В настоящее время принято считать экзему системным полиэтиологическим заболеванием, которое может быть вызвано многими эндогенными и экзогенными факторами, такими как генетическая предрасположенность, вторичный иммунодефицит, дисфункции нервной и эндокринной системы, инфекционно-аллергические процессы [9].
По современным представлениям, в развитии хронической истинной экземы (ХИЭ) главную роль играют Т-лимфоциты, несущие на своей поверхности специфические рецепторы к антигену и выделяющие ряд про- воспалительных цитокинов: ИЛ-1, ИЛ-2, ФНО-α [3]. Как свидетельствуют результаты ряда исследований [6,8] значимую роль в возникновении, клиническом течении и прогнозе заболевания играют генетические факторы и, прежде всего, цитокины, среди которых основными являются факторы некроза опухолей и их рецепторы [4]. Однако, следует отметить, что подавляющее число генетических исследований ХИЭ проведено за рубежом и характеризуется противоречивостью полученных данных [5,7].
Целью данной работы явилось изучение роли генетического полиморфизма +250 A/G Ltα в формировании хронической истинной экземы.
Исследование проводили на выборке из 552 индивидуумов, из них 230 больных ХИЭ и 322 человек контрольной группы. В неё включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Центрального Черноземья РФ и не имеющие родства между собой. Исследуемую группу мужчин составили 205 человек, из них 84 больных ХИЭ и 121 индивидуум контрольной группы. Группа женщин включала 347 человек, в том числе 146 больных ХИЭ и 201 женщина контрольной группы.
Материалом для исследования послужила венозная кровь в объеме 4-5 мл, взятая из локтевой вены пробанда. Забор венозной крови осуществлялся в пробирки с консервантом, содержащим 0,5М раствор ЭДТА (рН=8.0). Выделение геномной ДНК из периферической крови проведено методом фенольно-хлороформной экстракции.
Анализ локуса +250 A/G Ltα осуществлялся методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК. ПЦР проводилось на амплификаторе IQ 5 (Bio-Rad) в режиме real time с использованием ДНК-полимеразы Thermus aquaticus производства фирмы «Силекс-М» и олигонуклеотидных праймеров и зондов, синтезированных фирмой «Синтол». Генотипирование ДНК-маркера осуществлено методом анализа дискриминации аллелей на основе Taq Man зондов.
Результаты исследования. Результаты генотипирования данных индивидуумов по локусу +250А/G Ltα представлены в таблице 1.
Таблица 1
Распределение генотипов, наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности, индекса фиксации полиморфного маркера гена лимфотоксина α среди больных ХИЭ и в контроле
|
Локусы, показатели |
Контрольная группа (n=322) |
Больные ХИЭ (n=230) |
||
|
+250А/G Ltα |
ΣN |
322 |
213 |
|
|
Nо(Ne) |
-250АА |
178 (184,14) |
102 (104,23) |
|
|
-250АG |
131 (118,73) |
94 (89,54) |
||
|
-250GG |
13 (19,14) |
17 (19,23) |
||
|
χ2(НWE) (р) |
3,44 (>0,05) |
0,53 (>0,05) |
||
|
Но (Нe) |
0,41 (0,37) |
0,44 (0,42) |
||
|
D (t) |
+0,10 (1,18) |
+0,05 (0,54) |
||
Примечание: ΣN - объем выборки; N0 - наблюдаемое распределение фенотипов; NE - ожидаемое распределение фенотипов; χ2(HWE) - показатель соответствия наблюдаемого распределения ожидаемому, исходя из равновесия Харди-Вайнберга; p - достигнутый уровень значимости для χ2(HWE) ; H0 - наблюдаемая гетерозиготность; HE - ожидаемая гетерозиготность; D - индекс фиксации Райта; t - критерий Стьюдента, характеризующий индекс фиксации
Исследование распределения генотипов изучаемого полиморфного маркера показало, что в контрольной выборке и в группе больных хронической истинной экземой эмпирическое распределение генотипов соответствует теоретически ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга (p>0,05). Уровень аллельного разнообразия по изученному локусу равен 0,41- в контроле и 0,44 среди больных ХИЭ.
При сравнительном анализе распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера +250 A/G Ltα в контрольной группе и среди больных ХИЭ установлена более высокая концентрация аллеля +250 G Lt α у больных ХИЭ (30,05%) по сравнению с контролем (24,38%, c2=3,93, р=0,048 OR=1,33 95% CI 1,00-1,77) (табл. 2).
