Первостепенное внимание научного сообщества уделяется поиску новых противомикробных средств или их комбинаций, обладающих комплексным профилактическим и терапевтическим потенциалом, позволяющим снизить риск возникновения побочных эффектов и осуществить полноценную терапию [1,7]. Особое значение при этом придается снижению токсичности препаратов и повышению их биодоступности [8,10, 6].
Известно, что практически все антибактериальные препараты обладают эмбриотоксическим действием, соответственно, экспериментальное изучение отдаленных последствий воздействия на организм химических веществ является существенным разделом токсиколого-гигиенической оценки лекарственных препаратов [5]. В комплексе биологических эффектов, относящихся к отдаленным последствиям воздействия химических факторов, важное значение имеет изучение влияния химических соединений в пренатальный период развития организма. В настоящее время накоплены многочисленные данные о возможном влиянии химических веществ на процессы эмбриогенеза [4].
Выявление реальной и потенциальной опасности вредного действия химических веществ на плод в условиях эксперимента на лабораторных животных требует унифицированных методических подходов для выбора тест-объектов, испытуемых доз, продолжительности опыта и количественной оценки результатов. Общепринятое понятие - эмбриотоксичность подразумевает потенциальную возможность какого-либо вещества оказывать отрицательный эффект на потомство во время начального периода беременности, т.е. в период между зачатием и образованием эмбриона [9].
Учитывая широкое, а не редко и бесконтрольное применение антибактериальных препаратов широкого спектра действия в животноводстве и птицеводстве [2], необходимо особое внимание уделять изучению фармако-токсикологических свойств разрабатываемых химиотерапевтических препаратов, в том числе определению эмбриотоксических свойств [3].
Цель исследования. Провести экспериментальное изучение эмбриотоксического действия новой лекарственной формы разработанного препарата «Доксициклин-комплекс» на лабораторных животных.
Материалы и методы исследований
Исследуемый объект - комбинированный антибактериальный препарат, представляющий собой сочетание следующих компонентов: доксициклина гиклат - 100 мг/мл, бромгексина гидрохлорид - 5 мг/мл, а в качестве вспомогательных веществ лактулоза - 100 мг/мл и солюфор (поливинилпирролидон).
Исследования проводились в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985), «Методическими указаниями по гигиенической оценке новых пестицидов» (Киев, 1988), методическими рекомендациями Фармакологического Государственного комитета («Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ», Москва, 2005) и приказа МЗ РФ №267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики». Эксперименты проводили на беспородных белых половозрелых виргинных (неоплодотворенных) самках крыс массой 230-260 г.
Животных содержали в виварии согласно санитарным правилам и на стандартном рационе в соответствии с приказом МЗ СССР № 1045-73 от 06.04.73 г.; правилами лабораторной практики и приказом МЗ СССР № 1179 от 10.10.83 г. Животные находились в виварии при стандартном освещении (12 ч свет/12 ч темнота) при температуре воздуха 20 °С и относительной влажности 70 %. Работу с животными проводили в соответствии с приказом МЗ СССР № 755 от 12.08.77 г. и правилами, принятыми Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей.
Эмбриотоксические свойства доксициклина изучали в дозе 10 мг/кг (терапевтическая доза).
Интактные половозрелые самцы массой 280-350 г., случённые с самками для индукции беременности, после подтверждения наступления беременности из эксперимента были исключены. Перед постановкой эксперимента у каждой самки брались вагинальные смывы. Животное считалось беременным, если в смывах при микроскопических исследованиях обнаруживались сперматозоиды (этот день считают первым днём беременности). Изучение безопасности «Доксициклин-комплекс» в антенатальном периоде проводили на нелинейных виргинных крысах 2-х групп (n=15 в каждой группе) с исходной массой 230-260 г. Животным вводили следующие исследуемые вещества: I группа (контроль) - солюфор (растворитель), содержащий вспомогательные вещества бромгексин и лактулозу - в адекватных объемах (исходя из объемов препарата, вводимого опытной группе животных или 100 мг/кг массы тела);
II группа (опыт) - препарат «Доксициклин-комплекс» в дозировке 10 мг/кг массы тела животного по действующему веществу (Доксициклина гиклат).
Препараты вводили животным при помощи желудочного зонда один раз в сутки в одно и то же время с 1 по 19 дни беременности. На 20 день беременности под эфирным наркозом производили эвтаназию крыс и их вскрытие. На основании результатов вскрытия животных были определены следующие показатели: количество желтых тел, количество мест имплантации, количество живых и мертвых плодов, регистрировали данные о предимплантационной и постимплантационной гибели плодов, измеряли краниокаудальный размер плодов, проводили внешний осмотр плодов и определяли количество плодов с аномалиями развития, изучали состояние костной системы и состояние внутренних органов плодов, в частности, регистрировали количество обследованных плодов с аномалиями развития.
После наружного осмотра и морфометрии плоды каждого помета фиксировали в 96° этаноле и использовали для изучения состояния скелета по методике Доусона. Окрашивание скелета ализарином (методика Доусона, модифицированная в отделе эмбриологии НИИЭМ АМН СССР). Окрашивание окостеневших участков скелета плодов производили погружением плодов в слабый раствор ализарина красного. Затем плоды изучали, учитывали аномалии скелета, количество точек окостенения в различных костных образованиях. Данные, полученные при вскрытии каждого животного, протоколировали.
