Введение
Из противоопухолевых средств антрациклиновые антибиотики обладают наиболее выраженной кардиотоксичностью, связанной во многом с генерацией свободных радикалов. В настоящее время лекарственные режимы, используемые в лечении злокачественных опухолей, становятся все более сложными, с комбинацией различных антибластомных агентов, например, антрациклинов и таксанов, проявляющих синергизм в отношении развития кардиотоксических эффектов [8, 9]. Для снижения кардиотоксичности антрациклинов применяют дексразоксан (кардиоксан), однако до сих пор для него не определены четкие показания и схемы назначения [7]. Американское общество клинической онкологии не одобряет регулярного использования дексразоксана при химиотерапии антрациклинами, за исключением ситуаций, когда их кумулятивная доза приближается к 300 мг/м2 или превышает ее [8]. Существенным фактором, сдерживающим применение кардиоксана, является его высокая стоимость.
В условиях злокачественного опухолевого процесса и химиотерапии развивающаяся анемия может усугубить гипоксическое повреждение кардиомиоцитов. Использование методов локальной гипотермии зоны ишемии миокарда повышает ее устойчивость к гипоксии, предотвращая повреждение клеток [5]. В связи с техническими сложностями таких методов широкое распространение в коррекции гипоксических повреждений получило использование антигипоксантов и антиоксидантов.
В эксперименте показано, что производные 3-гидроксипиридина обладают кардиопротекторным действием при развитии доксорубицин-индуцированной кардиотоксичности [4]. Производное пиримидина - ксимедон - обладает антиоксидантным и апоптозрегулирующим действием, противоишемической активностью [2]. Вместе с тем кардиопротекторные свойства ксимедона остаются малоизученными.
Цель исследования - сравнительное изучение влияния производных пиримидина и 3-гидроксипиридина - ксимедона и мексидола, а также их комбинации (в сравнении с кардиоксаном) - на активность антиоксидантных ферментов,содержание тиоловых групп в тканях сердца и морфологические проявления кардиотоксичности доксорубицина и паклитаксела у крыс с карциномой Walker-256.
Материал и методы исследования. Эксперименты выполнены на 100 крысах-самках линии Wistar массой 150-250 г разводки питомника НЦБМТ РАМН «Столбовая». Экспериментальные животные содержались в стандартных условиях вивария Мордовского государственного университета при естественном световом режиме на стандартной диете, свободном доступе к воде и пище. Все манипуляции с животными проводились в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986). Суспензию клеток карциномы WALKER-256 (W-256) (106 клеток в растворе Хенкса) перевивали под кожу хвоста. Животные были распределены на 7 групп. Дизайн исследований представлен в табл. 1.
Т а б л и ц а 1
Дизайн исследований
|
Группы животных |
Режим эксперимента |
|
Интактные животные (n=7) |
Опухолевые клетки W-256 не вводили, лекарственная терапия не проводилась |
|
1-я - опухолевый штамм W-256 (контроль) (n=12) |
1·106 опухолевых клеток W-256под кожу хвоста |
|
2-я - W-256, Доксорубицин - W-256+ДР (n=12) |
1·106 опухолевых клеток W-256, доксорубицинвнутрибрюшинно в дозе 4 мг/кг на 11-е сутки после имплантации опухолевых клеток |
|
3-я - W-256, Доксорубицин, Паклитаксел - W-256+ДР+ПТ (n=14) |
1·106 опухолевых клеток W-256, доксорубицинв дозе 4 мг/кг и паклитаксел в дозе 6 мг/кг внутрибрюшинно на 11-е сутки после имплантации опухолевых клеток |
|
4-я - W-256, Доксорубицин, Паклитаксел, Ксимедон100 мг/кг -W-256+ДР+ПТ+Ксимедон (n=14) |
Так же, как и в 3-й группе, ксимедон внутримышечно в дозе 100 мг/кг ежедневно, начиная с 11-х суток эксперимента, 10 суток |
|
5-я - W-256, Доксорубицин, Паклитаксел, Мексидол 50 мг/кг - W-256+ДР+ПТ+Мексидол (n=14) |