Таблица 2
Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов +250A/G Ltα у больных ХИЭ и в контрольной группе (%)
|
Полиморфизм |
Аллели, генотипы |
Контрольная группа (n=322) |
Больные ХИЭ (n=230) |
ОR (95% СI)
|
χ2, p |
||
|
ni |
% |
ni |
% |
||||
|
+250A/G Ltα |
+250A |
487 |
75,62 |
298 |
69,95 |
0,75 (0,56-0,9) |
χ2 =3,93, р=0,048 |
|
+250G |
157 |
24,38 |
128 |
30,05 |
1,33 (1,00-1,77) |
||
|
+250AA |
178 |
55,28 |
102 |
47,89 |
0,74 (0,52-1,07) |
χ2 =2,52, р=0,11 |
|
|
+250GA |
131 |
40,68 |
94 |
44,13 |
1,15 (0,8-1,66) |
χ2 =0,49, р=0,48 |
|
|
+250GG |
13 |
4,04 |
17 |
7,98 |
2,06 (0,93-4,61) |
χ2 =3,06, р=0,08 |
|
Проведено изучение ассоциации +250A/G Lt α, с формированием хронической истинной экземы в зависимости от пола. Так, распределение аллеля +250G Ltα и генотипа +250GG Ltα у больных ХИЭ составляет 36,25% и 15,00%, соответственно, а у мужчин контрольной группы эти показатели составили 21,49% (c2=9,83, р=0,003, OR=2,08 95% CI 1,30-3,32) и 2,48% (c2=9,20, р=0,003, рcor=0,009,OR=6,94 95% CI 1,74-32,21), соответственно (таблица 3).
Таблица 3
Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов +250A/G Ltα у больных ХИЭ и индивидуумов контрольной группы мужского пола (%)
|
Полиморфизм |
Аллели, генотипы |
Контрольная группа (n=121) |
Больные ХИЭ (n=84) |
ОR (95% СI)
|
χ2, p |
||
|
ni |
% |
ni |
% |
||||
|
+250A/G Ltα |
+250A |
190 |
78,51 |
102 |
63,75 |
0,48 (0,30-0,77) |
χ2 =9,83, р=0,003 |
|
+250G |
52 |
21,49 |
58 |
36,25 |
2,08 (1,3-3,32) |
||
|
+250AA |
72 |
59,50 |
34 |
42,5 |
0,5 (0,27-0,93) |
χ2 =4,93, р=0,03 |
|
|
+250AG |
46 |
38,02 |
34 |
42,5 |
1,21 (0,65-2,23) |
χ2=0,24, р=0,63 |
|
|
+250GG |
3 |
2,48 |
12 |
15,00 |
6,94 (1,74-32,21) |
χ2 =9,20, р=0,003 |
|
Проведенный сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов +250A/G Ltα в исследуемых выборках больных ХИЭ женщин и контрольной группы не выявил достоверных различий (таблица 4).
Таблица 3
Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов +250A/G Ltα у больных ХИЭ и индивидуумов контрольной группы женского пола (%)
|
Полиморфизм |
Аллели, генотипы |
Контрольная группа (n=201) |
Больные ХИЭ (n=146) |
ОR (95% СI)
|
χ2, p |
|||
|
ni |
% |
ni |
% |
|||||
|
+250A/G Ltα |
+250A |
297 |
73,88 |
196 |
73,68 |
0,99 (0,69-1,43) |
χ2=0,01, р=1,01 |
|
|
+250G |
105 |
26,12 |
70 |
26,32 |
1,01 (0,70-1.46) |
|||
|
+250AA |
106 |
52,74 |
68 |
51,13 |
0,94 (0,59-1,49) |
χ2 =0,03, р=0,86 |
||
|
+250GA |
85 |
42,29 |
60 |
45,11 |
1,12 (0,70-1,79) |
χ2 =0,16, р=0,69 |
||
|
+250GG |
10 |
4,97 |
5 |
3,76 |
0,75 (0,23-2,44) |
χ2 =0,06, р=0,80 |
||
Получив значимые данные об ассоциации генетического полиморфизма лимфотоксина α с развитием ХИЭ, на следующем этапе работы мы оценили роль наследственной отягощенности в формировании этих ассоциаций. На момент обследования из 230 пациентов отягощенный семейный анамнез по заболеванию был выявлен у 80 больных (34,78%), в том числе среди 84 лиц мужского пола наследственный анамнез был отягощен у 27 (11,74%), из 146 лиц женского пола у 53 (23,04%). 150 больных ХИЭ (65,22%) не имели наследственной отягощенности, в том числе 57 индивидуумов мужского пола (24,78%) и 93 женского (40,43%).
Установлены особенности ассоциаций генетического полиморфизма +250G Lt α с формированием ХИЭ в зависимости от наследственной отягощенности.
В группе больных ХИЭ, без отягощенного семейного анамнеза, +250A/G Ltα вносит значимый вклад в подверженность к ХИЭ. В этой группе пациентов концентрации генетических вариантов +250G Ltα (32,73%) и +250 GG Ltα (10,80%) достоверно выше, чем в контрольной группе, где эти показатели составили 24,38% (c2=6,48, р=0,01, OR=1,51, 95% CI 1,1-2,08) и 4,04% (c2=6,63, р=0,01, рcor=0,03, OR=2,88, 95% CI 1,25-6,64), соответственно (таблица 4).
