0 мл исследуемых растворов с концентрациями 0,1, 0,2, 0,4 и 0,6 мг/мл натрия оксибутирата, к каждой пробе добавляли 0,5 мл 50% раствора кислоты серной (рН=1-2), выдерживали 5 мин при 20°С; добавляли 0,5 мл 1М раствора гидроксиламина гидрохлорида, 2,5 мл 20% раствора натрия гидроксида (до рН=12-13) и выдерживали 30 мин при 20°С; добавляли 0,5 мл кислоты хлористоводородной концентрированной (до рН=1-2) и 0,5 мл 15% раствора железа (III) хлорида, тщательно перемешивали в течение 10 мин (развитие фиолетовой окраски); полученные окрашенные растворы спектрофотометрировали в интервале длин волн 400-759 нм в кварцевых кюветах с длиной поглощающего слоя 1 см на спектрофотометре СФ-2000.

Статистическую обработку результатов эксперимента проводили с использованием пакета программ Statistica 6.0 для доверительной вероятности р=0,95.

Результаты эксперимента и их обсуждение

Гидроксамовая проба основана на взаимодействии гидроксиламина гидрохлорида в щелочной среде с определяемым веществом, сопровождается гидроксиламинолизом с образованием гидроксамовой кислоты, которую фиксируют по образованию окрашенного комплекса с раствором железа (III) хлорида. Применение гидроксамовой пробы для определения натрия оксибутирата требует предварительного переведения исследуемого соединения в лактон. Схема реакции приведена на рисунке 1:

Рисунок 1 – Схема гидроксамовой реакции:

1 – гамма-гидроксимасляная кислота, 2 – бутиролактон, 3 – гидроксамовая кислота,

4 – комплекс гидроксамовой кислоты с солями железа (III).

Подбор отпимальных условий гидроксамовой реакции (концентрация реактивов, рН, температура и время различных этапов реакции) выполняли согласно принципам проведения полного факторного эксперимента. Результат оценивали по достижению максимального значения оптической плотности раствора с известной концентрацией.

Регистрировали спектры 20 образцов для каждой концентрации водных растворов и 10 образцов для каждой концентрации модельных растворов. На всех полученных спектрах отмечены характерной формы максимумы поглощения при длине волны 521±2 нм и минимумы при 720±2 нм, что свидетельствует об отсутствии влияния компонентов биологических жидкостей на продукт реакции. Спектры поглощения полученного комплекса в водных и модельных растворах представлены на рисунке 2.

Рисунок 2 – Спектр поглощения комплекса продукта реакции с железа (III) хлоридом в кислой среде в водном растворе (а) и в модельном растворе (б).

Результаты статистической обработки экспериментальных данных представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1.

Статистические параметры результатов спектрофотометрирования водных растворов (n=20, р=0,95).

С (мг/мл)

А, Хср

А, Sr

А, σ

А, доверительный интервал

А, коэффициент вариации, %

0,1

0,1297

0,0307

0,0009

±0,017

23,67

0,2

0,1980

0,0368

0,0014

±0,0136

18,59

0,4

0,2439

0,0256

0,0007

±0,0112

10,50

0,5

0,2985

0,0344

0,0018

±0,015

15,46

0,6

0,3351

0,0459

0,0021

±0,0225

13,70

Таблица 2.

Статистические параметры результатов спектрофотометрирования модельных растворов (n=10, р=0,95).

С (мг/мл)

А, Хср

А, Sr

А, σ

А, доверительный интервал

А, коэффициент вариации, %

0,1

0,1458

0,0193

0,0004

±0,0161

12,97

0,2

0,1835

0,0045

0

±0,0047

2,39

0,4

0,2541

0,0325

0,0011

±0,0271

12,79

0,5

0,3106

0,0367

0,0017

±0,0109

13,46

0,6

0,3414

0,0486

0,0024

±0,0432

14,24

Из представленных данных следует, что компоненты биологической жидкости не оказывают значимого влияния на величину оптической плотности и последующий расчёт количественного содержания натрия оксибутирата для всех исследуемых концентраций.

Для подтверждения линейной зависимости оптической плотности от концентрации натрия оксибутирата строили градуировочный график на 5 уровнях концентраций его водных (рисунок 3) и модельных (рисунок 4) растворов.

Рисунок 3 – График зависимости оптической плотности от концентрации натрия оксибутирата в водном растворе.

Рисунок 4 – График зависимости оптической плотности от концентрации натрия оксибутирата в модельном растворе.

Зависимость оптической плотности от концентрации натрия оксибутирата в водных растворах была аппроксимирована линейным уравнением с помощью метода наименьших квадратов. Полученное уравнение для водных растворов имеет вид:

А = 0,110 + 0,379·С,

где А – оптическая плотность (величина светопоглощения) раствора,

С – концентрация исследуемого раствора.

На всём интервале концентраций наблюдалась линейная зависимость оптической плотности от концентрации раствора, что свидетельствует о выполнении закона Бугера-Ламберта-Бера. Критерием приемлемости линейности явился и коэффициент корреляции (R2), его расчетная величина близка к единице (0,99). Таким образом, в данных интервалах концентраций методика обеспечивает определение натрия оксибутирата с требуемой линейностью.

Используя результаты построения градуировочного графика, рассчитывали молярный показатель поглощения и чувствительность определения натрия оксибутирата, приняв за Аmin=0,01. Результаты расчётов представлены в таблице 3.

Таблица 3.

Характеристики спектрофотометрической методики.

Определяемое вещество

Молярная масса, г/моль

Область линейности графика, мг/мл

Молярный коэффициент поглощения продукта реакции

Определяемый минимум, мкг/мл

Натрия оксибутират

126,09

0,1 – 0,6

491,29

24

Установлено, что разработанная методика достаточно чувствительна для определения натрия оксибутирата в диапазоне фармакокинетических концентраций в моче пострадавшего или умершего (0,1-0,6 мг/мл, в некоторых случаях до 1,6 мг/мл в зависимости от принятой дозы и индивидуальных особенностей организма [6,7]). Для модельных растворов в диапазоне концентраций 0,1 – 0,6 мг/мл при использовании разработанной нами методики также наблюдалась линейная зависимость оптической плотности от концентрации натрия оксибутирата, уравнение имеет вид:

А = 0,100 + 0,392·С,

где А – оптическая плотность (величина светопоглощения) раствора,

С – концентрация исследуемого раствора.

Расчётная величина коэффициента корреляции (R2) также близка к единице (0,98), что позволяет применять разработанную нами методику определения натрия оксибутирата в моче для целей химико-токсикологического и судебно-химического анализа.

Заключение

Разработана методика спектрофотометрического определения натрия оксибутирата в водном растворе в диапазоне концентраций 0,1 – 0,6 мг/мл. Подобраны оптимальные значения рН, концентрации реагентов, температура и время реакций на этапах методики. Данная методика применима для определения натрия оксибутирата в модельных растворах для целей химико-токсикологического и судебно-химического анализа. Возможно применение данной методики для мониторинга эффективности экстракции натрия оксибутирата из биологических объектов для целей дальнейших исследований.

Рецензенты:

Гришин А.В., д.фарм.н., профессор, заведующий кафедрой фармации ГБОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия» Минздрава России, г. Омск.

Огай М.А., д.фарм.н., доцент кафедры фармацевтической технологии с курсом биотехнологии ГБОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия» Минздрава России, г. Омск.