Так же, как и в 3-й группе, мексидол внутримышечно в дозе 50 мг/кг ежедневно, начиная с 11-х суток эксперимента, 10 суток |
|
6-я - W-256, Доксорубицин, Паклитаксел, Кардиоксан80 мг/кг - W-256+ДР+ПТ+Кардиоксан (n=14) |
Так же, как и в 3-й группе, кардиоксанвнутрибрюшинно в дозе 80 мг/кг за 20 мин до введения цитостатиков, на11-е сутки опыта |
|
7-я - W-256, Доксорубицин, Паклитаксел, Мексидол 50 мг/кг, Ксимедон 100 мг/кг -W-256+ДР+ ПТ+Мексидол+Ксимедон (n=14) |
Так же, как и в 3-й группе, мексидол в дозе 50 мг/кг иксимедон в дозе 100 мг/кг ежедневно внутримышечно, начиная с 11-х суток эксперимента, 10 суток |
Исследование проводили на 14-е и 22-е сутки эксперимента. Для этого по 6-7 животных из каждой группы в указанные сроки выводили из опыта под общей анестезией тиопенталом натрия. Для оценки изменений в антиоксидантной системе в гомогенатах сердца определяли активность каталазы [3], супероксиддисмутазы (СОД) [1], содержание общих, белковых и небелковых SH-групп [6]. Гистологическую структуру сердца исследовали на 22-е сутки эксперимента светооптическим методом с предварительной фиксацией кусочков органа в 10% растворе нейтрального формалина и окраской парафиновых срезов гематоксилином и эозином. При статистической обработке результатов исследования определяли показатели средних арифметических значений (М), стандартных ошибок средних арифметических (m). Нормальность распределения проверяли с использованием теста Колмогорова-Смирнова. При условии соответствия нормальности распределения достоверность полученных различий сопоставляемых величин оценивали с использованиемt-критерия Стьюдента. При несоответствии нормальности распределения достоверность различий оценивали с использованием U-критерия Манна-Уитни. Различия считали достоверными при p<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение. При оценке состояния антиоксидантных ферментов выявлено, что в 1-ой группе (контрольной) активность каталазы снижалась лишь к 22-м суткам на 31,2% по сравнению с интактными животными (с 8,3±0,6 до 5,71±0,57 мккат/л (р<0,05), а активность СОД повышалась на 52,5% и 92,5% (р<0,01) на 14-е и 22-е сутки соответственно (с 0,4±0,01 до 0,61±0,06 и 0,77±0,03 у.е./г ткани).
Во 2-ой и 3-ей группах активность каталазы достоверно снижалась уже на 14-е сутки на 36% и 44% соответственно по отношению к интактным животным. Активность СОД при этом не изменялась. Подобные изменения могут свидетельствовать о депрессии ферментативного звена антиоксидантной системы и создании предпосылок для преобладания процессов пероксидации и накопления в сердце прооксидантов. В 5, 6, 7-й группах отмечались адаптивные изменения активности указанных ферментов. Так, активность каталазы достоверно повышалась на 47,8%, 26% и 25% соответственно по отношению к 3-ей группе. Это сопровождалось ростом активности СОД на 15% в 5-ой группе и 25% в группах 6 и7 (р<0,05), по сравнению с интактными животными. На 22-е сутки активность каталазы во всех экспериментальных группах была ниже, чем у интактных животных, и не отличалась от таковой в 3-ей группе (ДР+ПТ). Активность СОД в 3-ей группе повышалась на 57,5% (р<0,05) по отношению к интактным животным. В условиях дефицита каталазы высокая активность СОД может служить причиной развития деструктивных процессов. В 4, 5, 6 и 7-й группах активность СОД повышалась умеренно - на 17,5%, 10%, 15% и 27,5% соответственно по сравнению с интактнымикрысами, и была достоверно ниже, чем в 3-ей группе. Это может быть связано с уменьшением образования субстрата (кислородных радикалов) для СОД.
Содержание общих тиоловых групп в тканях сердца в контрольной группе снижалось как на 14-е, так и на 22-е сутки на 41,5% и 48% соответственно (р<0,001) по отношению к интактным животным(за счет небелковых фракций, табл. 2).