Таблица 4
Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов +250A/G Ltα у больных ХИЭ с неотягощенным семейным анамнезом и индивидуумов контрольной группы (%)
|
Полиморфизм |
Аллели, генотипы |
Контрольная группа (n=322) |
Больные ХИЭ (n=230) |
|||
|
Наследственность не отягощена (n=150) |
||||||
|
ni |
% |
ni |
% |
χ2(p), ОR (95% СI) |
||
|
+250А/G Ltα |
+250А |
487 |
75,62 |
187 |
67,27 |
6,48 (0,01) 0,66 (0,48-0,91) |
|
+250G |
157 |
24,38 |
91 |
32,73 |
6,48 (0,01) 1,51 (1,1-2,08) |
|
|
+250АА |
178 |
55,28 |
63 |
45,32 |
3,47 (0,06) 0,67 (0,44-1,02) |
|
|
+250GА |
131 |
40,68 |
61 |
43,88 |
0,29 (0,59) 1,14 (0,74-1,73) |
|
|
+250GG |
13 |
4,04 |
15 |
10,80 |
6,63 (0,01) 2,88 (1,25-6,64) |
|
Среди больных ХИЭ с отягощенным семейным анамнезом, связи с предрасположенностью к ХИЭ с исследуемым генетическим полиморфизмом не обнаружено (таблица 5).
Таблица 5
Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов +250A/G Ltα у больных ХИЭ с отягощенным семейным анамнезом и индивидуумов контрольной группы (%)
|
Полиморфизм |
Аллели, генотипы |
Контрольная группа (n=322) |
Больные ХИЭ (n=230) |
|||
|
Отягощенный семейный анамнез (n=80) |
||||||
|
ni |
% |
ni |
% |
χ2(p), ОR (95% СI) |
||
|
+250А/G Ltα |
+250А |
487 |
75,62 |
111 |
75,00 |
0,03 (0,96) 0,98 (0,63-1,49) |
|
+250G |
157 |
24,38 |
37 |
25,00 |
0,03 (0,96) 1,03 (0,67-1,59) |
|
|
+250АА |
178 |
55,28 |
39 |
52,70 |
0,07 (0,79) 0,92 (0,53-1,54) |
|
|
+250GА |
131 |
40,68 |
33 |
44,59 |
0,24 (0,63) 1,17 (0,68-2,01) |
|
|
+250GG |
13 |
4,04 |
2 |
2,71 |
0,04 (0,84) 0,66 (0,11-3,17) |
|
Выводы. Таким образом, можно заключить, что аллель +250G Lt α играет важную роль в формировании хронической истинной экземы и является фактором риска развития этого заболевания (OR=1,33). У мужчин генетический полиморфизм +250A/G Ltα имеет важное этиопатогенетическое значение при хронической истинной экземе, определяя предрасположенность к формированию данного заболевания (фактор риска - +250GG Ltα (OR=6,94), протективный фактор - +250A Ltα (OR=0,48)).
У лиц женского пола полиморфные варианты факторов некроза опухолей и их рецепторов не ассоциированы с развитием хронической истинной экземы. Эти результаты позволяют предположить, что у женщин подверженность к формированию ХИЭ может быть связана или с другими генетическими маркерами, или может определяться в большей степени факторами окружающей среды (частый контакт с водой и химическими моюще-чистящими средствами и др.).
Подверженность к развитию ХИЭ у индивидуумов без отягощенного семейного анамнеза также связана с генетическим полиморфизмом +250А/G Ltα (факторами риска формирования ХИЭ являются генетические варианты +250G Ltα (OR=1,51) и +250GG Ltα (OR=2,88)).
Согласно данным литературы продукт гена Lt α- лимфотоксин α задействован в процессах апоптоза, участвует в развитии первичного иммунитета и защите организма от вирусов, экспрессируется в лимфоцитах и является посредником воспалительных иммуностимулированных ответов [Mentula P., 2005; Кетлинский С.С. и др., 2008]. Ltα вызывает индукцию экспрессии молекул адгезии на лейкоцитах и эндотелиальных клетках, вследствие чего стимулируется приток лейкоцитов из сосудистого русла в очаг воспаления путем трансэндотелиальной миграции [Mathy N. et al., 2000]. Клеточный инфильтрат в очаге воспаления способствует дальнейшему развитию аллергического воспаления. Полиморфный инфильтрат в коже при экземе - результат действия образовавшихся провоспалительных цитокинов, в том числе Ltα [Frezzolini A. et al., 2002]. Как свидетельствуют результаты других работ [Patuzzo С. et al., 2000], повышенный уровень продукции лимфотоксина α ассоциирован с генетическим вариантом + 250G Ltα, что может обуславливать выраженные клинические проявления при развитии патологического процесса (хронической истинной экземы) в организме, что мы и зарегистрировали в настоящем исследовании.
Итак, полученные данные позволяют заключить, что, во-первых, генетический полиморфизм +250A/G Ltα вовлечен в формирование подверженности к хронической истинной экземы у населения Центрального Черноземья России, во-вторых, выявлены особенности ассоциации исследуемого гена-кандидата с возникновением ХИЭ в зависимости от пола.
Рецензенты:
Новиков О.О., д.фарм.н., профессор, заведующий кафедрой фармацевтической химии и фармакогнозии ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет», г. Белгород.
Жилякова Е.Т., д.фарм.н., профессор, заведующий кафедрой фармацевтической технологии ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет», г. Белгород.