Результаты исследования и их обсуждение. Оценка состояния генеративной функции крыс под воздействием препарата «Доксициклин-комплекс» не выявила достоверных изменений предимплантационной гибели эмбрионов, которая составила 6 % в опытной и 5 % в контрольной группе, что указывает на однородность групп животных. Вместе с этим отмечаются достоверные изменения при исследовании постимплантационной гибели плодов, которая в опытной группе составила 15,7 %, что значительно выше по сравнению с 7,14 % в контрольной группе животных (табл. 1). Данные изменения свидетельствуют о высокой эмбриотоксичности препарата.
Таблица 1. Оценка состояния генеративной функции крыс под воздействием препарата «Доксициклин-комплекс»
|
№ |
Опытная группа |
Контрольная группа |
||||
|
Число живых плодов |
Число мёртвых плодов |
Число имплантов |
Число живых плодов |
Число мёртвых плодов |
Число имплантов |
|
|
1 |
11 |
2 |
13 |
10 |
0 |
10 |
|
2 |
10 |
2 |
12 |
11 |
2 |
13 |
|
3 |
11 |
2 |
13 |
11 |
0 |
11 |
|
4 |
11 |
1 |
12 |
10 |
2 |
12 |
|
5 |
9 |
2 |
11 |
11 |
2 |
13 |
|
6 |
11 |
2 |
13 |
12 |
1 |
13 |
|
7 |
10 |
2 |
12 |
13 |
2 |
15 |
|
8 |
9 |
2 |
11 |
13 |
0 |
13 |
|
9 |
12 |
1 |
13 |
14 |
2 |
16 |
|
10 |
11 |
2 |
13 |
14 |
0 |
14 |
|
11 |
11 |
1 |
13 |
12 |
1 |
13 |
|
12 |
9 |
2 |
11 |
13 |
1 |
14 |
|
13 |
10 |
2 |
13 |
12 |
0 |
12 |
|
14 |
9 |
2 |
11 |
14 |
0 |
14 |
|
15 |
12 |
2 |
14 |
12 |
1 |
13 |
|
Среднее на одно животное |
10,4 |
1,8 |
12,3 |
12,13 |
0,93 |
13,07 |
|
Всего |
156 |
27 |
185 |
182 |
14 |
196 |
Внешний осмотр плодов во время вскрытия самок опытной группы, получавшей «Доксициклин-комплекс» в терапевтической дозе, выявил патологии плодов. Наблюдали возникновение разнообразных уродств у 47,4 % плодов. Среди аномалий развития чаще всего наблюдались расщепление верхнего неба, гипоплазия нижней челюсти, гипоплазия и синдактилия конечностей. В контрольной группе данных патологии плодов не обнаружено. Кроме того, у 47,4 % плодов, которым орально вводили «Доксициклин-комплекс», были обнаружены подкожные кровоизлияния, геморрагии в оболочке мозга, скопление крови в серозных полостях (табл. 2).
Таблица 2. Исследование эмбриотоксического действия препарата «Доксициклин-комплекс» на белых крысах при оральном введении
|
Показатели |
Группа |
|
|
контроль |
опыт |
|
|
Количество беременных самок |
15 |
15 |
|
Количество желтых тел |
207 / 13,8 |
197/13,13 |
|
Количество мест имплантации |
196 / 13,07 |
185/12,3 |
|
Количество живых плодов |
182 / 12,13 |
156/10,4 |
|
Количество мертвых плодов |
14/0,9 |
27/1,8 |
|
Предимплантационная гибель, % |
5,31 |
6,09 |
|
Постимплантационная гибель, % Масса плода, г |
7,14 3,8±0,5 |
15,7 2,7±0,2 |
|
Краниокаудальный размер, мм |
3,9±0,23 |
2,6±0,15 |
|
Внешний осмотр плодов: количество обследованных плодов из них с аномалиями развития: абс % |
всего осмотрено 182 плод с внешними аномалиями плодов не обнаружено |
156 74 47,4 |
|
Состояние костной системы: количество обследованных плодов из них с аномалиями развития: |
182 0 0 |
156 74 47,4 |
|
Состояние внутренних органов: количество обследованных плодов из них с аномалиями развития: |
182 6 3,3 |
156 74 47,4 |
Заключение
Комбинированный антибактериальный препарат на основе доксициклина, лактулозы и бромгексина обладает эмбриотоксическими свойствами, что подтверждает постимплантационная гибель плодов (15,7 %) и возникновение уродств у 47,4 % плодов опытной группы. По результатам исследований следует исключить «Доксициклин-комплекс» из числа антибиотиков, назначаемых животным во время беременности и вязки.
Рецензенты:
Калюжный И.И., д.вет.н., профессор кафедры «Терапия, акушерство и фармакология» ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова», г. Саратов.
Домницкий И.Ю., д.вет.н., профессор кафедры "Морфология, патология животных и биология" ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова», г. Саратов.