Т а б л и ц а 2
Содержание SH-групп в тканях сердца крыс с карциномой W-256 при введении ксимедона и мексидола на фоне химиотерапии доксорубицином и паклитакселом, (M±m)
|
Группы животных / Сроки исследования |
Показатель |
|||
|
SH-группы общие, мкмоль/мл |
SH-группы белковые, мкмоль/мл |
SH-группы небелковые, мкмоль/мл |
||
|
Интактные |
33,71±2,3 |
19,14±2,3 |
14,57±0,61 |
|
|
1 - W-256 (контроль) |
14-е сутки |
19,71±1,2 р1<0,001 |
14,85±1,3 |
4,86±0,6 р1<0,001 |
|
22-е сутки |
17,5±1,2 р1<0,001 |
13,25±1,9
|
4,25±0,95 р1<0,001 |
|
|
2 - W-256+ДР |
14-е сутки |
25,4±1,3 р1,2<0,05 |
15,2±1,3
|
10,2±0,37 р1,2<0,001 |
|
22-е сутки |
28,2±2,5 р2<0,05 |
17,7±1,3 |
10,5±1,82 р1,2<0,05 |
|
|
3 - W-256+ДР+ПТ |
14-е сутки |
21,29±2,3 р1<0,01 |
9,86±1,6 р1,2,3<0,05 |
11,43±1,25 р1,2<0,05 |
|
22-е сутки |
18,43±1,5 р1,3<0,01 |
12,57±1,5 р1,3<0,05 |
5,86±2,15* р1<0,01 |
|
|
4 - W-256+ДР+ПТ+ ксимедон |
14-е сутки |
23,5±1,3 р1<0,01 |
18,0±1,9 р4<0,01 |
5,5±0,92 р1,3,4<0,01 |
|
22-е сутки |
20,5±0,9 р1,3<0,05 |
15,33±0,95
|
5,17±1,0 р1,3<0,05 |
|
|
5 - W-256+ДР+ПТ+ мексидол |
14-е сутки |
27,17±1,1 р1,2<0,05 |
19,17±1,05 р2,3,4<0,05 |
8,0±0,68 р1,2,3,4<0,05 |
|
22-е сутки |
26,5±0,67 р1,2,4,5<0,05 |
15,33±0,84*
|
11,17±0,94* р1,2,5<0,01 |
|
|
6 - W-256+ДР+ПТ+ кардиоксан |
14-е сутки |
30,66±0,8 р2-6<0,05 |
21,33±2,2 р2,3,4<0,05 |
9,33±1,4 р1,2,5<0,05 |
|
22-е сутки |
21,5±0,7* р1,2,3,6<0,05 |
17,5±0,62 р2,4<0,05 |
4,0±0,77* р1,3,6<0,001 |
|
|
7 - W-256+ДР+ПТ+ ксимедон+мексидол |
14-е сутки |
31,3±1,99 р2-5<0,05 |
15,83±1,5 р4<0,05 |
15,5±1,2 р2-7<0,05 |
|
22-е сутки |
30,33±1,3 р2,4,5,6,7<0,01 |
20,17±0,83 р2,4,5,6,7<0,05 |
10,16±0,65* р1,2,5,7<0,01 |
|
Примечание: р1 - достоверность различий рассчитана по отношению к интактным животным; р2 - к группе 1; р3 - к группе 2; р4 - к группе 3; р5 - к группе 4; р6 - к группе 5; р7 - к группе 6; * - статистически значимые различия в группе на 22-е сутки по отношению к 14-м суткам, р<0,05.
Во 2-ой группе уровень общих SH-групп также снижался за счет небелковых фракций, при этом содержание последних превышало таковое в контрольной группе в 2 и 2,5 раза на 14-е и 22-е сутки соответственно. Подобные изменения на фоне химиотерапии доксорубицином могут быть отражением уменьшения общих нарушений гомеостаза и эндогенной интоксикации, сопровождающих опухолевую прогрессию, в связи с реализацией противоопухолевого эффекта цитостатика. В 3-ей группе содержание общих SH-групп достоверно снижалось на 14-е и 22-е сутки за счет белковых (на 48,5% и 34,3% соответственно) и небелковых фракций (на 21,5% и 60% соответственно по отношению к интактным крысам, табл. 2), что может свидетельствовать об усилении процессов окисления тиоловых групп и снижении защитного потенциала неферментативного звена антиоксидантной системы.
В 4-ой и 5-ой группах содержание общих тиолов снижалось за счет небелковых SH-групп, при этом уровень белковых тиолов не отличался от такового у интактных животных. В 6-ой группе на 14-е сутки эксперимента содержание общих и белковых SH-групп увеличивалось в 1,44 и 2,2 раза соответственно по отношению к 3-ей группе (р<0,05), однако к 22-м суткам наблюдалась отрицательная динамика: уровень общих SH-групп не отличался от такового в 3-ей группе за счет прогрессирующего снижения содержания небелковых тиолов (табл. 2). В 7-ой группе концентрация общих SH-групп достоверно превышала таковую в 3-ей группе как на 14-е, так и 22-е сутки наблюдения - в 1,5 и 1,6 раза соответственно, не отличаясь от показателя интактных животных. Содержание белковых тиолов также не отличалось от такового у интактных крыс. Уровень небелковых SH-групп на 14-е сутки превышал таковой в 3-ей группе в 1,36 раза (р<0,05), не отличаясь от исходного показателя, однако к 22-м суткам снижался на 30% по отношению к интактным крысам.
При гистологическом исследовании сердца выявлено, что у животных 1-ой группы мышечные волокна местами истончены и перерастянуты. Ядра кардиомиоцитов несколько увеличены в размерах по сравнению с животными интактной группы и окружены участками неоднородной, зернистой саркоплазмы. Межмышечная соединительная ткань умеренно отечная. У крыс во 2-ой группе мышечные волокна неоднородны, местами истончены и перерастянуты, местами - утолщены, поперечно-полосатая исчерченность в основном сохранена. Ядра кардиомиоцитов увеличены в размерах по сравнению с животными 1-ой группы и окружены участками неоднородной, зернистой саркоплазмы. Встречались единичные, мелкие очаги фрагментации мышечных волокон, явления периваскулярного кардиосклероза.
В миокарде животных 3-ей группы, по сравнению со 2-ой, местами субэндокардиальноотмечался слабовыраженный гиалиноз стенок артериол. Мышечные волокна неоднородные, с нечеткими границами, бесструктурные. Ядра кардиомиоцитов деформированы, с неровными контурами и разными размерами. Отмечались явления кариопикноза, в меньшей степени - кариорексиса. Саркоплазма с явлениями набухания, частичного расплавления, местами оптически пустая. Встречались множественные крупные очаги фрагментации мышечных волокон, явления периваскулярного кардиосклероза. Межмышечная соединительная ткань умеренно отечная.
У животных в 4-ой и 5-ой группах мышечные волокна с сохраненной структурой, несколько утолщены за счет набухания саркоплазмы, поперечно-полосатая исчерченность в основном сохранена, местами слабо выражена. Ядра кардиомиоцитов средних размеров. Явлений кариопикноза и кариорексиса, фрагментации мышечных волокон не отмечалось. Саркоплазма с явлениями некоторого набухания и слабой зернистостью. Местами -умеренный отек межмышечной соединительной ткани.
В 6-ой группе мышечные волокна с сохранной структурой, местами истончены и перерастянуты, в отдельных участках с явлениями миоцитолиза. Явления кариопикноза и кариорексиса отсутствовали. Саркоплазма со слабой зернистостью, в отдельных участках с явлениями расплавления. Встречались единичные, мелкие очаги фрагментации мышечных волокон. Межмышечная соединительная ткань местами умеренно отечная. Отмечались явления слабого периваскулярного кардиосклероза.
У животных 7-ой группымышечные волокна не изменены, местами несколько утолщены, поперечно-полосатая исчерченность сохранена. Явлений кариопикноза и кариорексиса, фрагментации мышечных волокон, отека межмышечной соединительной ткани не отмечалось. Явления кардиосклероза отсутствовали.
Заключение. Таким образом, мексидол и кардиоксан в сопоставимой степени повышают защитный потенциал ферментативного и неферментативного (тиолового) антиоксидантных звеньев в сердце на 14-е сутки эксперимента. Однако на 22-е сутки опыта только в группе с ксимедоном отмечается тенденция к формированию более выгодного баланса между активностью каталазы и супероксиддисмутазы, а мексидол эффективнее ксимедона и кардиоксана корригирует состояние неферментативного звена антиоксидантной защиты сердца, увеличивая восстановительный потенциал клетки. Сочетанное применение ксимедона и мексидола повышает защитный потенциал неферментативного антиоксидантного звена и препятствует развитию негативных морфологических изменений в сердце более эффективно, чем использование их по отдельности иликардиоксана.
Рецензенты:
Моисеева И.Я., д.м.н., профессор, зав. кафедрой «Общая и клиническая фармакология», Медицинский институт, ФГБОУ ВПО «Пензенский государственный университет», г. Пенза.
Блинов Д.С., д.м.н., профессор, зав. кафедрой общественного здоровья, организации здравоохранения и фармации с курсом гигиены, Медицинский институт, ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева», г. Саранск.